专利名称：精确测定血管紧张素转化酶体外抑制活性的方法
技术领域：
本发明属 于功能食品的检测方法领域。
背景技术：
血管紧张素转化酶是人体血压调节的关键酶，抑制其活性是实现血压调节的手段之一。以血管紧张素转化酶体外抑制活性为评价指标，寻找、筛选具有血管紧张素转化酶抑制活性的产物(如生物活性肽)是开发调节血压的药物和功能食品的基础工作。已有方法中紫外可见分光光度法中的乙酸乙酯的残留、底物(肽类)的干扰，通常会导致分析结果偏低；二元梯度洗脱高效液相色谱法，未考虑底物对测定结果的影响，也会导致分析结果偏低；高效液相色谱和质谱联用法设备投资大，维护和分析成本高，不便普及使用。
发明内容
本发明目的在于提出一种准确、方便测定血管紧张素转化酶体外抑制活性的方法。本发明的技术方案是在相同的色谱条件下分析，分别测定抑制剂不存在的条件下血管紧张素转化酶与马尿酰组胺酰亮氨酸反应的混合物中马尿酸的峰面积A、抑制剂存在的条件下血管紧张素转化酶与马尿酰组胺酰亮氨酸反应的混合物中马尿酸的峰面积B 和抑制剂存在、且不添加血管紧张素转化酶的条件下在马尿酸出峰位置相关肽的峰面积C ； 然后按(A- (B-C))/A X 100%公式计算，取得血管紧张素转化酶体外抑制活性的抑制率。本发明针对紫外可见分光光度法和二元梯度洗脱高效液相色谱法在分析精准度上的不足，提出一种采用等梯度洗脱高效液相色谱法，扣除抑制剂本身的背景后，建立一种分析时间短、成本低、结果精确的血管紧张素转化酶体外抑制活性测定方法。本发明操作过程简单、方便，对比紫外可见分光光度法测定结果的准确性提高20 50%，对比二元梯度洗脱高效液相色谱法测定结果的准确性提高2 20%。本发明所述测定马尿酸的峰面积A时的反应混合物的配置方法是
取10-50 μ L的血管紧张素转化酶溶液和50-200 μ LHEPES缓冲液混合置于37°C下水浴 5min，然后于同一温度下加入80 μ L的马尿酰组胺酰亮氨酸溶液水浴反应30min，最后在混合体系中加入200-800 μ L HCl终止反应，样品经孔径为0. 22 μ m的针式滤器过滤后进样。本发明所述测定抑制剂马尿酸的峰面积B时的反应混合物的配置方法是
取10-50 μ L的血管紧张素转化酶溶液和50-200 μ L抑制物样品混合置于37°C下水浴 5min，然后于同一温度下加入80 μ L的马尿酰组胺酰亮氨酸溶液水浴反应30min，最后在混合体系中加入200-800 μ L HCl终止反应，样品经孔径为0. 22 μ m的针式滤器过滤后进样。本发明所述测定相关肽的峰面积C的反应混合物的配置方法是
取90-130 μ L的HEPES缓冲液和50-200 μ L抑制物样品混合置于37°C下水浴35min， 然后在混合体系中加入200-800 μ L HCl，样品经孔径为0. 22 μ m的针式滤器过滤后进样。
图1为马尿酸标准样色谱图。图2为测定马尿酸的峰面积A时的反应混合物的色谱图。图3为测定抑制剂马尿酸的峰面积B时的反应混合物的色谱图。图4为测定相关肽的峰面积C的反应混合物的色谱图。
具体实施例方式一、试剂配制
l、50mmol/L HEPES (4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲液
称量HEPES 1. 1915g，溶解于超纯水中，用lmol/L氢氧化钠溶液调节pH至8. 3，定容至 100ml。2,0. lU/ml血管紧张素转化酶溶液
取0.1 U的血管紧张素转化酶固体溶解于Iml 50mmol/L HEPES缓冲液中，另外加入氯化钠 0. 0175g。3、2. 5mmol/L马尿酰组胺酰亮氨酸溶液
称取马尿酰组胺酰亮氨酸0. 1074g，溶解于50mmol/L HEPES缓冲液中，定容至100ml。4、抑制物样品溶液
称取0. 005g的抑制物冻干粉，溶解于50mmol/L HEPES缓冲液中，定容至100ml。5、lmol/L 盐酸
取浓盐酸8. 35ml，用超纯水定容至100ml。二、色谱条件
Intertsil 0DS-SP柱(4. 6 X 250mm，5 μ m)；流动相50%甲醇(甲醇/超纯水体积比， 1:1)，其中包含体积百分含量为0. 1%的三氟乙酸(TFA)，流速lmL/min，检测波长228nm， 柱温25°C ；检测时间20min ；进样量10μ L ；定量方法外标法。三、精确测定血管紧张素转化酶体外抑制活性的操作过程 实施例1 以小黄鱼酶解液为抑制剂
将小黄鱼去头、内脏，然后经绞成肉泥、溶解、加酶、恒温酶解、灭酶(沸水浴，IOmin)、 离心(10000r/min,4°C，30min)处理，取得上清，再经旋转蒸发浓缩、冷冻干燥，制成抑制剂冻干粉。1、抑制剂不存在的条件下，血管紧张素转化酶与马尿酰组胺酰亮氨酸反应的混合物马尿酸的峰面积A的测定
