专利名称：血管紧张素转化酶抑制肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及抑制血管紧张素转化酶的肽，因此该肽可以用作具有降低血压作用的健康食品、药物等的组分。
现有技术高血压是与生活方式相关的疾病的一个典型的例子，高血压患者的数量年年增加。已知高血压诱导各种并发症例如脑出血，蛛网膜下出血，脑梗死，心肌梗死，心绞痛，肾硬化等等。因此已经对高血压的发病机理进行各种研究。
作为血压-调节系统，与血压升高相关的肾素-血管紧张素系统和与血压降低相关的激肽释放酶-激肽系统起到重要的作用。在肾素-血管紧张素系统中，肝脏中分泌的血管紧张素原被肾产生的肾素转化成血管紧张素I。血管紧张素I进一步被血管紧张素转化酶(ACE)转化成血管紧张素II。血管紧张素II诱导血管平滑肌收缩因而血压升高。另一方面，降低血压系统中的激肽释放酶作用于激肽原，因此产生缓激肽。缓激肽具有引发血管舒张的作用并降低血压。然而，ACE具有降解缓激肽的作用。就是说，已知ACE通过上述两种作用参与到血压升高中，即产生血管紧张素II，其是一种血管加压肽，以及钝化缓激肽，其是一种降低血压肽。因此可能通过抑制ACE的酶活性从而减少血压升高。已经广泛使用作为ACE抑制剂的脯氨酸衍生物例如卡托普利和依拉普利治疗高血压。
最近几年，已经报道通过用酶消化食物原料得到的肽具有ACE抑制活性。例如，已经报导了大量的这类消化产物，例如，明胶的胶原酶消化产物(日本专利公开SHO 52-148631)，酪蛋白的胰蛋白酶消化产物(日本专利公开SHO 58-109425，日本专利公开SHO 59-44323，日本专利公开SHO 60-23086，日本专利公开SHO 60-23087，日本专利公开SHO 61-36226和日本专利公开SHO 61-36227)，γ-玉米醇溶蛋白的嗜热菌蛋白酶消化产物(日本专利公开SHO 2-32127)，沙丁鱼肉的胃蛋白酶消化产物(日本专利公开HEI 3-11097)，干鲣的嗜热菌蛋白酶消化产物(日本专利公开HEI 4-144696)，芝麻蛋白质的嗜热菌蛋白酶消化产物(日本专利公开HEI 8-231588)，κ-酪蛋白的胃蛋白酶消化产物(日本专利公开8-269088)等。
这些食物来源的ACE抑制肽具有显著的优势，即它们几乎没有安全问题(即，副作用，毒性等)并且像普通的食物一样可以食用。然而，已经报道上述肽产物主要包括具有5个或更多个氨基酸的肽(日本专利公开SHO 52-148631，日本专利公开SHO 58-109425，日本专利公开SHO 59-44323，日本专利公开SHO 60-23086，日本专利公开SHO 61-36226，日本专利公开SHO 61-36227，日本专利公开HE I3-11097，日本专利NO.3135812，日本专利公开HEI 8-269088)。已经指出，由长氨基酸链构成的肽不能取得根据体外强ACE抑制活性而预期的降血压作用水平，很可能因为它们容易被体内的消化酶消化，因而失去该ACE抑制活性，或者即使它们不被消化，由于它们的大分子结构，它们不容易被吸收。
发明概述因此，本发明的一个目的是提供ACE抑制三肽，当口服使用时，该ACE抑制三肽不容易被消化酶所消化，因而在体内较少地倾向于失去它们的ACE抑制活性。
在本发明中，也想要提供包含一种或几种上述三肽的可食用(食物/饮料)的组合物，血管紧张素转化酶抑制剂以及降血压剂。
附图的简要描述
图1显示了根据本发明的肽在自发性低血压大鼠身上检测降血压效果的实验结果。
发明的详细描述本发明者们研究由不超过3个氨基酸构成的ACE抑制肽，假定食物原料的嗜热菌蛋白酶消化产物将含有能解决上述问题的肽。结果，他们成功地在芝麻的嗜热菌蛋白酶消化产物中发现3种三肽，所述的三肽具有ACE抑制活性并且在动物实验中显示了降血压的作用。基于这些发现完成本发明。
因此，本发明提供分别具有Leu-Ser-Ala，Val-Ile-Tyr，和Leu-Val-Tyr氨基酸序列的三肽，其显示了血管紧张素转化酶抑制活性。
