法尼醇x受体的抑制剂和在医学中的用图
【专利说明】法尼醇X受体的抑制剂和在医学中的用途
[0001] 对相关申请的交叉引用
[0002] 本专利申请要求2013年8月1日提交的美国临时专利申请号61/861，109和2014年5 月29日提交的美国临时专利申请号62/004,436的权益，所述临时申请通过参考结合于此。
[0003] 发明背景
[0004] 肥胖已经达到世界范围的流行比例，并且与慢性疾病如2型糖尿病、屯、血管疾病、 脂肪肝和癌症相关。由于能量摄入超过能量消耗，导致过量的热量在脂肪组织中W脂肪形 式净储存，造成肥胖形成。肥胖在代谢上与2型糖尿病(膜岛素抗性)和脂肪肝关联，后者可 W导致脂肪肝炎、肝癌发生和肝衰竭。因此，抑制食欲、阻断膳食脂肪吸收、诱导脂肪迁移或 增加代谢的药学方法在治疗肥胖和相关代谢病症方面是理想的。
[0005] 法尼醇X受体(Farnesoid X Receptor，FXR)是孤儿核受体，最初从大鼠肝cDNA文 库中鉴定(Forman，等人，Cel 1 81:687-693，1995 )，其与昆虫蚁皮激素受体最密切相关。FXR 是包括类固醇，类视黄醇和甲状腺激素的受体的转录因子核受体超家族的成员 (Mangelsdorf，等人，Cell 83:841-850,1995) dRNA印迹和原位杂交分析显示，FXR最大量地 表达在肝、肠、肾和肾上腺中（B.M. Forman,等人，Cell 81:687-693.1995; Seol，等人， Mol.Endocrinol. 9:72-85，1995) dFXR是配体激活的核受体，其作为与由维生素 A衍生物9- 顺式视黄酸激活的视黄酸受体a(RXRa)的异二聚体结合DNA"FXR/RXRa异二聚体优选结合于 由W反向重复编排并且由单个核巧酸分开的共有AG(G/T)TCA(IR-1基序）的两个核受体半 位点组成的应答元件(Forman,等人，Cell 81:687-693,1995)。早期的报道显示，大鼠 F邸由 微摩尔浓度的法尼醇如法呢醇和保幼激素激活，因此导致最初的名称(Forman,等人，Cell 81:687-693,1995)。然而，运些化合物是弱的配体并且也未能激活相应的小鼠和人FXR，造 成内源FXR配体的性质存在疑问。然而，发现多种天然存在的胆汁酸在生理浓度结合并激活 FXR(MakisMma，等人，Science 284:1362-1365,1999;化rks，等人，5(^611。6 284:1365- 1368，1999;Wang等人，Mol.Cell 3:543-553，1999 ;PCT W000/37077，2000年6月29 日公开）。 充当FXR配体的胆汁酸包括碟去氧胆酸(CDCA)，脱氧胆酸(DCA)，石胆酸化CA)，和牛横酸W 及运些胆汁酸的甘氨酸缀合物。
[0006] 胆汁酸是在肝中形成的并且分泌到肠的十二指肠中的胆固醇代谢物，在那里，它 们在溶解和吸收膳食脂肪和维生素方面发挥重要作用。约95%的胆汁酸随后被重新吸收到 回肠中并且经由肠肝(enterohepatic)循环体系返回肝。胆固醇在肝中转变为胆汁酸在反 馈调节下，并且胆汁酸下调细胞色素 P450 7AUCYP7A1)的转录，细胞色素 P450 7A1 (CYP7A1)编码催化胆汁酸生物合成中的限速步骤的酶。F邸通过设及F邸祀基因小异二聚体 伙伴（SHP)和肝受体同系物1的间接机制参与胆汁酸对CYP7A1表达的抑制（Goodwin等人， Mol.Cell 6:517-528,2000;在Matsubara等人，Mol.Cell.Endocrinol.368:17-29,2013中 综述）。