(杆菌 肤，新霉素和链霉素的组合)研究，雄性巧7BL/6N小鼠从6周龄开始喂食高脂肪饮食（"HFD) 并且施用饮用水中的0.1 % (w/v)的各个化合物(杆菌肤，新霉素和链霉素的组合）。对于 tempol研究，雄性巧7BL/6N小鼠从6周龄开始喂食HFD并施用饮用水中的0.064%(w/v) tempol。对于体内邱MCA，雄性巧7BL/6N小鼠从6周龄开始喂食Η抑并且用抗生素(0.1 %的杆 菌肤，新霉素，和链霉素组合的各个化合物)处理3天。将赋形剂(盐水），TCA(400mg/kg体重， 溶解于盐水)或TCA和邱MCA的组合(400mg/kg体重的各个化合物，溶解于盐水）口服施用给 小鼠并且在1化后第二次剂量给药。2h后处死小鼠，收集组织。对于Gly-MCA研究，定制合成 Gly-MCA。如所述的制备熏肉风味的面团丸(Walker等人，Toxicol .Appl .Pharmacol. 260: 65-69,2012)，用于口服施用Gly-MCA(0.25mg Gly-MCA/丸，lOmg/kg的剂量）。训练小鼠食用 面团丸，然后研究。为了预防肥胖、膜岛素抗性和NA化D，为6-至8-周龄的雄性野生型(WT) C57BL/6N小鼠，从6周龄开始喂食高脂肪饮食(Bio-Serv，Frenchtown，NJ; 60千卡％脂肪）， 并口服施用赋形剂(对照丸）或Gly-MCA(0.25mg/丸/天，剂量lOmg/kg)。给喂食高脂肪饮食 达12周的C57BL/6N小鼠施用(0.25mg Gly-MCA/丸，5mg/kg的剂量）。给喂食饲料khow)的6- 至8-周龄的瘦蛋白缺陷的化/化小鼠施用Gly-MCA(0.25mg/丸/日，lOmg/kg)。将小鼠分别安 置在它们的笼内。在6至7周的HFD的赋形剂和Gly-MCA-处理的小鼠中测量累积的食物摄取 和TEEbai达1 周。如前所述测量TEEbai(Ravussin等人，Int. J. Obesity37:399-403，2013)。
[0335] 所有动物研究根据由NCI动物护理及使用委员会（NCI Animal Care and Use Committee)批准的实验动物资源研究所（Institute of LaboratoiT Animal Resources) 指导原则进行。
[0336] 原代肝细胞的制备和培养
[0337] 来自6-周龄C57BL/6N小鼠的原代肝细胞通过胶原酶1 (Invi trogen，Carlsbad，CA) 灌注获得。将细胞通过45%化rcoll(Sigma，St丄ouis，M0)密度离屯、纯化并且在具有10%胎 牛血清和1 %膜岛素-转铁蛋白-砸-乙醇胺（ITS-X) (Invitrogen，Carlsbad，CA)的DMEM (Invitrogen,Carlsbad，CA)中培养。肝细胞的存活力使用台吩蓝染料排除确定，并且使用 具有高于85%存活力的那些。在培养4小时后将培养基改为具有1 %胎牛血清的DMEM。饥饿4 小时后，将细胞暴露于神经酷胺。在预定的时间点，收获细胞并且进行qPCR分析和TG含量检 测。
[0338] RNA 分析
[0339] 轻轻地刮下肠的粘膜并且取肝，并且将二者快速冷冻在液氮中并且储存在-80°C， 直到制备RNA。从冷冻的肠和肝，使用TRIZO1试剂（Invi trogen，Car 1 sbad，CA)提取RNA。从化 g 总RNA使用 Super script 11 逆转录酶（Invitrogen，Carls bad，CA)合成cDNA。利用 qPrimerDepot设计qPCR引物。将测量的mRNA水平相对于18S核糖体RNA的那些标准化，并且 表达为相对于对照组的那些的倍数变化。
[0340] 蛋白质印迹分析