本发明进一步提供含有一种或几种上述三肽的可食用的组合物，血管紧张素转化酶抑制剂以及降血压剂。
根据本发明的三肽可以由化学合成产生。然而，在发明的一种实施方案中，其中该三肽被加入到食品、饮料或口服药物中从而利用它们的ACE抑制活性，优选产生一种可食用组合物，通过嗜热菌蛋白酶消化来源于芝麻等中的植物蛋白，并进一步将其进行纯化，使所述可食用组合物富集上述3个三肽中的至少一种。
使用富含蛋白质的植物组织(优选种子)作为植物性蛋白质来源，例如谷类例如米，小麦，大麦，燕麦以及玉米，或豆例如菜豆，蚕豆，大豆以及绿豆和芝麻。
当根据本发明的肽通过嗜热菌蛋白酶进行消化而得到时，处理过程根据原材料的性质进行变化。优选，作为预处理，例如通过压榨除去汁液或用溶剂例如醇，丙酮，己烷等提取脂肪，原料首先被脱脂。为了增强嗜热菌蛋白酶消化原材料的效率，也优选原材料被精细研磨接着搅拌下悬浮于水中。如果是几乎不溶的蛋白质，也可能采用另一种预处理，例如加入氢氧化钠或加热从而均匀溶解或使蛋白质悬浮。接着，加入适当量的嗜热菌蛋白酶，优选为500至50000PU/g蛋白质，在pH为5至9，温度为10至80℃，在静止状态或搅拌下蛋白质消化反应进行0.5至48小时。(“PU”指的是“蛋白酶单位”，1PU被定义为在pH7.2和35℃条件下，使用乳酪蛋白作为底物每分钟生成等量于1ug酪氨酸的非蛋白福林颜色的增量而所需的酶量。)。为了检查是否进行了充分的反应(即，对于得到想要的三肽，该反应是充分的)，使用了一种方法，包括“将液体反应溶液加入使用ODS柱的高效液相色谱中，通过测量210nm的吸光度来确定洗脱方式”。通过加入例如盐酸使反应终止。可选择的是，可以通过加热使嗜热菌蛋白酶钝化。也可能通过加入盐酸和加热来终止反应。将液体反应溶液进行离心，过滤等并除去沉淀物。将这样得到的滤液用氢氧化钠或盐酸进行中和，接着进行浓缩。此外，如果需要，将其用活性炭进行处理可以除去臭味(例如苦味，酸涩，刺激气味等)。如此得到的芝麻肽含有各自数量为0.001重量％至0.1重量％的Leu-Ser-Ala，Val-Ile-Tyr以及Leu-Val-Tyr。
由上述方法得到的嗜热菌蛋白酶消化产物可以用作本发明的三肽组合物，进行或不进行使用离子交换树脂，高孔聚合树脂等的进一步的处理，从而除去高分子量蛋白质，从而提供富含本发明三肽的部分纯化产物。这些消化产物和部分纯化产物通常在下文中有时被称作“富含三肽的组合物”。如果需要，在使用前，这样的组合物可以用活性炭进一步进行处理以除去臭味(例如苦味，酸涩，刺激气味等)。
为了得到本发明的肽的纯化制剂，将上述浓缩物进行凝胶过滤柱层析，使用离子交换树脂或高孔聚合树脂的层析，亲和层析等，并将具有ACE抑制活性的本发明的肽级分合并。接着，可以使用纯化肽时经常采用的方法将合并的活性级分进行纯化，例如使用带反相柱例如ODS柱或C30柱的高效液相色谱法从而提供基本上是纯态的单一形式的肽。使用上述方法不但从芝麻中(例如，胡麻(Sesamum indicum L.))，而且从谷类例如米(例如，稻(Oryza sativa L.))，小麦(例如，普通小麦(Triticum aestivum L.)，T.durum Desf.，圆锥小麦(T.turgidum L.)，T.pyramidale(Delile)Perciv.non Delile exSchult，T.abyssinicum Vavilov，以及T.carthlicum Nevski)，大麦(例如，大麦(Hordeum vulgare L.))，燕麦(例如，燕麦(AVenasativa L.))或玉米(例如，玉蜀黍(Zea mays L.))，或者豆例如菜豆(例如，菜豆(Phaseolus vulgaris L.))，蚕豆(例如，蚕豆(Vicia faba L.))，大豆(例如，大豆(Glycine max(L.)Merrill))或绿豆(例如，Vigna radiate(L.)R.Wilcz)可以得到本发明的三肽。三肽或富含三肽的组合物的ACE抑制活性可以通过例如将在下文实施例中描述的体外检测方法和/或体内检测方法进行测定。