在回肠中，WFXR依赖性的方式，胆汁酸诱导肠胆汁酸结合蛋白（IBABP)的表达，肠胆 汁酸结合蛋白（IBABP)是W高亲和力结合胆汁酸并且可W参与它们的细胞摄取和运输的细 胞质蛋白。两个小组现在已经证明，胆汁酸通过激活结合在人、大鼠和小鼠 IBABP基因启动 子中保守的IR-1型应答元件的FXR来介导它们对IBABP表达的影响。因此，FXR设及到参与胆 汁酸和胆固醇稳态的祀基因的刺激（IBABP)和表达(CYP7A1)二者当中。FXR还诱导将未缀合 的和缀合的胆汁酸/盐从肝细胞转运到胆汁中的胆盐输出累（BSEP，ABC11)的表达（在 Matsubara等人，Mol .Cell .Endocrinol .368:17-29,2013中综述）。
[0007] 报道了 tempol(4-^基-2,2,6,6，-四甲基赃晚-1-氧基），一种抗氧化剂和福射保 护剂，在小鼠中预防肥胖(Mitchell等人，Free Radic.Biol Med.34:93-102,2003)。最近的 基于质谱的研究表明，tempol可W影响脂肪酸代谢并且猜测的肠道微生物-产生的代谢物 的改变的水平提供tempol可W改变微生物群系（microbiome)的初步线索化i等人， J.Proteome Res.，12:1369-1376,2013)。之前的研究表明，肠道微生物群系的改变可W影 响肝、屯、脏和肾中胆汁酸的水平（Swann等人，Proc.化tl. Acad. Sci.USAlOS :4523-4530, 2011)。高脂肪膳食可W诱导小肠中受核受体(包括FXR)控制的基因的表达的改变(de Wi t 等人，BMC Med. Genomics 1:14，2008)。因此，肠中的改变的胆汁酸和可W改变高脂肪膳食 诱导的肥胖的F邸信号转导之间可能存在关联。尽管存在已知的天然和合成的FXR激动剂， 但还没有公开括抗FXR的治疗剂。近期的研究表明，次级胆汁酸牛横-β-鼠胆酸(邱MCA)可W 括抗肠中胆汁酸信号转导（Sayin等人，Cell 161曰6.225-235,2013;^等人，化1.(：〇臟1111.4: 2384，2013)。已经合成^取代的化挫甲酯胺类似物，其是FXR括抗剂，但是它们对代谢和生 理学的影响未被研究(化等人，Bioorg.Med. Chem. 2919-2938,2014)。
[0008] 非酒精性脂肪肝病(NAFLD)特征在于在没有其他肝疾病或显著酒精消费的情况下 在肝中的大量的异位甘油Ξ醋(TG)积累（WdB等人，〇*3油.4防*66.1111*.2014;111:447- 452，2014) dNAFLD是最常见的肝病症，其影响世界上20-30%的成年群体和多于80%的肥胖 的人。NAFLD可W发展为非酒精性脂肪肝炎（NASH)、纤维化、肝硬化和甚至肝细胞癌 (化owning等人，J.Clin Invest. 114:147-152,2004)。作为代谢综合征的组成部分，NAFLD 与肥胖、膜岛素抗性/2型糖尿病和冠屯、病和动脉粥样硬化密切相关（Bhatia等人， Eur.Head J. 33:1190-1200,2012)。至今，NAFLD发展的潜在分子机制仍然很大程度上未知 并且鉴定NAFLD治疗的新的祀点具有高的优先级。
[0009] 在前所述表明，存在未满足的对于FXR受体的括抗剂和治疗肥胖患者W诱导重量 减轻、膜岛素抗性、和NAFLD的方法的需求。
[001日]发明概述
