基于微球的杯式时间分辨荧光bnp分析方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于微球的杯式时间分辨荧光BNP分析方法及试剂盒；包括在检测反应杯内表面包被BNP单抗或多抗；将时间分辨荧光微球与BNP单抗或多抗共价键交联制备得到荧光标记抗体；将待测BNP样品加入包被后的检测反应杯内，再加入所述荧光标记抗体，25℃～40℃温育；清洗去除未结合的抗原及荧光标记抗体，在340～380nm激发光激发下，测试检测反应杯中荧光信号；将所述荧光信号与标准曲线比对，获得所述待测BNP样品的BNP浓度。本发明可以在较短的检测时间内完成检测，缩短了检测时间，并有效的提高了检测灵敏度。
【专利说明】
基于微球的杯式时间分辨焚光BNP分析方法及试剂盒
技术领域
[0001 ]本发明涉及BNP检测技术领域，具体涉及一种基于微球的杯式时间分辨荧光BNP分 析方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 心力衰竭(Heart Failure)是一种由于心脏功能障碍而产生的体征和症状的临床 综合征。虽然现在的一些药物如血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂、受体阻断剂等可以明显 改善患者的生存质量，延缓病情的恶化，但除非进行心脏移植，否则心力衰竭是无法治愈 的。心力衰竭早期的诊断和避免病情的恶化是当今医疗保健面临的关键问题，越早开始治 疗，对病人就越有益。
[0003] 然而，心力衰竭(尤其是在心衰早期）是很难确诊的。心衰的典型症状，如呼吸急 促、踝关节肿胀、疲劳等都不具特异性，有些病情轻微的患者也没有表现出典型症状，尤其 是老年患者和肥胖患者，即使有这些症状也很难解释。因此，初级医疗机构仅依赖临床标准 作为诊断依据，诊断心力衰竭的假阳性率可高达50%。目前诊断心衰最常用有效的方法主 要有超声心动图、放射核素显像和心核磁共振检查;但是日常实际诊断左心室功能衰竭时， 上述检查手段没有一项是可以完全信赖，并具有良好的重现性的。
[0004] 有研究显示，心衰患者BNP(B型脑钠肽）的升高水平与死亡率的上升及重入院的风 险性密切相关。BNP的含量与心室的压力、呼吸困难的程度以及急速调节系统的状况相关。 心室的体积和压力增高可导致血浆内BNP的升高，升高的程度与心室扩张和压力超负荷成 正比，可敏感和特异性的反映左心室功能的变化。用BNP辅助诊断心力衰竭，判断病情的严 重程度和预后。
[0005] 呼吸困难多由心肺疾病引起，鉴别心源性哮喘与肺源性哮喘经常令医生感到困 难。研究发现对急性呼吸困难患者进行BNP检测，心力衰竭的患者BNP水平平均值明显高于 肺部疾病患者，从而证实BNP能快速鉴别呼吸困难的病因。
[0006] 有大量一手资料表明，BNP可用于指导心衰的治疗。大剂量的药物治疗心衰后，血 清或血浆的BNP水平会下降，以BNP水平来指导药物治疗，不仅减少了心血管事件的总发生 数，而且与临床指导治疗方案相比，延迟了首次发生心血管事件的时间。因此，依据BNP水平 指导临床治疗，是一项有效的心衰治疗措施。
[0007] 有些表现心衰症状的患者可能认为自己没有得到足够的治疗。但是，如果这些患 者的BNP水平正常，可能就意味着这些患者已经受到适当的治疗而无须强化治疗(避免"治 疗过度"），因为他们的症状可能与心衰无关。
[0008] 传统上多用化学发光法及胶体金免疫层析法或者荧光免疫层析法等测定BNP。化 学发光法对技术要求高，操作步骤相对比较繁琐，需要多步试剂添加过程。胶体金免疫层析 法虽然具有标本用量少，简便快速，便宜的优势，然而当遇到某些样品中抗原或抗体含量极 低时，胶体金的颜色将很浅甚至无显色，很难用肉眼来判断结果，容易出现误判，灵敏度较 低。荧光免疫层析法虽然灵敏度比胶体金免疫层析法要高，但是其检测精密度并不理想，灵 敏度与大型化学发光或者电化学发光仪器仍有差距。