当本发明的每种肽都通过化学合成进行制备时，可以使用合成肽时通常使用的任何一种固相方法和液相方法完成所述合成。由该合成得到的本发明的肽可以用经常采用的纯化方法进行纯化，例如反相高效液相色谱法，使用离子交换树脂或高孔聚合树脂的色谱法，亲和色谱法等。
由此得到的三肽和富含三肽的组合物具有很强的抑制ACE的活性，当口服后能显示出很强的ACE抑制效果。因此作为高度有效的ACE抑制剂它们很有用处。而且，它们很容易通过胃肠道吸收，受热时也比较稳定。基于这些特性，它们可以应用到各种形式的食品，饮料和药物制品。
因此，本发明提供含有一种或几种上述三肽并且应该具有血管紧张素转化酶抑制效果的可食用的组合物，血管紧张素转化酶抑制剂以及包含一种或几种上述三肽的降血压剂。
当在食品、饮料、药品等中使用本发明的一种或几种三肽时，可以使用充分纯化自芝麻蛋白质级分的嗜热菌蛋白酶消化产物的三肽，等等，或者使用化学合成产品。或者，既然本发明的三肽具有高度稳定性和强的ACE抑制活性，如上所述的部分纯化产物或者嗜热菌蛋白酶消化产物或其部分纯化产物本身都同样可以用作富含三肽的组合物；在这种情况下，也能获得足够的ACE抑制活性，因此为本发明的优选实施例。
根据本发明生产的可食用的组合物加入了一种或几种如上所述的三肽，在单次服用剂量中三肽的含量为从0.001mg到100mg，优选为从0.01mg到20mg，更优选为从0.1mg到10mg。本发明的三肽为固体或粉末形式，很容易处理并极易溶于水。并且三肽也能够很好地被胃肠道吸收。因此，三肽能够没有任何限制地在任何阶段用任何方法添加到食品中。也就是说，在食品生产的起始、中间或最后阶段，可以用食品工业领域的常用方法将三肽以粉末、溶液、悬浮液等形式添加到食品中。短暂的、间歇的、连续的或每天服用含三肽的可食用组合物就有可能抑制血管紧张素转化酶，并获得例如降低血压的效果。食品和饮料可以是例如固体、半流体或流体的形式。固体食品的例子包括以饼干，薄片，和诸如片剂、胶囊、颗粒和粉末等药丸形式出现的普通食品和保健食品。半流体食品的例子包括以糊状、果冻和胶冻形式出现的产品。流体食品的例子包括以果汁、冷饮、茶饮料、滋补饮料等形式出现的普通饮料和保健饮料。这些食物或饮料可以以营养补充饮料或调味品的形式供应，以使我们能够连续服用本发明的三肽，以此降低血压升高的风险。
本发明药物组合物含有本发明的三肽，其数量与上述可食用组合物相似。本发明药物组合物可以暂时给高血压患者服用从而抑制体内的血管紧张肽转化酶，从而达到降低血压的作用。可选择的是，本发明的药物组合物可以安全地连续服用，因为活性成分源自天然材料。作为可以由本发明药物组合物治疗和/或预防的疾病的例子，可以提及高血压。优选该药物组合物为口服制剂例如片剂，胶囊，粉剂，颗粒剂或糖浆的形式。用于非肠道使用的制剂的例子包括静脉，动脉，皮下，肌内或鼻内使用的无菌溶液。这样的溶液可以是干燥固体的形式，在使用前将其溶解。注射制剂可以通过将有效量的三肽溶解在生理盐水中，在如生产注射制剂通常采用的无菌条件下进行处理而进行生产。
实施例现在，参照下面的实施例将更详细地描述本发明。
测量ACE抑制活性的方法在本发明中，根据下面的方法测量ACE抑制活性(IC50)。
缓冲液0.1M HEPES，0.3M NaCl，0.01％Triton-x(pH8.3)。
酶来自兔肺的ACE(Sigma)。
将其溶解在上述缓冲液中，调成浓度为1mU/50ul。
底物Bz-Gly-His-Leu.H2O(Peptide Institute Inc.)。
将8.95mg底物溶解在1ml二甲亚砜中并进一步用水稀释5倍(最终的浓度4mM)。