[0%1] 制备肝全细胞或核提取物。将膜与针对FXR的抗体（Santa Cruz Biotechnology， Inc.，Santa Cruz,CA),针对SREBPl的抗体（BD Biosciences，San Jose,CA),和针对CIDEA 的抗体(Abeam, Cambridge，MA)解育。将获得的信号相对于全细胞提取物的β-肌动蛋白 (Abeam)和核提取物的LAMIN A/C(Santa Cruz)标准化。
[0342] 肠微生物群系的16S rRNA基因测序
[cm3] 粪便和盲肠内容物中的细菌使用PowerSoil DM Isolation试剂盒（Mo Bio laboratoiT，Inc .，Ca;rlsbad，CA)提取。PCR产物（大约 1000bps)，使用Agencourt AM化re technology(Beckman Coulter,Brea,CA)，如454Technical Bulletin#2011-002,短片段去 除程序（Sho;rt Fragment Removal Procedure)中所述的纯化。纯化后，产物通过Qubit 化if e tech, Carlsbad，CA)和qPCR 二者，使用ΚΑΡΑ Biosystems LibraiT定量试剂盒 化apaBiosystems，Wobu;rn，MA)定量，基于摩尔量汇集，在1 %琼脂糖凝胶上运行并提取。用 QIAquick PCR 纯化试剂盒（Qiagen，Valencia，CA)纯化后，使用在Agilent 2100Bioanalyze;r(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)上的DNA 7500Lab畑ip和 Qubit定量评价质量和数量。使用四分之一ΡΤΡ板在454 Life Sciences基因组测序仪化X+ (Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)上进行测序。16S rRNA基因测序分析如在前所述 进行(Xozupone和Knight ,ΑρρΙ .linviron.Microbiol. 71:8228-8235,2005)。在Gala巧基于 网络的平台上进行加权的化iFrac分析W评价细菌丰度的改变（Blankenberg等人， Bioinformatics 26:1783-1785,2010;Goecks等人，Genome Biol. 11:126,2010;Giardine 等人，Genome Res. 15:1451-1455,2005)。
[0344] 宏基因组学数据分析
[0345] 质量过滤和重复数据删除后，各个样品含有平均11，000个读值。Mothur软件包用 于预处理测序数据并且RDP多重分类器用来将各个序列分配到分类的层级。预处理由对20 的平均质量进行过滤读值，去除重复序列和通过条形码分开样品同时允许条形码中的一个 错配组成。为了说明每个样品的总的读值的差异，将分类转变为总读值的百分数。然后将该 方法在组内和组间精确比较。
[0346] 代谢组学分析
[0347] 脂类组学分析:对于血清脂类组学分析，通过含有作为内标的2μΜ LPC(17:0)，PC (17:0)，SM( 17:0)和CER( 17:0) (Avanti 化lar Lipids，Alabaster，AL)的4-倍的冷氯仿：甲 醇（2:1)溶液提取25μ1血清。将样品满旋30s并且随后在室溫静置5分钟。将混合物在13， 0(K)rpm离屯、5min并且随后收集下层有机相并在室溫在真空下蒸发。将残留物溶解于氯仿： 甲醇（1:1)，然后用含有2μΜ PC( 17:0)的异丙醇：乙腊:出0(2:1:1)稀释，之后UPLC-MS分析。 