专利名称：血管紧张素转化酶抑制肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有血管紧张素转化酶(在下文中也称为ACE)抑制活性的肽。更具体地，本发明涉及具有ACE抑制活性的肽，当其作为降血压剂用于药用组合物以及用作患有高血压的人用特别用途食品、营养食品、功能性食品、特定保健用食品、标榜有降血压作用的食品和饮品等时，其广泛地适用于抑制血压上升以及适用于预防高血压等。
背景技术：
ACE为在血压和体液量调节中起重要作用的蛋白水解酶，并且在控制血压上升的凝乳酶-血管紧张素系统中具有将血管紧张素I转化为具有强的高血压活性的血管紧张素II的活性。已经对这种酶的抑制剂进行了多种研究，并且已知它们具有降低血压的活性(D.W.Cushman等人，Biochemical Pharmacology，Vol.20，第1637-1648页(1971)；Robert J.L.等人，The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，Vol.204，第281-288页(1977))。关于ACE抑制剂，已经研究了多种药剂，并且有多种为市售的(Yoshihiro Kaneko等人，“Igaku no Ayumi”(Progressin Medical Science)，vol.122，第62-85页，1972；Toshio Hisayoshi等人″Hitome de Wakaru Koketsuatsu″(Hypertension Recognizable at a Glance)，2nd edition，第54-55页，1998；Noboru Toda等人，“JyunkankeiChiryoyaku no Sayo Mekanizumu”(Action Mechanism of Circulatingsystem Therapeutic Agents)，第260-265页，1998)。另外，已经从酪蛋白和多种食品如明胶、沙丁鱼和鲣中发现能够抑制ACE的肽。例如，酪蛋白由来的肽VPP(Val-Pro-Pro，IC509μM)、酪蛋白由来的肽IPP(Ile-Pro-Pro，IC505μM)、和酪蛋白由来的肽VAP(Val-Ala-Pro，IC502μM)、和玉米蛋白α-玉米醇溶蛋白由来的LQP(Leu-Gln-Pro，IC502μM)为已知的(Yasunori Nakamura等人，Journal of Dairy Science，Vol.78，第777-783页(1995)；Shinsuke Miyoshi等人，Agricultural and BiologicalChemistry，Vol.55(5)，第1313-1318页(1991)；Susumu Maruyama等人，Agricultural and Biological Chemistry，Vol.51(6)，第1581-1586页(1987))。
发明内容
如上所述，考虑到其中已经广泛地对ACE抑制剂进行研究和开发的现有技术状况，本发明的发明人努力开发一种全新的并且有效的ACE抑制剂。
为了实现上述目的，本发明人从不同的观点进行研究，结果，着眼于肽而合成了大量的肽，特别是寡肽，然后对如此得到的肽进行筛选。结果，发现了具有优异的ACE抑制活性的肽，并且体外试验的结果确认了这些肽可用作降血压剂，从而完成了本发明。
本发明涉及以下的第(1)到(9)项(1)包括由SEQ ID NO1表示的氨基酸序列的肽；或包括其中将一个或多个氨基酸加入到由SEQ ID NO1表示的氨基酸序列中的氨基酸序列并且具有血管紧张素转化酶抑制活性的肽。
(2)包括由SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的肽；或包括其中将一个或多个氨基酸加入到由SEQ ID NO2表示的氨基酸序列中的氨基酸序列并且具有血管紧张素转化酶抑制活性的肽。
(3)包括由SEQ ID NO3表示的氨基酸序列的肽；或包括其中将一个或多个氨基酸加入到由SEQ ID NO3表示的氨基酸序列中的氨基酸序列并且具有血管紧张素转化酶抑制活性的肽。
(4)血管紧张素转化酶抑制剂，其包括第(1)到(3)中任一项的肽作为活性成分。
(5)包括第(1)到(3)中任一项的肽的食品或饮品。