[0011] 本发明提供治疗或预防哺乳动物，尤其是人中肥胖的核受体法尼醇X受体的抑制 剂。体现本发明的各方面的化合物通过法尼醇X受体介导的信号转导抑制法尼醇X受体并且 影响高脂肪膳食诱导的肥胖。根据本发明，本发明提供包含运些化合物的组合物和在治疗 或预防肥胖中使用运些化合物作为治疗剂的方法。
[0012] 本发明还提供药物组合物，其包含体现本发明的原理的化合物或盐和药用载体。
[0013] 本发明还提供抑制哺乳动物中法尼醇X受体的方法，其包括向需要其的哺乳动物 施用体现本发明的原理的化合物或其药用盐。
[0014] 本发明此外提供在哺乳动物中治疗或预防肥胖的方法，其包括向需要其的哺乳动 物中施用体现本发明的原理的化合物或其药用盐。
[0015] 本发明还提供在需要其的哺乳动物中治疗或预防肥胖，膜岛素抗性和NA化D的方 法，其包括向所述哺乳动物施用体现本发明的原理的化合物或其药用盐。理想地是，所述化 合物通过仅由肠法尼醇X受体介导的但不由肝法尼醇X受体介导的信号转导抑制肠中法尼 醇X受体并且影响肥胖，膜岛素抗性和NAFLD。优选地，所述化合物具有最小的系统性生物利 用度，从而所述化合物不抑制肝法尼醇X受体，运最小化任何系统性毒性。
[0016]本发明还提供合成本发明的化合物实施方案的方法。
【附图说明】
[0017]图1描述了显示牛横-β-鼠胆酸(TMCA化培养的原代肝细胞中括抗由FXR激动剂 牛横胆酸(TCA)导致的法尼醇X受体(FXR)激活的巧光素酶测定的结果。
[001引图2描述了显示牛横-β-鼠胆酸(TMCA)在化co2细胞中括抗由FXR激动剂牛横胆酸 (TCA)导致的FXR激活的巧光素酶测定的结果。
[0019] 图3说明保持高脂肪膳食达8周的FxrWfi小鼠和FxrAiE小鼠的回肠粘膜中的ATP水 平。
[0020] 图4说明由甘氨酸-β-鼠胆酸导致的对利用碟去氧胆酸的化P mRNA诱导的阻断。
[0021] 图5说明由甘氨酸-β-鼠胆酸导致的对利用GW4064的化P mRNA诱导的阻断。
[0022] 图6说明由甘氨酸-β-鼠胆酸导致的对利用GW4064的FgfigmRNA诱导的阻断。
[002引图7说明由甘氨酸-β-鼠胆酸导致的对由GW4064导致的A化5g mRNA抑制的倒转。
[0024] 图8描述了根据本发明的实施方案的化合物的合成。
[0025] 图9描述了根据本发明的实施方案的化合物的合成。
[0026] 图10描述了β-鼠胆酸，牛横-β-鼠胆酸(邱MCA)，甘氨酸-β-鼠胆酸，碟去氧胆酸，牛 横碟去氧胆酸(TCA)，和甘氨酸-碟去氧胆酸的结构。
[0027] 图11说明在10周的高脂肪膳食后用赋形剂(vehicle)或tempol处理的FxrWfi和 FxrAiE小鼠的体重增加。
[002引图12说明在14周的高脂肪膳食后FxrfWi和FxrAiE小鼠的W克计和作为体重的百 分数的脂肪量。
[0029] 图13说明在7周的高脂肪膳食后对于Fxrfi/fi和FxrME小鼠的葡萄糖耐量试验 (GTT)的结果。
[0030] 图14说明在13周的高脂肪膳食后对于FxrfWi和FxrME小鼠的膜岛素耐量试验 (ITT)的结果。
[0031] 图15说明在15周的高脂肪膳食后对于Fxr"/f哺Fxr&M、鼠的空腹血糖，空腹血清 膜岛素，和H0M指数。
[0032] 图16描述了在用tempol处理后喂食正常饮食的小鼠中从硬壁菌口（Firmicutes) 向拟杆菌口（Bacteroidetes)的改变。
[0033] 图17描述了正常饮食的和用赋形剂或tempol处理的小鼠的粪便中的硬壁菌口与 拟杆菌口的比例和胆汁盐水解酶酶活性的比较。