对于组织脂类组学分析，将约50mg的精确称量的组织用7(Κ)化甲醇:此0(4:3)溶液匀浆并随 后使用800化含作为内标的2μΜ 1?(：(17:0)，51(17:0)和〔61?(17:0)的氯仿提取。将匀浆在37 °C解育20分钟，然后在13,000rpm离屯、20分钟。将下层有机相转移至新的管中并在真空下干 燥。将残留物用1(Κ)化氯仿：甲醇（1:1)溶液悬浮并随后用含2μΜ PC(17:0)的异丙醇：乙腊： 此0(2:1:1)溶液稀释，之后注射。对于脂类组学发现，将样品通过UPLC-ESI-QT0FMS，使用 Water Acquity C細 1.7um C18柱（2.1x100mm)，在W下条件分析：UF*LC:A-乙腊/水（60/ 40)，B-异丙醇/乙腊(90/10) dA和B二者都含有lOmM乙酸锭和0.1 %甲酸。梯度:初始的60%A 至2分钟时的57%A，至2.1分钟*时的50%A，至12分钟时的46%A，至12.1分钟*时的30%A， 至18分钟时的1%A，之后在18.5分钟时回到初始条件，平衡另外2分钟(*表示激增的梯度）。 流速是0.4ml/min。柱溫度维持在55°CdMS，与上述相同的条件，除了运行时间为18分钟W 外。
[0348] 整体代谢组学分析：尿样品通过将20化的尿加入180μΙ 50%乙腊水溶液（50: 50 水/乙腊）中来制备。将样品满旋5分钟并在18000 X g在4°C离屯、20分钟W去除微粒和沉淀的 蛋白。将上清转移到自动采样瓶中用于分析。将50mg组织样品在500mL含有扣Μ氯横丙脈（内 标)的50%乙腊水溶液中匀浆。将样品满旋并在在13,000rpm在4°C离屯、20分钟W去除微粒 和沉淀蛋白。将上清转移到自动采样瓶中用于分析。对于代谢组学的发现，5μ1上清样品等 分部分注射入具有Waters Acquity 邸Η 1.7um C18(2.1x50mm)柱的UPLC-ESI-QT0FMS系统 (Waters,Milford,ΜΑ)。梯度流动相包含水中的0.1 %甲酸(A)和乙腊中0.1 %甲酸(B)。将梯 度维持在初始95%A达0.5分钟，至在4分钟时的40%A，并且随后至在8分钟时的1%A。将柱 冲洗Imin，然后在初始条件下平衡1.5min。流速是0.5ml/min。柱溫度维持在60°C eWaters Synapt HDMS Q-TOF在正和负模式下进行，扫描50-850amu，WO.3次扫描/秒的速率。使用W 下仪器条件：毛细管3kV，来源溫度120°C，采样小凹（cove)30V，脱溶剂气流85化/h，在400 °C。生物标志物识别和定量:通过分析负载散点图中的离子筛选生物标志物，并且检索代谢 组学数据库(ME化IN和Madison代谢组学数据库似找到可能的候选物。为了确认推定的标 志物的特性，基于MS/MS片段化模式和保留时间将可信的标准与代谢物相比较。代谢物的浓 度通过通过反应监控质谱，基于标准曲线，使用可信标准确定。
[0349]数据处理和多元数据分析
[03加]色谱和光谱数据通过1日'4日仕7^软件(￥日1日'3)解析((1日(3〇醇〇1111日(1)。通过质屯、算 法，去同位素化(deisotoping)，过滤，峰识别和积分产生含有样品特性，离子特性(保留时 间和m/z)，和离子丰度的信息的多元数据矩阵。各个离子的强度通过将单个离子相对于整 个色谱图中的总离子数标准化来计算。进一步将数据矩阵输出到SIMCA-P软件(Umetrics， KinneIon，NJ)中并且通过均值中屯、化(mean-centering)和佩瑞多换算(pareto scaling) 转变，其是增加低丰度离子的重要性而不显著扩大噪声的技术。建立包括主成分分析 (PCA)，偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)，W及正交投影与潜在结构-判别分析(0PLS-DA) 的统计模型W表示数据矩阵中主要的潜在变量。