(6)包括第(1)到(3)中任一项的肽作为活性成分的药用组合物。
(7)权利要求(6)的药用组合物，其为用于预防和/或治疗由血管紧张素转化酶异常引起的疾病的药剂。
(8)第(1)到(3)中任一项的肽在生产血管紧张素转化酶抑制剂中的应用。
(9)第(1)到(3)中任一项的肽在生产用于预防和/或治疗由血管紧张素转化酶异常引起的疾病的药剂中的应用。
图1表示乳酪由来肽的HPLC色谱图。
具体实施例方式
本发明的肽的具体例子包括以下(a)到(f)的肽(a)包括由SEQ ID NO1表示的氨基酸序列的肽；(b)包括由SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的肽；(c)包括由SEQ ID NO3表示的氨基酸序列的肽；(d)包括其中将一个或多个氨基酸加入到由SEQ ID NO1表示的氨基酸序列中的氨基酸序列并且具有ACE抑制活性的肽；(e)包括其中将一个或多个氨基酸加入到由SEQ ID NO2表示的氨基酸序列中的氨基酸序列并且具有ACE抑制活性的肽；和(f)包括其中将一个或多个氨基酸加入到SEQ ID NO3表示的氨基酸序列中的氨基酸序列并且还具有ACE抑制活性的肽。
在下文中，包括由SEQ ID NO1表示的氨基酸序列(Met-Ala-Pro)的肽、包括由SEQ ID NO2表示的氨基酸序列(Ile-His-Ala)的肽、和包括由SEQ ID NO3表示的氨基酸序列(Ile-Gln-Ala)的肽还分别称为MAP、IHA和IQA。
关于包括其中将一个或多个氨基酸加入到由SEQ ID NO1到3表示的氨基酸序列中的氨基酸序列并且还具有ACE抑制活性的肽，对于被加入的氨基酸没有具体限制，可以使用任选的氨基酸，只要得到的肽具有ACE抑制活性。对于要加入的氨基酸的数目没有具体限制，可以使用任选数目的氨基酸，只要得到的肽具有ACE抑制活性。然而，通常，加入的氨基酸的数目为1到10，优选为1到5，更优选为1到3，更优选为1或2，特别优选为1。
具体例子包括以下的肽包括由SEQ ID NO4表示的氨基酸序列(Leu-Met-Ala-Pro)的肽、包括由SEQ ID NO5表示的氨基酸序列(Arg-Met-Ala-Pro)的肽、包括由SEQ ID NO6表示的氨基酸序列(Met-Ala-Pro-Pro)的肽、包括由SEQ ID NO7表示的氨基酸序列(Arg-Met-Ala-Pro-Pro)的肽、等等。
本发明的肽可为向其加入工业用盐如盐酸盐、乙酸盐、硫酸盐、琥珀酸盐或酒石酸盐的那些，但是优选加入可食用的或可药用的盐。
本发明的肽可单独使用和作为两种或多种肽的混合物使用。
本发明的肽可通过常规的肽合成法生产，或者，它们可通过乳蛋白如酪蛋白的酶促水解或化学水解制备。此外，可采用微生物发酵。
本发明的ACE抑制剂包含本发明的肽，并且可以不同的形式被使用，如食品和饮品、特定保健用食品、营养功能性食品、特别用途食品、健康食品、准药物(quasi-drug)、药用组合物等。例如，其可作为药用组合物或准药物直接给用，或作为如健康食品和特定保健用食品的特别用途食品、或营养功能性食品直接摄取；或者通过预先将其加入到各种食品中而被摄取，各种食品如牛乳、软饮品、发酵乳、酸乳、乳酪、面包、小点心、脆饼、和比萨片。
为了生产上述食品，可以将水、蛋白质、糖类、脂类、维生素类、矿物质类、有机酸、果汁、香料等作为主要成分合并。例子包括动植物性蛋白如全脂奶粉、脱脂奶粉、部分脱脂奶粉、乳清粉、乳清蛋白、乳清蛋白浓缩物、乳清蛋白分离物、α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、乳铁蛋白、大豆蛋白、卵蛋白、肉蛋白及其水解物；多种乳由来成分，如黄油、乳清矿物质、奶油、乳清、乳清矿物质、非蛋白氮、唾液酸、磷脂和乳糖；碳水化合物，如蔗糖、葡萄糖、果糖、糖醇类、麦芽糖、低聚糖类、改性淀粉(糊精以及可溶性淀粉、British淀粉、氧化淀粉、淀粉酯、淀粉醚等)和食用纤维；动物性油脂，如猪油和鱼油；植物性油脂，如棕榈油、红花油、玉米油、菜籽油、椰子油及其分馏油(fractional oil)包括氢化油、酯交换油等；多种维生素，如维生素A、维生素B类、维生素C、维生素D类、维生素E、维生素K类、维生素P、维生素Q、尼克酸(niacin)、烟酸(nicotinic acid)、泛酸、生物素、肌醇、胆碱、叶酸；矿物质如钙、钾、镁、钠、氯、铜、铁、锰、锌、硒、氟、硅、碘；和有机酸和有机酸盐，如苹果酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸等；并且可任选地选择和加入其中的-种或两种或多种。如有需要，除了合成产品之外，还优选将它们作为含有大量它们的食品加入。