[0034] 图18说明使用合成的激动剂GW4064和各种剂量的TUDCA，T ω MCA，邱MCA，TaMCA的 人FXR竞争测定。将结果相对于Reni 1 la表达标准化。
[0035] 图19A显示加权的化iFrac距离的主坐标分析图。圆圈表示赋形剂-处理的小鼠中 的盲肠群落并且正方形表示tempol-治疗的小鼠中的盲肠群落。两组都喂食高脂肪饮食达 10周。
[0036] 图19B-G显示盲肠内容物的属级(genus level)的16S rRNA基因测序分析。数据表 示为平均值±SD。
[0037]图20A显不在喂食局脂肪饮食达14周的赋形剂-和temp〇]_-治疗的小鼠中的尿罔子 的主成分分析(PCA)模型的得分散点图。
[0038] 图20B显示PCA模型中所有检测的尿离子的荷载散点图。p[l]和p[2]值表示各个离 子相对主要成分1和2的贡献权重。具有最高荷载值的两种离子的性质标注在图中。在电喷 雾电离负的模式化sr)中获得所有数据。
[0039] 图20C显示对甲酪硫酸醋和对甲酪葡萄糖巧酸的尿水平。将值相对于赋形剂-处理 的小鼠的那些标准化，并表达为相对丰度。
[0040] 图20D显示对甲酪硫酸醋（下图）和对甲酪葡萄糖巧酸（上图）的串联MS和化学结 构。
[0041] 图21A显示在14周的高脂肪饮食处理后在赋形剂-和tempos治疗的小鼠中的尿离 子的PCA模型的得分散点图。
[0042] 图21B显示在14周的WD后在赋形剂-和抗生素-处理的小鼠中的尿离子的PCA模型 的荷载散点图。P[l]和P[2]值表示各个离子相对于主要成分1和2的贡献权重。具有最高荷 载值的两种离子的性质注释在图中。所有数据在负的模式中化sr)获得。
[0043] 图21C显示在14周的高脂肪饮食处理后在赋形剂-和抗生素-处理的小鼠中的对甲 酪硫酸醋和对甲酪葡萄糖巧酸的尿水平。将值相对于赋形剂-处理的小鼠的那些标准化，并 且表达为相对丰度。n = 5只小鼠/组。所有数据表示为平均值±SD。分析方差，然后双尾 Student's t-检验。与赋形剂-处理的小鼠相比，冲<0.05，*冲<0.01。
[0044] 图22A显示来自喂食高脂肪饮食达14周的赋形剂-和tempos处理的小鼠的肝切片 的代表性的H&E染色。
[0045] 图22B显示来自喂食高脂肪饮食达14周的用赋形剂-和tempol-处理的小鼠的肝切 片的脂滴的代表性的油红0染色。
[0046] 图22C显示来自喂食高脂肪饮食达16周的赋形剂-和tempos处理的小鼠的肝重。
[0047] 图22D显示喂食高脂肪饮食达16周的赋形剂-和tempol-处理的小鼠的肝重与体重 比率。
[0048] 图2沈显示来自喂食高脂肪饮食达16周的赋形剂-和tempos处理的小鼠中的肝甘 油Ξ醋(TG)含量。
[0049] 图23A显示来自喂食高脂肪饮食达16周的赋形剂-和tempos处理的小鼠的肝切片 的代表性的H&E染色。
[0050] 图23B显示来自喂食高脂肪饮食达16周的赋形剂-和tempos处理的小鼠的肝重。 [0051 ] 图23C显示喂食高脂肪饮食达16周的赋形剂-和tempol-处理的小鼠的肝重与体重 比率。
[0052] 图23D显示来自喂食高脂肪饮食达16周的赋形剂-和抗生素-处理的肝TG含量。
[0053] 图24A显示来自喂食高脂肪饮食达7周的赋形剂-和抗生素-处理的小鼠的回肠 PCA 模型的得分散点图。
[0054] 图24B显示喂食高脂肪饮食达7周的赋形剂-和抗生素-处理的小鼠中的回肠离子 的PCA模型的荷载散点图。p[l]和p[2]值表示各个离子相对于主要成分1和2的贡献权重。具 有最高荷载值的两种离子的性质注释在图中。所有数据在负的模式化sr)中获得。