[0009] 时间分辨焚光(Time-resolved Fluorescence，TRF)是一种非同位素焚光标记物， 与普通荧光相比，具有Stock位移大，荧光寿命长等特点，可以有效的避免样品中的本底荧 光，以及激发光等杂散光的影响，因此相比普通荧光具有更高的灵敏度和抗干扰能力。
[0010] 目前市面上采用时间分辨荧光检测的试剂均采用解离增强镧系元素荧光免疫分 析(DELFIA)，它采用具有双功能基团结构的螯合物，使其一段与铕(Eu)连接，另一端与抗 体/抗原分子上的自由氨基连接，形成EU标记的抗体/抗原，经过免疫反应后形成免疫复合 物，由于这种复合物在水中的荧光强度非常弱，需要加入一种解离增强剂，使得铕离子从复 合物上解离下来，并与增强剂中的另一种螯合剂形成胶态分子团，这种分子团在紫外光的 激发下能发出很强的荧光。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的在于克服上述现有荧光免疫层析法测定BNP检测精密度不理想以及 时间分辨荧光检测法需要解离增强过程，检测步骤繁杂、时间长、精度差等不足，提供一种 基于微球的杯式时间分辨焚光BNP分析方法及试剂盒。该方法基于时间分辨焚光微球可高 灵敏度定量检测BNP。
[0012] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0013] 第一方面，本发明涉及一种基于微球的杯式时间分辨焚光BNP分析方法，所述方法 包括如下步骤：
[0014] S1、在检测反应杯内表面包被针对BNP特定抗原识别位点的一个或多个抗体(所述 抗体为单克隆抗体或者多克隆抗体，或者多个抗体的组合形式；即，包被BNP单抗或者多 抗)；
[0015] S2、将时间分辨荧光微球与BNP单抗或者多抗通过共价键交联制备得到荧光标记 抗体；
[0016] S3、将待测BNP样品加入步骤S1包被后的检测反应杯内，再加入所述荧光标记抗 体，25°C~40°C温育；
[0017] S4、清洗去除未结合的抗原及焚光标记抗体，在340~380nm激发光激发下，测试检 测反应杯中荧光信号；
[0018] S5、将所述荧光信号与标准曲线比对，获得所述待测BNP样品的BNP浓度。
[0019]优选的，所述时间分辨荧光微球中填充了镧系元素螯合物。
[0020] 优选的，所述镧系元素螯合物为Eu (TTA) 3/T0P0或Eu(TTA) 3/Phen (其中TTA为噻吩 甲酰三氟丙酮(Thenoyltrif luoroacetone)，T0P0为三辛基氧化膦，Phen为邻菲略啉）。
[0021 ]优选的，所述时间分辨荧光微球的粒径范围为100~lOOOnrn。
[0022]优选的，所述时间分辨荧光微球为前处理后的羧基时间分辨荧光微球;所述前处 理包括:加入MES和EDC进行初次活化处理，加入氨基己酸室温混匀15~60min，加入MES、NHS 和EDC进行再次活化处理;每lmg羧基时间分辨荧光微球对应10~100ul 50mM氨基己酸。 [0023] 更优选的，所述初次活化处理包括：每lmg羧基时间分辨荧光微球，加60ul500mM MES( 2-(N-吗啡啉）乙磺酸）缓冲液pH5.0~7.0，加0.02~0.2mgl-(3-二甲氨基丙基）-3_乙 基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，加纯化水至终体积400yL，室温混匀15~60min;所述再次活化处 理包括:加入所述氨基己酸室温混勾后，加lmLIOOmM MES pH6.0,离心清洗15000rpm 10~ 25min，弃去上清；加400ul 100mM MES pH6.0,超声分离，加0.02~0.2mg N-羟基琥I自酰亚 胺(NHS)，加0.01~O.lmgEDC，室温混匀10~20min;加lmL lOOmM MES pH6.0缓冲液，离心清 洗15000rpm 10~25min，弃去上清；100mM MES pH6.0缓冲液恢复到lml。