当本发明的产品用作药用组合物或准药物时，它们可作为多种盐给药。例如可将其作为与盐酸、乙酸、甲酸等的盐给药。给药方法包括经口给药、经皮给药、经肠给药、经血管给药、静脉内注射、肌肉内注射、滴鼻剂、滴眼剂、吸入、直肠给药等。另外，它们可以不同的形式给药。例如，可以片剂、锭剂、胶囊、颗粒、粉末、糖浆、悬浮液、溶液等形式给药。这些不同的药剂可以根据常用方法使用通常用于药剂生产技术领域的常规助剂制备，常规助剂如填料、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、增溶剂、助悬剂和具有基本试剂的包衣剂。
因为本发明的肽具有ACE抑制活性，它们可用于预防和/或治疗与凝乳酶-血管紧张素系统、奎宁-激肽释放酶系统等中的与ACE有关的疾病。与ACE有关的疾病包括高血压、动脉硬化、血管肥厚、心肌梗塞、心力衰竭、心脏肥大、肾机能不全、糖尿病等。
本发明的活性成分表现出优异的安全性，因为其完全没有毒性或具有极小毒性，并且在将其以每天500mg的剂量对小鼠经口给药时，发现根本没有急性毒性。因此，当将其以食品或饮品形式使用时，在其用于预防、保健和饮食品的每种情况中，对于活性成分的使用量都没有限制，并且当将其用作药物时，可根据每名患者而定在上述范围内选择性地使用本发明的活性成分。例如，在经口摄取的情况中，本发明活性成分的使用量随症状、年龄、体重、给药方法、剂型等的不同而不同，但是通常，其以每名成人约0.1mg到1,500mg的量给药，一天一次或一天数次将日剂量分开给用。另外，因为活性成分即使在大量摄取时也不表现出特别的急性毒性，可任选地以超过上述范围的较大量使用。
以下通过参考MAP作为本发明的肽的例子描述本发明肽的生产方法。也可同样地生产IRA、IQA、和包含这些肽作为部分肽的其它的肽。
1.MAP的制备方法优选通过以下方法制备MAP。
在以下制备方法中，使用包含MAP作为其部分结构的底物和能够从底物切断MAP的酶的组合。关于底物，优选使用β-酪蛋白，但是也可使用动植物性蛋白，如乳、乳由来成分、全脂奶粉、脱脂奶粉、部分脱脂奶粉、酪蛋白、大豆蛋白、卵蛋白、肉蛋白、豆类或小麦、或其水解物。β-酪蛋白富含脯氨酸，脯氨酸占其序列的约17％。另外，因为在乳酪蛋白胶束中包含33.6％的β-酪蛋白，可从中大量制备β-酪蛋白。
将底物溶解于水中，浓度为0.1到70重量％，优选为0.1到60重量％，更优选为0.3到50重量％。向其中加入基于底物蛋白含量为0.1到10重量％、优选0.3到2重量％的蛋白酶N“Amano”G(由Amano Enzyme Inc.生产)，然后使用有机酸或无机酸如柠檬酸溶液、乳酸、或盐酸将其pH调节到4.5到6.0，优选4.5到5.0，随后在15到50℃、优选在20到40℃、更优选在30到40℃下搅拌，从而引起降解。在降解40到50小时之后，向其中加入基于底物蛋白含量分别为0.01到10重量％、优选0.1到5重量％的每种Umamizyme G(由Amano Enzyme Inc.生产)和Flavourzyme(由Novozymes Corporation生产)，然后将其pH调节到3.5到5.0，优选3.5到4.0。在搅拌下在15到50℃、优选20到40℃、更优选30到40℃继续降解5到10天。通过在50到110℃、优选60到100℃、更优选80到100℃热处理10到20分钟使酶失活，然后将其pH调节到4.5到6.0，优选4.5到5.0。
2.确认MAP生成的方法对于确认MAP生成的方法，通过LC-MS分析酶消解样品的水溶性部分和MAP标准样品中的每一个，并且通过有或没有与MAP标准样品相同的MAP保留时间峰来判断MAP的生成。将上述1中制备的酶消解样品在4℃和10,000g下离心40分钟，回收水溶性部分并进一步冷冻干燥。将每个冷冻干燥样品再以100μg/ml的浓度溶解于以下流动相中，并注射其5μl部分。将MAP标准样品以5μg/ml的浓度溶解于以下流动相中并注射其5μl的部分。当MAP标准样品在以下分析条件下进行分析时，在约17分钟的保留时间观察到MAP的峰。通过在相同分析条件下分析酶消解样品的水溶性部分，在约17分钟观察到峰的样品被判断为是“MAP-阳性的”，没有观察到该峰的样品被判断为是“MAP-阴性的”。