[0巧1] 基于NMR-的代谢组学实验
[0；3对甲醇，K2HPO4，Na出P04(所有都是分析级的），3-S甲基甲娃烷基[2，2，3，3-d4]丙酸 钢(TSP-d4)和〇2〇(99.9%在D中）购自Sigma-Al化ich(St丄ouis，M0)。因为其良好的可溶性 和低溫稳定性，利用拉册0和Na此P〇4制备憐酸盐缓冲液(0.1M K2HPO4/化出P〇4并且PH 7.4)。 用0.61111 600化预冷的甲醇-水混合物（2/1，￥八），使用？'6〔61173组织匀浆器（1361'1:;[]1 Technologies，Rockville，MD)提取肝样品（~50mg)Ξ次。在4°C在11180xg离屯、10分钟后， 将合并的上清干燥。将各个水性提取物分开在60化L含有50 %化0和0.005 % TSP-d4(化学位 移参照）的憐酸盐缓冲液中恢复。离屯、后，将55化L的各个提取物转移到5mm NMR管中。使用 在前描述的优化的步骤直接提取盲肠内容物样品(Wu等人，2010)。简言之，将样品（~50mg) 与60化L预冷的憐酸盐缓冲液混合，满旋30s并且进行Ξ次连续冻融，然后使用Precellys? 组织匀浆器进行匀浆。离屯、（ll，180x g，4°C)10min后，将上清(550化)转移到5mm用于NMR分 析的NMR管中。
[0；353] 1h NMR谱学
[0354] 在298K在装有化址er反向低溫探针（Br址er Biospin，Ge;rmany)的化址er Avance III 850MHz分光计(对于IH在850.23MHz操作）上记录水性肝和粪便的提取物的1h醒R谱。 对于所有样品中的每一个，使用N0ESY脉冲序列(N0ESYPR1D)的第一增量获得典型的一维 醒R谱。为了抑制水信号，在循环延迟(2s)和混合时间（100ms)期间将弱的连续波福射应用 于水峰。对于各个样品，将90°脉冲宽度调节至大约lOys，并且对于各个谱，将64个瞬时收集 在32k数据点中，谱宽为20ppm。为了促进NMR信号分配，获得一系列2D NMR谱，并且对选择的 样品如前所述加工(Dai等人，2010;Ding等人，2009)，包括1h-1h关联能谱法(C0SY)，1h-1h总 关联能谱法(T0CSY)，1h-13C异核单量子关联化SQC)，和4-1?异核多键关联谱(HMBC)。
[03W]谱数据加工和多元数据分析
[0356]所有自由感应衰减(FID) W指数函数，WlHz线扩张因子增加，之后傅里叶变换。对 于相和基线失真，手动校正1h NMR谱，并且使用AMIX软件包（V3.8，Bruker-Biospin， Germany)将谱区域δΟ.5-9.5W0.004ppm的等宽（2.4Hz)结合入区域中。区域δ4.45-5.20W 不完美的水饱和度抛弃。对于小鼠解剖过程中盲肠内容物中的乙醇污染，也去除区域δ 1.15-1.23和δ3.62-3.69。各个桶状(bucketed)区域随后相对于谱积分的总和标准化，W补 偿总体浓度差异，之后统计数据分析。
[0357] 利用SIMCAP+软件(版本13.0，111116化;[。3,5￥6(16]1)进行多元数据分析。主成分分析 (PCA)最初在醒R上进行W产生概览和评价数据质量。随后在NMR数据上进行正交投影与潜 在结构判别分析(0化S-DA)。使用7-倍交叉核实方法确认0PLS-DA模型，并且模型的质量通 过参数R2X和Q2值描述。为了促进结果的解释，进行由0PLS-DA产生的负载的反转换 (Cloarec等人，Anal. Chem. 77 :517-526,2005)，之后产生负载曲线，使用内部开发的用于 MATLAB(The Ma1:hworks Inc. ;Natwick，MA)的脚本，将其用变量（或代谢物）的化arson线性 关联系数颜色编码。在该研究中，选择基于判别差异对于相关系数选择|r|〉0.811(r〉0.755 和六-0.755)的截取值(州toff value)为显著的（P < 0.05)。