[0055] 图25A显示来自喂食高脂肪饮食达14周的赋形剂-和抗生素-处理的小鼠的回肠中 的个体牛横酸-缀合的胆汁酸与总胆汁酸的比例。
[0056] 图25B显示来自喂食高脂肪饮食达7周的赋形剂-和tempol-处理的小鼠的回肠中 的个体牛横酸-缀合的胆汁酸与总胆汁酸的比例。
[0057] 图26A显示来自喂食高脂肪饮食达7周的赋形剂-和抗生素-处理的小鼠的粪便的 BSH酶活性。η = 4-5只小鼠/组。
[0058] 图2她显示喂食高脂肪饮食达12周的小鼠中的回肠 FXR表达的蛋白质印迹分析。各 个泳道表示一只小鼠。
[0059] 图26C显示来自喂食高脂肪饮食达12周的小鼠的回肠中的Fxr mRNA水平和FXR祀 基因化P和F奸15的mRNA水平。η = 3只小鼠/组。
[0060] 图2抓显示来自喂食高脂肪饮食达7周的赋形剂-和抗生素-处理的小鼠的回肠中 的FXR祀基因化Ρ和巧η 5的mRNA水平。η = 3只小鼠/组。
[0061 ] 图2犯显示用赋形剂，牛横胆酸(TCA)，和牛横酸-β-鼠胆酸(邱MCA)与TCA处理喂食 高脂肪饮食达7周的小鼠24小时后回肠中的FXR祀基因化P和Fgfl 5的mRNA水平。η = 3只小 鼠/组。
[0062] 图27Α显示来自喂食高脂肪饮食达14周的对照-floxed(FxrWfi)小鼠和肠-特异的 敲除小鼠(FxrAiE)小鼠的肝切片的代表性的H&E染色。
[0063] 图27B显示来自喂食高脂肪饮食达14周的Fxr"/f哺FxrAiE小鼠的肝切片中的脂滴 的代表性的油红0染色。
[0064] 图27C显示来自喂食高脂肪饮食达14周的Fxr"/f哺Fxr^iE小鼠的肝重。
[0065] 图27D显示来自喂食高脂肪饮食达14周的和FxrAiE小鼠的肝甘油S醋含 量。
[0066] 图28A显示来自喂食高脂肪饮食达14周的Fxr"/f哺FxrAiE小鼠的回肠粘膜的线粒 体氧化憐酸化(0XP册S)相关的酶的mRNA水平。
[0067] 图28B显示来自喂食高脂肪饮食达7周的赋形剂-和抗生素-处理的小鼠的回肠粘 膜的线粒体氧化憐酸化(0XP册S)-相关基因的mRNA水平。n = 3只小鼠/组。
[006引图28C显示来自喂食高脂肪饮食达12周的Fxr"/f哺FxrAiE小鼠的回肠粘膜的对于 复合物-I-和复合物-II-依赖性的呼吸测量的状态ΠI呼吸。
[0069] 图28D显示喂食高脂肪饮食达7周的FxrWfi小鼠和FxrAiE小鼠的回肠粘膜中的ATP 水平。
[0070] 图29A显示无血清脂肪酸。对于各个脂肪酸的柱(bar),从左到右，来自赋形剂-处 理的小鼠，tempos处理的FxrWfi小鼠，赋形剂-处理的Fxr^iE小鼠和tempos处理的 Fxr^iE小鼠。
[0071] 图29B显示来自喂食高脂肪饮食达7周的赋形剂-和抗生素-处理的小鼠的血清神 经酷胺。n = 3只小鼠/组。
[007^ 图29C显示来自喂食高脂肪饮食达14周的Fxr"/f哺Fxr^iE小鼠的回肠中编码神经 酷胺合成-和分解代谢-相关的酶的mRNA的表达。
[0073]图29D显示在处理喂食高脂肪饮食达14周的小鼠7周抗生素后回肠中编码神经酷 胺合成-和分解代谢-相关的酶的mRNA的水平。
[0074]图30A显示源自神经酷胺的MS片段的结构并且 [00巧]图30B-30G显示各种神经酷胺的串联MS和化学结构。
[0076] 图31A显示喂食高脂肪饮食达3天的赋形剂-和抗生素-处理的小鼠中的肝TG含量。
[0077] 图31B显示喂食高脂肪饮食达14周并且然后用赋形剂或抗生素处理3天的小鼠的 回肠中的Fxr，化I)和F奸15mRNA水平。