柱CAPCEL PAK C18 MG(φ2.0×250mm，由SHISEIDO CO.，LTD.生产)流动相包含0.05％甲酸的4％乙腈溶液流速0.17ml/min柱温40℃检测器ESI(+)分子量318参考实施例进一步详细地描述本发明，但是本发明不受其限制。
实施例1
将100g份的Denmark脱脂乳酪(用绞肉机粉碎)与50g的无菌水混合，然后加入18g的起动细菌(3种，包括Lactococcus lactis subsp.Lactis、Lactococcus cremoris和Lactococcus diacetylactis)和0.34g的氯化钠，随后进行搅拌。随后向其中加入0.6g的蛋白酶N“Amano”G(由AmanoEnzyme Inc.生产)，并将混合物在34℃下振摇，从而进行降解。四十八小时之后，用柠檬酸调节其PH到4.1，并且向其中加入各自为0.3g的Umamizyme G(由Amano Enzyme Inc.生产)和Flavourzyme(由NovozymesCorporation生产)，随后在34℃振摇，从而进行降解。六天之后，调节其pH到7.0并且随后加入无菌水，使总量为200g。通过在110℃加热15分钟使酶失活。通过离心除去不溶性物质，然后将肽通过HPLC纯化。使用YMC-Pack R&D ODS柱(由YMC Corporation生产，20×250mm)，通过从0.1％三氟乙酸水溶液到含有0.1％三氟乙酸的70％乙腈水溶液的线性梯度进行洗脱(50min)(流速7.5ml/min，检测波长214nm，柱温40℃)。HPLC色谱图如图1中所示。将从27到31分钟洗脱下来的级分D分级，然后通过同样的柱色谱法纯化，从而分离具有Met-Ala-Pro、Ile-His-Ala和Ile-Gln-Ala序列的三肽。
实施例2使用肽自动合成仪合成SEQ ID NO1到7的每种肽。通过反相HPLC确认如此得到的每种肽的纯度为95％。将这些合成肽的每一种都溶解于0.1M硼酸盐缓冲液(pH 8.3)中。随后，与0.1ml的酶溶液(血管紧张素转化酶2单位/ml)和0.04ml的每种样品溶液混合，随后加热到37℃。向其中加入0.1ml份的底物溶液(马尿酰基-His-Leu、N-苯甲酰基-Gly-His-Leu)，随后充分搅拌。在使混合物在37℃反应60分钟之后，通过加入0.13ml的1N盐酸终止反应。然后，向其中加入0.85ml的乙酸乙酯，随后振摇1分钟，然后将混合物在3,000rpm下离心10分钟。回收0.7ml份的上清液，并使用离心蒸发器除去溶剂(约30分钟)。通过加入0.5ml的蒸馏水将残余物溶解，并测量在228nm波长的吸光度。
通过以下数学式1计算ACE抑制活性(％)。
数学式1ACE抑制活性(％)＝{(A-B)-(C-D)}/(A-B)×100在这方面，数学式中的A为使用酶时对照的吸光度，B为没有使用酶时对照的吸光度，C为使用酶时样品的吸光度，和D为没有使用酶时样品的吸光度。另外，在对照中使用0.1M的硼酸盐缓冲液代替样品溶液。
根据如此得到的ACE抑制活性，计算每种肽的IC50。结果如以下表中所示。
表1
从上述结果显而易见，确认了三种肽中的每一种都发挥高的ACE抑制活性。其中，肽MAP(Met-Ala-Pro)发挥特别高的抑制活性。
实施例3以与实施例2相同的方法得到4种肽Leu-Met-Ala-Pro、Arg-Met-Ala-Pro、Met-Ala-Pro-Pro和Arg-Met-Ala-Pro-Pro(它们具有Met-Ala-Pro作为部分结构)的ACE抑制活性(％)并且计算它们的IC50。
结果如表2中所示。
表2
从上述结果发现，具有肽MAP作为部分结构的每一种肽都发挥高的ACE抑制活性。
虽然已经参考具体的实施方案详细描述了本发明，但对于本领域技术人员来说，显而易见可对其进行多种改变和改进而不脱离其精神实质和范围。
本申请基于2003年12月1日提交的日本专利申请2003-401405，其全部内容被并入本文作为参考。
工业实用性因为本发明的肽具有显著高的ACE抑制活性，它们可以在小剂量下发挥抑制血压上升的作用，因此它们不仅可用作抑制血压上升的预防或治疗剂，而且还可用作用于抑制血压上升的预防或治疗用食品和饮品，它们不表现出令人不快的味道如强烈的苦味。