将5ul含有本发明肽的样品用移液管移入96孔微板中。加入25ul缓冲液和10ul酶后，将混合物完全搅拌，在37℃孵育5分钟。加入10ul底物后，该混合物在37℃反应30分钟，接着加入40ul 0.1N NaOH使反应停止。加入20ul 1％邻苯二醛的甲醇溶液并在室温下放置10分钟后，加入100ul 0.1N HCl，将得到的混合液在37℃孵育30分钟。接着通过激发(355nm)组氨酸残基中的氨基和邻苯二醛之间反应形成的荧光物质并测定波长为460nm的荧光，从而测定ACE水解形成的His-Leu的数量。根据下面等式确定本发明肽的抑制百分数并计算ACE抑制活性(IC50)。
抑制百分数＝{1-(A-a)/(B-b)}x100A当加入样品时荧光测量值。
a当加入样品并加入缓冲液作为酶的替代品时荧光测量值。
B当加入蒸馏水替代样品时荧光测量值。
b当加入蒸馏水替代样品并加入缓冲液替代酶时荧光测量值。
实施例1产生并纯化肽将2L水加入100g脱脂芝麻中，并加入NaOH使得到的混合物的pH值调节至12.0至12.5。55℃搅拌1小时后，将该混合物过滤得到蛋白质提取物。将HCl加入蛋白质提取物中使pH值调节至4.0。离心后得到芝麻蛋白质(折算成干重为19.8g)。
将300ml水加入10g得到的芝麻蛋白质中，用NaOH将混合物的pH值调到7.5。接着向内加入10mg嗜热菌蛋白酶(Nacalai Tesque，7000PU/mg)，轻柔搅拌下该混合物于65℃反应6小时。反应完成后，将HCl加入反应混合物中调至pH4.0，并加热至90℃10分钟使嗜热菌蛋白酶钝化。加热后，通过离心除去这样形成的沉淀物，通过纸滤器过滤上清液(Toyo，No.2)。将滤液冷冻干燥得到5.9g肽粉末。
将80mg该肽粉末溶解在2ml 10％乙醇溶液中，并进行凝胶过滤柱层析。采用的条件如下柱Bio-Gel P-2(15mm ID x 820mm L，Bio-Rad)。
洗脱液10％乙醇。
流速0.15ml/min。
检测UV210nm。
使用级分收集器以15分钟间隔收集来自柱的洗脱级分。根据上述方法测定每种级分的ACE抑制活性。结果，在上述条件下观察到主要的ACE抑制活性在级分32至38中。将这些级分进行合并并进行冷冻干燥。将该步骤重复3次，因而总共得到37.5mg的肽。
接着，将Bio-Gel P-2凝胶过滤柱层析得到的37.5mg ACE抑制活性肽溶解在2ml纯净水中，并加入使用ODS柱的高效液相色谱中从而分离肽。采用的条件如下柱Develosil ODS-10(20mm ID x 250mm L，Nomura Chemical)。
流动相缓冲液A5％CH3CN，0.1％TFA。
缓冲液B40％CH3CN，0.1％TFA。
梯度0至20分钟0％缓冲液B20至80分钟0至100％缓冲液B。
流速10ml/min。
检测UV210nm。
使用级分收集器以1分钟间隔收集洗脱级分。每种级分用移液管取5ul移入96孔微板中，并减压蒸发至干燥。接着将残留物溶解在5ul纯净水中得到用于测量ACE抑制活性的样品。接着根据上述方法测量每种级分的ACE抑制活性。结果，级分39，52和54显示出强的ACE抑制活性。将这3个级分冷冻干燥，因此从每种级分得到少量的肽。
纯化级分39中的ACE抑制肽将级分39的冷冻干燥肽溶解在200ul纯净水中，进行使用C30柱的高效液相色谱分析，从而分离肽。采用的条件如下柱Develosil C30-UG-5(10mm ID x 250mm L，Nomura Chemical)流动相缓冲液5％CH3CN，0.1％TFA。
流速4ml/min。
检测UV210nm。
在上述条件下，使用级分收集器以15秒间隔收集洗脱级分。每种级分用移液管取5ul移入96孔微板中，并减压蒸发至干燥。接着将残留物溶解在5ul纯净水中得到用于测量ACE抑制活性的样品。接着根据上述方法测量每种级分的ACE抑制活性。结果，级分44和45显示出强的ACE抑制活性。将这2个级分分别冷冻干燥，因此从每种级分得到少量的肽。接着将这些级分进行氨基酸分析和TOF MS/MS分析。结果，发现级分44和45的肽为Leu-Ser-Ala。