取0. lU/mL的血管紧张素转化酶溶液和50 μ L HEPES缓冲液混合置于37°C下水浴 5min，然后于同一温度下加入80 μ L的马尿酰组胺酰亮氨酸溶液水浴反应30min，最后在混合体系中加入200yL HCl (lmol/L)终止反应，样品经孔径为0. 22 μ m的滤膜过滤后进样。 经色谱测定，取得马尿酸的峰面积A。 2、抑制剂存在的条件下，血管紧张素转化酶与马尿酰组胺酰亮氨酸反应的混合物中马尿酸的峰面积B的测定
取0. lU/mL的血管紧张素转化酶溶液和50 μ L小黄鱼酶解样品(0. 05g/L)混合置于37°C下水浴5min，然后于同一温度下加入80 μ L的马尿酰组胺酰亮氨酸溶液水浴反应30min，最后在混合体系中加入200 μ L HCl (lmol/L)终止反应，样品经孔径为0. 22 μ m的滤膜过滤后进样。经色谱测定，取得马尿酸的峰面积B。3、抑制剂存在，且不添加血管紧张素转化酶的条件下，在马尿酸出峰位置相关肽的峰面积C的测定
取90 μ LHEPES缓冲液和50 μ L小黄鱼酶解样品(0. 05g/L)混合置于37 °C下水浴 35min,然后在混合体系中加入200 μ L HCl，样品经孔径为0. 22 μ m的针式滤器过滤后进样。经色谱测定，取得相关肽的峰面积C。4、计算小黄鱼酶解液抑制剂的抑制率I : 将以上取得的各值分别带入本发明公式 抑制率 I (%)= (A- (B-C)) /A X 100% 将以上取得的各值分别带入原方法公式 抑制率 I ‘ (%) = (A-B) /A X 100%
可分别计算得到不同的抑制率I、I'。选取10个不同的小黄鱼酶解液样品，抑制剂在228nm波长下的光吸收对于测定结果影响程度平均为16. 73%。
权利要求
1.精确测定血管紧张素转化酶体外抑制活性的方法，其特征在于在相同的色谱条件下分析，分别测定抑制剂不存在的条件下血管紧张素转化酶与马尿酰组胺酰亮氨酸反应的混合物中马尿酸的峰面积A、抑制剂存在的条件下血管紧张素转化酶与马尿酰组胺酰亮氨酸反应的混合物中马尿酸的峰面积B和抑制剂存在、且不添加血管紧张素转化酶的条件下在马尿酸出峰位置相关肽的峰面积C;然后按(A- (B-C /A X 100%公式计算，取得血管紧张素转化酶体外抑制活性的抑制率。
2.根据权利要求1所述精确测定血管紧张素转化酶体外抑制活性的方法，其特征在于所述测定马尿酸的峰面积A时的反应混合物的配置方法是取10-50 μ L的血管紧张素转化酶溶液和50-200 μ L HEPES缓冲液混合置于37°C下水浴5min，然后于同一温度下加入80 μ L的马尿酰组胺酰亮氨酸溶液水浴反应30min，最后在混合体系中加入200-800 μ L HCl终止反应，样品经孔径为0. 22 μ m的针式滤器过滤后进样。
3.根据权利要求1所述精确测定血管紧张素转化酶体外抑制活性的方法，其特征在于所述测定抑制剂马尿酸的峰面积B时的反应混合物的配置方法是取10-50 μ L的血管紧张素转化酶溶液和50-200 μ L抑制物样品混合置于37°C下水浴 5min，然后于同一温度下加入80 μ L的马尿酰组胺酰亮氨酸溶液水浴反应30min，最后在混合体系中加入200-800 μ L HCl终止反应，样品经孔径为0. 22 μ m的针式滤器过滤后进样。
4.根据权利要求1所述精确测定血管紧张素转化酶体外抑制活性的方法，其特征在于所述测定相关肽的峰面积C的反应混合物的配置方法是取90-130 μ L的HEPES缓冲液和50-200 μ L抑制物样品混合置于37°C下水浴!35min， 然后在混合体系中加入200-800 μ L HC1，样品经孔径为0. 22 μ m的针式滤器过滤后进样。
全文摘要
精确测定血管紧张素转化酶体外抑制活性的方法，属于功能食品的检测方法领域。针对紫外可见分光光度法和二元梯度洗脱高效液相色谱法在分析精准度上的不足，提出一种采用等梯度洗脱高效液相色谱法，扣除抑制剂本身的背景后，建立一种分析时间短、成本低、结果精确的血管紧张素转化酶体外抑制活性测定方法。本发明操作过程简单、方便，对比紫外可见分光光度法测定结果的准确性提高20～50%，对比二元梯度洗脱高效液相色谱法测定结果的准确性提高2～20%。
文档编号G01N30/14GK102288711SQ201110121600
公开日2011年12月21日 申请日期2011年5月12日 优先权日2011年5月12日
发明者何佳易, 刘国艳, 徐鑫, 王之颖, 蔡丽丽, 魏晓蕊 申请人:扬州大学