序列表自由原文SEQ ID NO1-人工序列的说明合成肽SEQ ID NO2-人工序列的说明合成肽SEQ ID NO3-人工序列的说明合成肽SEQ ID NO4-人工序列的说明合成肽SEQ ID NO5-人工序列的说明合成肽SEQ ID NO6-人工序列的说明合成肽SEQ ID NO7-人工序列的说明合成肽序列表<110>明治乳业株式会社(Meiji Dairies Corporation)<120>血管紧张素转化酶抑制肽(Angiotensin Converting Enzyme InhibitoryPeptides)<130>SCT062484-65<150>JP2003-401405<151>2003-12-01<160>7<210>1<211>3<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial SequenceSynthetic Peptide<400>1Met Ala Pro1<210>2<211>3<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial SequenceSynthetic Peptide<400>2Ile His Ala1
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<223>Description of Artificial SequenceSynthetic Peptide<400>3Ile Gln Ala1<210>4<211>4<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial SequenceSynthetic Peptide<400>4Leu Met Ala Pro1<210>5<211>4<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
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<223>Description of Artificial SequenceSynthetic Peptide<400>6Met Ala Pro Pro1<210>7<211>5<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial SequenceSynthetic Peptide<400>7Arg Met Ala Pro Pro权利要求
1.包括由SEQ ID NO1表示的氨基酸序列的肽；或包括其中将一个或多个氨基酸加入到由SEQ ID NO1表示的氨基酸序列中的氨基酸序列并且具有血管紧张素转化酶抑制活性的肽。
2.包括由SEQ ID NO2表示的氨基酸序列的肽；或包括其中将一个或多个氨基酸加入到由SEQ ID NO2表示的氨基酸序列中的氨基酸序列并且具有血管紧张素转化酶抑制活性的肽。
3.包括由SEQ ID NO3表示的氨基酸序列的肽；或包括其中将一个或多个氨基酸加入到由SEQ ID NO3表示的氨基酸序列中的氨基酸序列并且具有血管紧张素转化酶抑制活性的肽。
4.血管紧张素转化酶抑制剂，其包括权利要求1到3中任一项的肽作为活性成分。
5.包括权利要求1到3中任一项的肽的食品或饮品。
6.包括权利要求1到3中任一项的肽作为活性成分的药用组合物。
7.权利要求6的药用组合物，其为用于预防和/或治疗由血管紧张素转化酶异常引起的疾病的药剂。
8.权利要求1到3中任一项的肽在生产血管紧张素转化酶抑制剂中的应用。
9.权利要求1到3中任一项的肽在生产用于预防和/或治疗由血管紧张素转化酶异常引起的疾病的药剂中的应用。
全文摘要
本发明提供具有血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性的肽，和包含所述肽的食品和饮品和/或药物。
文档编号A61P9/12GK1894273SQ20048003566
公开日2007年1月10日 申请日期2004年12月1日 优先权日2003年12月1日
发明者殿内秀和, 铃木匡之, 内田胜幸, 小田宗宏 申请人:明治乳业株式会社