纯化级分52中的ACE抑制肽将级分52的冷冻干燥肽溶解在200ul纯净水中，进行使用C30柱的高效液相色谱分析，从而分离肽。采用的条件如下柱Develosil C30-UG-5(10mm ID x 250mm L)流动相缓冲液14％CH3CN，0.1％TFA。
流速4ml/min。
检测UV210nm。
在上述条件下，使用级分收集器以15秒间隔收集洗脱级分。每种级分用移液管取5ul移入96孔微板中，并减压蒸发至干燥。接着将残留物溶解在5ul纯净水中得到用于测量ACE抑制活性的样品。接着根据上述方法测量每种级分的ACE抑制活性。结果，级分89和90以及级分96和97显示出强的ACE抑制活性。将这4个级分分别冷冻干燥，因此从每种级分中得到少量的肽。接着将这些级分进行氨基酸分析和TOF MS/MS分析。结果，发现级分89和90的肽为Ile-Val-Tyr，而级分96和97的肽为Val-Ile-Tyr。
纯化级分54中的ACE抑制肽将级分54的冷冻干燥肽溶解在200ul纯净水中，进行使用C30柱的高效液相色谱分析，从而分离肽。采用的条件如下柱Develosil C30-UG-5(10mm ID x 250mm L，Nomura Chemical)流动相缓冲液17％CH3CN，0.1％TFA。
流速4ml/min。
检测UV210nm。
在上述条件下，使用级分收集器以15秒间隔收集洗脱级分。每种级分用移液管取5ul移入96孔微板中，并减压蒸发至干燥。接着将残留物溶解在5ul纯净水中得到用于测量ACE抑制活性的样品。接着根据上述方法测量每种级分的ACE抑制活性。结果，级分69至73显示出强的ACE抑制活性。将这5个级分分别冷冻干燥，因此从每种级分中得到少量的肽。接着将它们中的级分69，70，72和73进行氨基酸分析和TOF MS/MS分析。结果，发现每种级分中的肽为Leu-Val-Tyr。
实施例2通过化学合成产生肽使用Applied Biosystems制造的自动肽合成器(ABI430型)，从C-末端开始，采用BOC法根据该程序连续延伸肽链从而合成想要的保护的肽树脂。
完成树脂上的肽构造之后，将保护的肽树脂进行干燥。这样得到的受保护的肽被去掉保护，将其用无水氟化氢(HF/对甲酚8∶2v/v，60分钟)进行处理，从树脂载体上除去肽。将这样得到的粗肽用90％的乙酸进行提取并冷冻干燥得到粉末状固体。将这样得到的粗肽进一步用使用ODS柱的高效液相色谱进行纯化，因此得到想要的肽。
柱YMC-Pack ODS-2(30mm ID x 250mm L，YMC)流动相缓冲液A5％CH3CN，0.1％TFA。
缓冲液B40％CH3CN，0.1％TFA。
梯度0至10分钟0％缓冲液B10至90分钟0至100％缓冲液B。
流速20ml/min。
检测UV220nm。
这样纯化的肽的纯度用使用ODS柱的高效液相色谱进行检测。
柱Zorbax 300SB-C18(4.6mm ID x 250mm L，AgilentTechnologies)。
流动相缓冲液A1％CH3CN，0.1％TFA。
缓冲液B60％CH3CN，0.1％TFA。
梯度0至25分钟0至100％缓冲液B。
流速1ml/min。
检测UV220nm。
合成Leu-Ser-Ala使用Boc-Ala(BrZ)树脂(0.5mmol)作为起始氨基酸树脂载体，使用2mM的氨基酸衍生物Boc-Ser和Boc-Leu延伸肽链。接着通过上面实施例2中描述的纯化方法得到纯化的Leu-Ser-Ala。通过上述实施例2中描述的方法测定纯化产品的纯度为99.0％。
合成Val-Ile-Tyr使用Boc-Tyr(BrZ)树脂(0.5mmol)作为起始氨基酸树脂载体，使用2mM的氨基酸衍生物Boc-Ile和Boc-Val延伸肽链。接着通过上面实施例2中描述的纯化方法得到纯化的Val-Ile-Tyr。通过上述实施例2中描述的方法测定纯化产品的纯度为98.8％。