[0024]优选的，步骤S2中，还包括将共价键交联制备得到的荧光标记抗体进行封闭、清洗 后用反应缓冲液稀释到终浓度到50iig/ml，作为检测用荧光标记抗体的步骤;所述每1L反应 缓冲液中含有50~300mM tris，l~5%BSA，0.9~3%NaCl，l~3%葡聚糖，0.02~2.0% tween 20，pH6? 0~9? 0。更优选含有50mM tris，1 %BSA，0 ? 9%NaCl，2%葡聚糖，0 ? 5%tween 20，pH7.2。
[0025] 优选的，所述清洗采用的清洗液每每1L含5~lOOmM PB，0.9~3%NaCl，0.02~ 1.0%Tween 20，pH6~9。更优选含5mM PB，0.9%NaCl，0.05%Tween 20，pH7.8〇
[0026] 优选的，所述标准曲线为系列浓度的BNP校准品的BNP浓度与对应的荧光信号的关 系曲线;该荧光信号为采用所述基于微球的杯式时间分辨荧光BNP分析方法测得的荧光信 号。
[0027] 第二方面，本发明涉及一种基于微球的杯式时间分辨荧光BNP分析试剂盒，所述试 剂盒包括检测反应杯、荧光标记抗体和清洗液；
[0028]所述检测反应杯内表面包被BNP单抗或者多抗；
[0029] 所述荧光标记抗体是由时间分辨荧光微球与BNP单抗或者多抗通过共价键交联制 备而得；
[0030] 所述清洗液每 1L含5~lOOmM PB，0.9~3%NaCl，0.02~1.0%Tween 20，pH6~9〇
[0031] 更优选含5mM PB，0.9%NaCl，0.05%Tween 20，pH7.8。
[0032] 该试剂盒的检测基础是双抗体夹心的免疫反应。
[0033]所述时间分辨荧光微球中填充了镧系元素化合物;较优的，该镧系元素螯合物为 铕螯合物;最优的，该铕螯合物可为Eu(TTA)3/T0P0或Eu(TTA)3/Phen。
[0034] 优选的，所述时间分辨荧光微球粒径范围为100~lOOOnm。
[0035]第三方面，本发明涉及一种基于微球的杯式时间分辨荧光BNP分析试剂盒的制备 方法，包括以下步骤：
[0036] (1)检测反应杯的制备
[0037]采用BNP单抗或者多抗采用物理吸附的方式结合在反应杯内表面；
[0038] (2)荧光标记抗体的制备
[0039]采用BNP的单抗或者多抗采用共价交联的方式与荧光微球偶联；
[0040] (3)清洗液配制
[0041]优选的，所述偶联具体为：每lml前处理后的羧基时间分辨荧光微球中加入 0.2mgBNP的单抗或者多抗，室温混勾20~40min进行偶联(即，共价键交联）。
[0042] 优选的，所述前处理包括:加入MES和EDC进行初次活化处理，加入氨基己酸室温混 匀15~60min，加入MES、NHS和EDC进行再次活化处理;每lmg羧基时间分辨荧光微球对应10 ~100ul 50mM氨基己酸。更优选为，所述初次活化处理为每lmg羧基时间分辨荧光微球，加 60ul 500mM MES(2-(N-吗啡啉）乙磺酸)缓冲液pH5.0~7.0,加0.02~0.2mgl-(3-二甲氨基 丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，加纯化水至终体积400此，室温混匀15~60min;所述 再次活化处理包括:加入所述氨基己酸室温混匀后，加lmL lOOmM MES pH5.0~7.0,离心清 洗 15000rpm 10~25min，弃去上清；加400ul 100mM MES pH5.0~7.0,超声分离，加0.02~ 0 ? 2mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，加0 ? 01~0 ? lmgEDC，室温混匀10~20min。