[0358] 胆汁盐水解酶活性
[0359] 使用超声从抑7.4憐酸盐缓冲的盐水(PBS，5.OmL)中的粪便样品（0.5g)制备粪便 的蛋白。基于从粪便中的TCDCA的CDCA的产生测量胆汁盐水解酶(B甜)活性。简言之，在20化 L的终体积中含有0.1mg/ml粪便的蛋白和50μMTCDCA-d5的3mM乙酸钢缓冲液，pH5.2中进 行解育。在37°C解育20分钟后，通过将样品插入干冰中来终止反应。将10化L的乙腊直接加 入反应混合物中。在14,000x g离屯、20min后，将扣L的上清转移到自动采样瓶中，通过偶联 有XEV0S重四极杆串联质谱仪的UPLC系统(Waters Co巧.，Milford，M)进行分析。
[0360] 线粒体分离和功能研究
[0361] 对于肠线粒体，轻轻刮下回肠的粘膜，用PBS洗涂2X，在含有0.2%BSA的冰冷的线 粒体匀浆缓冲液（225mM甘露醇，75mM薦糖，5mM M0PS，0.5mM EGTA和2mM牛横酸(pH 7.25)) 中揽碎，并且在松配合的匀浆器中匀浆。将匀浆在500xg在4°C离屯、10分钟。然后将上清在 10，000xg在4°C离屯、10分钟。将最终线粒体沉淀W0.5mg/ml的浓度重悬在含有0.2%BSA的 线粒体分离缓冲液，之后进行功能评价。
[0362] 在25°C在与Clark-型〇2电极（Instech)和〇2监测仪(Model 5300，YSI Inc)连接的 小室中测量分离的线粒体的氧消耗。将线粒体在呼吸缓冲液（120mM KCl，5mM M0PS，0.1 mM EGTA，5mM Κ此Κ)4和0.2%BSA)中与用于复合物I(5mM谷氨酸盐和5mM苹果酸盐），或复合物II (5mM班巧酸盐和ΙμΜ鱼藤酬）的底物解育。在加入ImM ADP后测量状态3(最大）呼吸活性。加 入2μΜ寡霉素后监测依赖性的呼吸活性(状态4)中的ADP。通过状态3/状态4呼吸比率确定呼 吸控制比率。
[0363] 组织学分析
[0364] 使用标准方案在福尔马林固定的石蜡切片上进行苏木精和伊红化&Ε)染色。使用 标准方案在冷冻肝切片上进行油红0染色。对于每只小鼠，评价至少Ξ个不连续肝切片。
[0365] 甘油Ξ醋含量定量
[0366] 使用2:1氯仿-甲醇溶液提取肝脂。利用甘油Ξ醋比色测定试剂盒，根据制造商的 建议（Bioassay Systems,化yward，CA)测量肝甘油Ξ醋。
[0367] 细胞培养
[0368] 按照之前描述的方法将化c〇-2(ATCC?HTB-37?)细胞诱导分化(Ferraretto等人， Anticancer Res. 27:3919-3925，2007)。将分化的Caco-2细胞用具有1 %胎牛血清的DMEM培 养基解育8小时，并随后暴露于Gly-MCA/CDCA/GW4064达24小时。使用TRIzol试剂 (Invitrogen)从冷冻的肠提取RNA。从lyg总RNA使用Super scr ipt 11逆转录酶 (Invitrogen)合成 cDNA。
[0369] 通过肠道细菌Gly-MCA径基化