合成Leu-Val-Tyr使用Boc-Tyr(BrZ)树脂(0.5mmol)作为起始氨基酸树脂载体，使用2mM的氨基酸衍生物Boc-Val和Boc-Leu延伸肽链。接着通过上面实施例2中描述的纯化方法得到纯化的Leu-Val-Tyr。通过上述实施例2中描述的方法测定纯化产品的纯度为99.2％。
实施例3测量肽的ACE抑制活性根据上述方法测量实施例2中得到的3种肽的ACE抑制活性并确定IC50值。表1显示该结果。作为对照，也测量实施例1中得到的芝麻肽粉末的ACE抑制活性并确定其IC50值。
表1
实施例4肽对自发产生高血压的大鼠的降血压作用使17至22周的SHR大鼠整夜禁食。接着以1mg/kg的剂量口服实施例2中得到的3种肽中的每一种。对于对照组，口服相同量的水作为对照。测量之前，以及服用后24小时测量心脏收缩压的改变(BP-98A，SOFTRON)。图1显示该结果。
实施例5使用实施例2的合成产品，由下列成分产生谷类茶饮料。
组成烘烤的大麦 60g热水 2000ml实施例2的肽Leu-Ser-Ala 19mgVal-Ile-Tyr 18mgLeu-Val-Tyr 18mg产生方法将热水加入烘烤的大麦中并加热至90℃5分钟。冷却至40℃后，将混合物进行过滤。接着将水加入该提取物中将体积调至2000ml。接着加入上述肽并搅拌溶解得到谷类茶饮料。
实施例6从蛋白酶处理的植物种子中分离并定量Leu-Val-Tyr分别称量25g的米和燕麦谷粒，接着将其磨碎得到粉末。向每种粉末中加入50ml己烷，通过过滤纸(Whattman，No.1)除去该溶剂。相同的己烷处理总共重复4次。除去过滤纸上的残留物中的己烷从而分别得到18.8g脱脂米粉末和15.9g脱脂燕麦粉末。
每种脱脂粉末称量10g，将其悬浮在200ml 0.01N NaOH中，于55℃搅拌1小时。冷却至室温后，将悬浮液用滤纸(Whattman，No.1)进行过滤。加入0.1N HCl将滤液调至pH4.0。通过离心收集这样形成的沉淀物，冷冻干燥分别得到0.38g和0.57g米和燕麦的粗蛋白粉末。
称量0.2g得到的粉末，将其悬浮在10ml 0.1mM CaCl2中。将该悬浮液调至pH为7.5，向内加入0.2mg嗜热菌蛋白酶(7,000PU/mg，Nacalai Tesque)，于65℃轻柔搅拌6小时从而实现酶反应。反应期后，用1N HCl将pH调到4.0，90℃加热该混合物10分钟从而钝化嗜热菌蛋白酶。3,000rpm离心30分钟除去加热形成的沉淀物。将上清液冷冻干燥从而得到来自米的28.6mg肽粉末以及来自燕麦的87.8mg肽粉末。
如下从上面得到的米和燕麦肽粉末中分离和定量Leu-Val-Tyr，该Leu-Val-Tyr是本发明的一种肽。
i)在PD-10柱上的预处理从每种米和燕麦的肽粉末中称出20mg，溶解在0.1N乙酸中达到5mg/ml，通过微滤器(Millex-HV，孔径为0.45um，滤器直径为13mm，Millipore Corporation)进行过滤以除去不溶成分。将滤液中的2.5ml部分加入用0.1N乙酸平衡的PD-10柱中(脱盐柱，AmershamBiosciences)。该柱进一步用3.5ml体积的0.1N乙酸冲洗。接着收集另外用3.0ml体积的0.1N乙酸洗脱的级分，蒸发干燥，溶解在0.5ml水中，接着进行冷冻干燥。
ii)使用TSK-GEL G2000SWXL的凝胶过滤HPLC将PD-10柱预处理制备的样品溶解在250ul 45％CH3CN，0.1％TFA中，以进行2,000rpm离心5分钟。将滤液通过微滤器(Millex-HV，孔径为0.45um，滤器直径为13mm，Millipore Corporation)进行过滤以除去不溶成分。
将50ul滤液加样到45％CH3CN，0.1％TFA平衡的TSK-GELG2000SWXL(7.8 x 300mm，Tosoh Corporation)，用45％CH3CN，0.1％TFA进行HPLC(流速为0.7ml/min，检测波长为280nm)。收集保留时间之前和之后30秒之间的1分钟的洗出液，蒸发干燥，溶解在0.5ml水中并冷冻干燥。Leu-Val-Tyr的保留时间通过在相同条件下分别将合成的Leu-Val-Tyr进行HPLC而预先确定。