[0043] 优选的，所述前处理包括:每lmg羧基时间分辨荧光微球，加入60ul500mMpH6.0的 MES、0.2mg 1-(3_二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐、0.4mg N-羟基琥珀酰亚胺NHS， 加纯化水至终体积300yL，室温混匀活化10~20min。
[0044] 优选的，步骤(2)中偶联之后还包括将偶联得到的荧光标记抗体进行封闭、清洗后 用反应缓冲液稀释到终浓度到50iig/ml，作为检测用荧光标记抗体的步骤;所述每1L反应缓 冲液中含有50mM 钍18，1%85厶，0.9%恥(：1，2%葡聚糖，0.5%七￥66112〇4117.2〇
[0045] 第四方面，本发明涉及一种基于微球的杯式时间分辨荧光BNP分析试剂盒的使用 方法，包括将待测BNP样品加入检测反应杯中，然后加入荧光标记抗体，37°C温育，用清洗液 清洗去除未结合的抗原及焚光标记抗体，在340~380nm激发光激发下，测试反应杯中焚光 信号，检测波长为600~630nm。
[0046] 本发明的方法将待测样品中的抗原抗体反应信息转化成了另一种更为直观的光 信号信息（荧光信号），利用该方法，经过一系列的研究工作，可以获得光子信号(荧光信号） 与待测抗原之间的对应关系，进而制作标准曲线，再通过对光子信号与标准曲线的比对或 者与阴阳性参考光子信号的比较检测最终获得待测抗原的定量或者定性检测结果。
[0047] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0048] 1)荧光标记物为时间分辨荧光乳胶微球，每个微球中填充了几万到几十万个稀土 元素离子螯合物，检测过程中并不需要解离增强过程，便可发出很强的荧光，简化了时间分 辨荧光检测步骤，解离增强时间分辨荧光检测往往需要1个小时左右时间才能得到检测结 果，而采用时间分辨荧光微球作为标记物，由于每个微球中填充了大量的镧系元素螯合物， 荧光信号放大数千倍以上，因此可以在较短的检测时间内完成检测，缩短了检测时间，并有 效的提高了检测灵敏度。
[0049] 2)荧光微粒活化过程中添加氨基己酸作为手臂，使得抗体与微球之间的距离增 加，有效的降低了空间位阻效应，提高了检测系统灵敏度。
[0050] 3)荧光免疫层析法，其特点检测时间短，但其精密度不理想，受环境温度影响较 大，且要手工操作，本发明采用基于微球的杯式时间分辨荧光分析，由于其超高的灵敏度， 其检测时间并不比层析长，一方面易于实现自动化操作，另一方面反应温度均一，不受环境 因素影响，准确性更好，精密度也优于层析试剂。
【附图说明】
[0051]图1为本发明的原理不意图；
[0052] 图2为BNP检测标准曲线；
[0053]图3为与电化学发光临床样本比对结果示意图；
[0054]其中，1为焚光标记抗体，2为BNP抗原，3为包被抗体，4为反应杯固相表面，5为发光 免疫复合物。
【具体实施方式】
[0055] 下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员 进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
[0056] 本发明的原理示意图如图1所示，包被抗体3结合在反应杯固相表面4上，在反应杯 中添加一定量的样品使得样品中的BNP抗原2与反应杯固相表面结合的抗体3结合，再加入 荧光标记抗体1，温育形成发光免疫复合物5,采用清洗液清洗反应杯后去除未结合的抗原 及荧光标记抗体，检测反应杯中的荧光信号，与标准曲线进行对比，得到待测样本中BNP抗 原浓度。
[0057] 实施例1
[0058] 1、检测反应杯的制备 [0059] (1)检测反应杯包被
[0060]将 BNP 抗体 50El(Hytest 公司）用0.2M 磷酸缓冲液（pH7.8)稀释成20μg/ml，200yL/ 孔，37 °C包被4小时，洗板。
[0061 ] (2)检测反应杯封闭
[0062]用封闭缓冲液按300yL/孔加入反应杯，37°C封闭4小时，弃去包被反应杯中的封闭 液，拍干。