[0370] 从抑7.4PBS(5.0ml)中的粪便的样品（0.5g)使用超声制备粪便的蛋白。在200ml 终体积的中的含有0.1 mg/ml粪便的蛋白和50μΜ Gly-MCA或Τ-β-MCA的3mM乙酸钢缓冲液，pH 5.2中进行解育。在37°C20-min解育后，将样品插入干冰中W终止反应。将100化甲醇直接加 入到100ml反应混合物中。在14,000g离屯、20min后，将5ml的上清转移到自动采样瓶中，通过 偶联有XEV0S重四极杆串联质谱仪的UPLC系统(Waters Co巧.，Milford，M)进行分析。
[0371] 动物研究
[0372] 高脂肪膳食(HFDK60%千卡由脂肪组成)购自Bioserv.IncXly-MCA定制合成。
[0373] 如所述的（Wa化er等人，Toxicol.A卵 1.曲armacol .260:65-69,2012)制备熏肉风 味的面团丸，用于日服施用Gly-MCA(0.25mg Gly-MCA/丸）。训练小鼠食用面团丸，然后研 究。
[0374] 为6-至8-周龄的雄性野生型(WT)C57BL/6N小鼠，从6周龄开始喂食HFD(Bi〇-Serv， Frenchtown，NJ;60千卡％脂肪），并口服施用赋形剂（对照丸）或Gly-MCA(0.25mg/丸/天， lOmg/kg)。将小鼠分别安置在它们的笼内。在6至7周的Η抑的赋形剂和Gly-MCA-处理的小鼠 中测量累积的食物摄取和TEEba地1周。如前所述测量TEEbai(Ravussin等人，Int. J.Obesity 37 :399-403,2013)。所有动物研究根据由NCI动物护理及使用委员会(NCI Animal Care and Use Committee)批准的实验动物资源研究所（Institute of LaboratoiT Animal Resources)指导原则进行。
[0375] 代谢测定
[0376] 对于葡萄糖耐量试验(GTT)，将小鼠禁食16h，抽血，并且将小鼠用Ig/kg葡萄糖腹 膜内（i.P.)注射。对于膜岛素耐量试验（ITT)，将小鼠禁食地，抽血，并且随后用膜岛素巧li Li 1 ly，Washington，DC)，通过腹膜内，W lU/kg体重的剂量注射。在注射后15，30，60，和90分 钟采集血液样品，并且使用血糖测试仪(Bay er，P i 11 sbu巧h，PA)测量葡萄糖。
[0377] 实施例1
[0378] 该实施例表明，牛横-β-鼠胆酸（TMCA)在原代小鼠肝细胞中括抗由牛横胆酸 (TCA)导致的FXR激活。
[0379] 将来自和鼠的原代肝细胞用PGL4-Shp-TK蛋火虫巧光素酶构建体和 对照质粒地化-SV40转染。24h后，将细胞用100μΜ牛横胆酸（TCA)，TMCA，或邱MCA与TCA处 理。裂解细胞，并且如本文所述测量巧光素酶活性。结果描述在图1中。
[0380] 如在图1中所述的结果中显而易见的，TMCA在来自小鼠的原代肝细胞中括 抗由TCA导致的FXR激活，但在来自小鼠的原代干细胞中不是如此。
[0381] 实施例2
[0382] 该实施例表明，邱MCA在化CO-2细胞中括抗由TCA导致的F邸激活。
[0383] 化CO-2细胞用PGL4-Shp-TK蛋火虫巧光素酶构建体，对照质粒地化-SV40,和人FXR W及人ASBT表达质粒转染。24h后，将细胞用100μΜ TCA，TMCA，或邱MCAW及100μΙ 100μΜ TCA处理。裂解细胞，并且如本文所述测量巧光素酶活性。结果描述在图2中。
[0384] 如在图2中所述的结果中显而易见的，邱MCA在化CO-2细胞中括抗由TCA导致的FXR 激活。
[03化]实施例3
[0386] 该实施例表明，与小鼠相比，在14周的高脂肪膳食后，在FxrAiE小鼠中，小 鼠回肠粘膜中的ATP水平显著升高。
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