iii)Develosil C30-UG-5的反相HPLC(定量Leu-Val-Tyr)通过Develosil C30-UG-5柱的反相HPLC(3 x 150mm，NomuraChemical Co.，Ltd)对进行凝胶过滤的活性肽级分中的Leu-Val-Tyr进行定量分析。将来自TSK-GEL G2000SWXL的凝胶过滤HPLC的级分溶解在250ul 5％CH3CN，0.1％TFA中，2,000rpm离心5分钟，将上清液通过微滤器(Millex-HV，孔径为0.45um，滤器直径13mm，MilliporeCorporation)进行过滤以除去不溶成分。将50ul滤液上样到用5％CH3CN，0.1％TFA平衡的Develosil C30-UG-5柱上，在下列条件下完成层析洗脱溶剂0-5分钟5％CH3CN，0.1％TFA5-10分钟5-14％CH3CN，0.1％TFA10-35分钟14％CH3CN，0.1％TFA流速0.4ml检测波长280nm收集Develosil C30-UG-5柱色谱中米和燕麦中的每种肽的峰，其保留时间与真实的肽Leu-Val-Tyr的保留时间相对应。将级分进行TOFMS分析以及TOF MS/MS分析从而证实该级分为Leu-Val-Tyr。
在相同条件下如上所述将不同量的真实的Leu-Val-Tyr上样到相同的Develosil C30-UG-5柱，绘制峰面积对上样量，从而制备校准曲线。
校准曲线Y＝249197X-2150.6(R2＝0.9991)Y峰面积，XLeu-Val-Tyr的数量(ug)米和燕麦的Develosil C30-UG-5柱色谱的Leu-Val-Tyr级分的峰面积应用于校准曲线。结果，来自米和燕麦的1mg肽中的Leu-Val-Tyr的数量分别被确定为0.71ug和1.05ug。
权利要求
1.一种三肽，具有选自Leu-Ser-Ala，Val-Ile-Tyr和Leu-Val-Tyr的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的三肽，其通过用嗜热菌蛋白酶消化来源于选自米，小麦，大麦，燕麦，玉米，菜豆，蚕豆，大豆，绿豆和芝麻的一种或几种原料的蛋白质而得到。
3.一种可食用组合物，含有添加的一种或几种三肽，该三肽具有选自Leu-Ser-Ala，Val-Ile-Tyr和Leu-Val-Tyr的氨基酸序列。
4.一种血管紧张肽转化酶抑制剂，含有作为活性成分的一种或几种三肽，该三肽具有选自Leu-Ser-Ala，Val-Ile-Tyr和Leu-Val-Tyr的氨基酸序列。
5.一种降血压剂，含有作为活性成分的一种或几种三肽，该三肽具有选自Leu-Ser-Ala，Val-Ile-Tyr和Leu-Val-Tyr的氨基酸序列。
6.根据权利要求3的可食用组合物，其在单次摄入剂量中包含0.001mg至100mg的所述添加的三肽。
7.根据权利要求4的血管紧张肽转化酶抑制剂，其在用于口服的单次剂量中包含0.001mg至100mg的所述三肽。
8.根据权利要求5的降血压剂，其在用于口服的单次剂量中包含0.001mg至100mg的所述三肽。
全文摘要
想要提供ACE抑制三肽，当口服后其不容易被消化酶所消化，因此在体内较少地倾向于失去它们的ACE抑制活性。更具体的是，在芝麻的嗜热菌蛋白酶消化产物发现了具有ACE抑制活性并且在动物实验中显示降血压作用的三种三肽。这些三肽分别具有氨基酸序列Leu－Ser－Ala，Val－Ile－Tyr和Leu－Val－Tyr，并显示具有血管紧张肽转化酶抑制活性。
文档编号A61K38/06GK1780639SQ200480011269
公开日2006年5月31日 申请日期2004年3月17日 优先权日2003年3月18日
发明者小仓亨一, 饭野妙子, 浅见纯生 申请人:三得利株式会社