[0063] (3)检测反应杯干燥
[0064] 将上述封闭好的反应杯放置于湿度低于30 %的37 °C干燥箱中烘干8小时，密封干 燥保存。
[0065] 2、荧光标记抗体的制备
[0066] (1)荧光微粒前处理
[0067]取111^羧基时间分辨焚光微球（30〇11111，0.11111，1〇11^/111]^，1^叫81313公司），加6〇111 500mM MES(2-(N-吗啡啉）乙磺酸)缓冲液，pH6.0,加0.2mg 1-(3_二甲氨基丙基)-3_乙基碳 二亚胺盐酸盐(EDC)，加纯化水至终体积400此，室温混匀15min。加100ul 50mM氨基己酸，室 温混勾30min。加lmL 100mM MES pH6.0,离心清洗 15000rpm 20min，弃去上清。加400ul 100mM MES pH6.0,超声分离，加0.2mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)，加O.lmgEDC，室温混匀 15min。加lmL 100mM MES pH6.0缓冲液，离心清洗 15000rpm 20min，弃去上清。100mM MES pH6.0缓冲液恢复到lml。
[0068] (2)抗体交联
[0069]加0.2mg BNP单克隆抗体24C5(Hytest公司），室温25。(：混匀30min。
[0070] (3)封闭
[0071] 加BSA封闭液，至终浓度10mg/mL BSA，室温25°C混匀过夜。
[0072] (4)清洗
[0073] 加3mL交联缓冲液（100mM MES pH6.0)，15000rpm离心清洗30min，弃去上清。加 500ul交联缓冲液(100mM MES pH6.0)，超声分离，终浓度2mg/ml。
[0074] (5)工作用荧光标记抗体配制
[0075] 配制反应缓冲液:缓冲液中含有50mM tri s，1 % BSA，0 ? 9 % NaCl，2 %葡聚糖，0 ? 5 % tween 20,pH7.2。
[0076]用反应缓冲液将上述清洗好的荧光标记抗体稀释到终浓度到50iig/ml，作为检测 用荧光标记抗体。
[0077] 3、清洗液的配制
[0078] 配制清洗缓冲液，含5mM PB，0.9%NaCl，0.05%Tween 20，pH7.8。
[0079] 4、BNP 检测
[0080] (1)标准曲线制备
[0081] 采用上述方法制备的试剂组合成BNP时间分辨荧光定量试剂盒，测定校准品，每个 浓度重复10次。
[0082]每个检测中加入校准品10此，荧光标记抗体50yL，37 °C温育20min，然后清洗检测 杯，在PerkinElmer公司的Victor X4焚光读数仪上进行读数，标准曲线数据如表1所示，标 准曲线如图2所示。
[0083] 由图2的标准曲线我们可以看到，该标准曲线线性良好，可以通过该标准曲线对样 本中所含的BNP浓度进行定量分析。
[0084] 通过表1结果可知，检测试剂盒的批内精密度良好，校准品各浓度点荧光信号精密 度均小于10% (除0值以外），且试剂灵敏度良好，在5pg/ml水平与0值校准品有显著区分。 [0085] 表1BNP定量检测标准曲线数据
[0087] (2)样本测试
[0088]采用上述方法制备的试剂组合成BNP时间分辨荧光定量试剂盒，测定临床样本，与 Alere微流控芯片系统测试结果进行相关性分析。
[0089]每个检测中加入样品10yL，荧光标记抗体50yL，37 °C温育20min，然后清洗检测杯， 在PerkinElmer公司的Victor X4焚光读数仪上进行读数，将测试结果带入图2标准曲线，计 算样品测试浓度，比对数据如表2所示，与Alere微流控芯片系统测试结果进行相关性分析， 相关性曲线如图3所示。
[0090] Alere微流控芯片系统和配套的BNP试剂盒是知名的BNP检测试剂盒，其精度和结 果公认可靠。由图3显示可知本发明的试剂盒测定结果与Alere仪器及配套试剂盒测定结果 相关系数R 2为〇. 963，相关性较好，可用于临床诊断使用。