[0078] 图31C显示来自喂食高脂肪饮食达14周，并且然后用赋形剂或抗生素处理3天的小 鼠的回肠的神经酷胺的概况。
[0079] 图31D显示用赋形剂和2μΜ，5ιχΜ和lOiiM神经酷胺解育24小时后的原代肝细胞甘油 Ξ 醋(TG)含量(n = 4)。
[0080] 图3化显示用赋形剂和2μΜ、5ιχΜ和lOiiM神经酷胺解育16小时后原代肝细胞中的脂 肪酸合成、甘油Ξ醋合成、和脂肪酸分解代谢相关基因的mRNA水平(从左至右的柱分别针对 各个 mRNA，n = 5)。
[0081 ]图31F显示用赋形剂、W及和ΙΟμΜ神经酷胺解育24小时后原代肝细胞中的核 SREBP1-Ν表达的蛋白质印迹分析(η = 3)。
[0082] 图31G显示用赋形剂W及和1(Μ神经酷胺解育24小时后原代肝细胞中CIDEA表 达的蛋白质印迹分析(η = 3)。
[0083] 图32Α显示来自喂食高脂肪饮食达14周的赋形剂-和抗生素-处理的小鼠的肝中编 码脂肪酸合成和甘油Ξ醋合成相关的酶的mRNA的水平。
[0084] 图32B显示喂食高脂肪饮食达14周的FxrfWi和FxrAiE小鼠的肝中编码参与脂肪酸 和甘油Ξ醋合成的酶的mRNA的表达。
[0085] 图32C显示来自喂食高脂肪饮食达7周的小鼠的肝中脂肪酸氧化-相关的基因的 mRNA水平。
[0086] 图32D显示来自喂食高脂肪饮食达14周的FxrfWi小鼠和FxrAiE小鼠的肝中的脂肪 酸氧化-相关的基因的mRNA水平。
[0087] 图32E显示来自喂食高脂肪饮食达7周的赋形剂-和抗生素-处理的小鼠的肝中的 SREBP1-N蛋白表达的蛋白质印迹分析。LAMIN A/C用作上样对照(η = 3)。
[008引图32F显示喂食高脂肪饮食达7周的赋形剂-和抗生素-处理的小鼠的肝中CIDEA蛋 白表达的蛋白质印迹分析。β-肌动蛋白用作上样对照(η = 3)。
[0089] 图32G显示喂食高脂肪饮食达7周的赋形剂-和抗生素-处理的小鼠的肝中的 Cyp7almRNA 水平（η = 3)。
[0090] 图32Η显示喂食高脂肪饮食达7周的赋形剂-和tempol-处理的小鼠的肝中的 Cyp7almRNA 水平（n = 3)。
[0091] 图321显示喂食高脂肪饮食达7周的赋形剂-和抗生素-处理的肝中的炎症相关的 基因的mRNA水平(n = 3)。
[0092] 图32J显示喂食高脂肪饮食达7周的赋形剂-和tempol-处理的小鼠的肝中的炎症 相关的基因的mRNA水平(η = 3)。
[0093] 图33Α显示来自喂食高脂肪饮食达14周的赋形剂-和抗生素-处理的FxrfWi和Fxr AIE小鼠的肝切片的代表性的H&E染色。
[0094] 图33B显示来自喂食高脂肪饮食达14周的赋形剂-和抗生素-处理的FxrfWi和Fxr AIE小鼠的肝切片中的脂滴的油红ο染色。
[ΟΟΜ]图33C显示喂食高脂肪饮食达14周的赋形剂-和抗生素-处理的FxrfWi和FxrAiE小 鼠的肝重。
[0096] 图33D显示喂食高脂肪饮食达14周的赋形剂-和抗生素-处理的FxrfWi和FxrAiE小 鼠的肝重与体重比率。
[0097] 图33E显示喂食高脂肪饮食达14周的赋形剂和抗生素-处理的FxrfWi和FxrAiE小 鼠的肝甘油Ξ醋含量。
[0098] 图33F显示喂食高脂肪饮食达14周的赋形剂-和抗生素-处理的FxrfWi和FxrAiE小 鼠的回肠中神经酷胺的脂类组学概况(从左到右的柱分别针对各个神经酷胺）。
[0099] 图33G显示来自喂食高脂肪饮食达14周的赋