[0091] 表2临床样本比对结果
[0094] 实施例2
[0095] 1、检测反应杯的制备
[0096] (1)检测反应杯包被
[0097]将 BNP 抗体 50El(Hytest 公司）用0.2M 磷酸缓冲液（pH7.8)稀释成20μg/ml，200yL/ 孔，37 °C包被4小时，洗板。
[0098] (2)检测反应杯封闭
[0099]用封闭缓冲液按300yL/孔加入反应杯，37°C封闭4小时，弃去包被反应杯中的封闭 液，拍干。
[0100] (3)检测反应杯干燥
[0101] 将上述封闭好的反应杯放置于湿度低于30%的37°C干燥箱中烘干8小时，密封干 燥保存。
[0102] 2、荧光标记抗体的制备
[0103] (1)荧光微粒前处理
[0104] 取111^羧基时间分辨焚光微球（30〇11111，0.11111，1〇11^/111]^，1^叫81313公司），加6〇111 500mM MES(2-(N-吗啡啉）乙磺酸)缓冲液，pH6.0,加0.2mg 1-(3_二甲氨基丙基)-3_乙基碳 二亚胺盐酸盐(EDC)，加纯化水至终体积400此，室温混匀15min。加lmL 100mM MES pH6.0， 离心清洗15000rpm 20min，弃去上清。
[0105] (2)抗体交联
[0106]加0.2mg BNP单克隆抗体24C5(Hytest公司），室温25°C混匀30min。
[0107] (3)封闭
[0108] 加BSA封闭液，至终浓度10mg/mL BSA，室温25°C混匀过夜。
[0109] (4)清洗
[0110] 加3mL交联缓冲液（100mM MES pH6.0)，15000rpm离心清洗30min，弃去上清。加 500ul交联缓冲液(100mM MES pH6.0)，超声分离，终浓度2mg/ml。 (5)工作用荧光标记抗体配制
[0112] 配制反应缓冲液:缓冲液中含有50mM tris，1 %BSA，0.9%NaCl，2 %葡聚糖，0.5 % tween 20,pH7.2。
[0113] 用反应缓冲液将上述清洗好的荧光标记抗体稀释到终浓度到50iig/ml，作为检测 用荧光标记抗体。
[0114] 3、清洗液的配制
[0115] 配制清洗缓冲液，含5mM PB，0.9%NaCl，0.05%Tween 20，pH7.8。
[0116] 4、校准品测试
[0117] 采用上述方法制备的试剂组合成BNP时间分辨荧光定量试剂盒，测定校准品，每个 浓度重复10次。
[0118] 每个检测中加入校准品10此，荧光标记抗体50yL，37 °C温育20min，然后清洗检测 杯，在PerkinElmer公司的Victor X4焚光读数仪上进行读数。
[0119]通过表3结果可知，检测试剂盒的批内精密度良好，校准品各浓度点荧光信号精密 度均小于10% (除0和5pg/ml水平以外），试剂灵敏度相比实施例1来说有所降低，仅在50pg/ ml水平与0值校准品有较为显著区分。说明荧光微粒前处理过程中通过添加手臂的方式能 有有效的提升检测的灵敏度。
[0120]表3BNP定量检测标准曲线数据
【主权项】
1. 一种基于微球的杯式时间分辨荧光BNP分析方法，其特征在于，所述方法包括如下步 骤： 51、 在检测反应杯内表面包被BNP单抗或者多抗； 52、 将时间分辨荧光微球与BNP单抗或者多抗通过共价键交联制备得到荧光标记抗体； 53、 将待测BNP样品加入步骤Sl包被后的检测反应杯内，再加入所述荧光标记抗体，25 。(:~40 °C温育； 54、 清洗去除未结合的抗原及焚光标记抗体，在340~380nm激发光激发下，测试检测反 应杯中荧光信号，检测波长为600~630nm; 55、 将所述荧光信号与标准曲线比对，获得所述待测BNP样品的BNP浓度。2. 根据权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光BNP分析方法，其特征在于，所 述时间分辨荧光微球中填充了镧系元素螯合物。3. 根据权利要求2所述的基于微球的杯式时间分辨荧光BNP分析方法，其特征在于，所 述镧系元素螯合物为Eu (TTA) 3/TOPO或Eu (TTA) 3/Phen。4. 根据权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光BNP分析方法，其特征在于，所 述时间分辨荧光微球的粒径范围为100~1000 nm。5. 根据权利要求1~4中任一项所述的基于微球的杯式时间分辨焚光BNP分析方法，其 特征在于，所述时间分辨焚光微球为前处理后的羧基时间分辨焚光微球;所述前处理包括： 加入MES和EDC进行初次活化处理，加入氨基己酸室温混匀15~60min，加入MES、NHS和EDC进 行再次活化处理;每Img羧基时间分辨荧光微球对应10~IOOul 50mM氨基己酸。6. 根据权利要求5所述的基于微球的杯式时间分辨焚光B N P分析方法，其特征在于，所 述初次活化处理包括:每Img羧基时间分辨荧光微球，加60ul 500mM pH5.0~7.0的MES， 0.02~0.2mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，加纯化水至终体积400yL，室 温混匀15~60min;所述再次活化处理包括：加入所述氨基己酸室温混匀后，加 ImL IOOmM MES ρΗ6·0,离心清洗 15000rpm 20min，弃去上清；加400ul IOOmM MES ρΗ6·0,超声分离，加 0.02~0.2mg N-羟基琥珀酰亚胺，加0.01~O.lmgEDC，室温混匀15min;加 ImL IOOmM MES ρΗ5·0~7.0缓冲液，离心清洗15000rpm 20min，弃去上清；IOOmM MES ρΗ5·0~7.0缓冲液恢 复到lml。7. 根据权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光BNP分析方法，其特征在于，步 骤S2中，还包括将共价键交联制备得到的荧光标记抗体进行封闭、清洗后用反应缓冲液稀 释到终浓度50μg/ml，作为检测用荧光标记抗体的步骤;所述每IL反应缓冲液中含有50~ 300mM tris，l~5%BSA，0.9~3%NaCl，l~3%葡聚糖，0.02~2.0%tween 20，ρΗ6·0~ 9 · 0 〇8. 根据权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光BNP分析方法，其特征在于，所 述清洗采用的清洗液每IL含5~IOOmM ΡΒ，0·9~3%NaCl，0.02~1.0%Tween 20，ρΗ6~9。9. 根据权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光BNP分析方法，其特征在于，所 述标准曲线为系列浓度的BNP校准品的BNP浓度与对应的荧光信号的关系曲线;该荧光信号 为采用所述基于微球的杯式时间分辨荧光BNP分析方法测得的荧光信号。10. -种基于微球的杯式时间分辨荧光BNP分析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括 检测反应杯、荧光标记抗体和清洗液； 所述检测反应杯内表面包被BNP单抗或者多抗； 所述荧光标记抗体是由时间分辨荧光微球与BNP单抗或者多抗通过共价键交联制备而 得； 所述清洗液每IL含5~IOOmM ΡΒ，0·9~3%NaCl，0.02~1.0%Tween 20，pH6~9。
【文档编号】G01N33/68GK105891507SQ201610210112
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月6日
【发明人】石晓强, 李福刚, 徐建新, 周奕璇, 杨晶
【申请人】上海奥普生物医药有限公司