具有抑制TGF-β受体活化的活性的化合物、该化合物的筛选方法、以及用于预防或治疗由...的制作方法

专利名称：具有抑制TGF-β受体活化的活性的化合物、该化合物的筛选方法、以及用于预防或治疗由 ...的制作方法
技术领域：
本 发明涉及具有抑制TGF-P受体活化的活性的化合物、以及该化合物的筛选方法，更详细地说，涉及具有通过抑制NS3蛋白酶与I型TGF- ^受体的结合，来抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-P受体活化的活性的化合物，以及该化合物的筛选方法。
背景技术：
肝硬化在日本作为死亡原因是第9多(厚生劳动省“平成21年人口动态统计月报年计的概况”)，有约30万人的患者和约350万人的肝炎患者预备军。该疾病是肝组织由于细胞外基质蛋白质的异常蓄积而硬化的难治之症，肝硬化(肝纤维化)在肝损伤与再生反复进行的过程产生，作为结果肝细胞陷入细胞凋亡，呈现出形成肝衰竭的一系列病态。作为引起该肝纤维化的主要原因，已知作为细胞因子的I种的TGF-P的活化(非专利文献I)。肝硬化时，存在于肝血窦与肝实质细胞之间的肝星状细胞被活化，过量产生以胶原蛋白为代表的细胞外基质。在动物模型中显示了促进该胶原蛋白等的过量产生的是TGF-P，通过基因治疗等终止TGF-P的作用则能防止肝硬化(非专利文献2)。进而，由陷于肝硬化的肝脏以每年5 7%的频率发生肝癌而至死。在这里，由TGF-P引起的介由EMT (上皮间充质转换)的诱导和/或控制性T细胞诱导的癌免疫的低下可以说是一个原因(非专利文献3)。另外，日本的肝硬化的76%是由于丙型肝炎病毒(HCV)感染，HCV感染者据说仅在日本国内推测就有200万人，在世界约有2亿人。感染HCV则经过10年 30年发生肝硬化，进而转为肝癌，因此成为较大社会问题。针对这样的状况，现在，主要采用PEG修饰干扰素与利巴韦林的合并使用疗法，在40 50%的患者中确认了除去病毒的效果。进而开发了病毒粒子的成熟化所必须的丝氨酸蛋白酶NS3的蛋白酶活性抑制剂，并进行II III期试验(非专利文献4 5)。但是，对于HCV引起肝纤维化或肝癌的机理尚未阐明，因此依然没有完成开发出能够根治治疗该病毒性疾病的物质。现有技术文献非专利文献非专利文献I:Friedman SI，Gastroenterol, 2008 年 5 月，134 (6),第 1655-69 页非专利文献2:Friedman SI, Physiol Rev.，2008 年 I 月，88 卷，I 号，第 125-172页非专利文献3:Massague J，Cell，2008 年 7 月，134 卷，2 号，第 215-230 页非专利文献4:Nature Reviews Drug Discovery, 2009 年 I 月，8 卷，I 号，第 11 页非专利文献5:Nature Reviews DrUg Discovery, 2010 年 7 月，9 卷，7 号，第501-503 页

发明内容
发明要解决的课题本发明鉴于上述现有技术中存在的课题而完成的，其目的在于，提供:能抑制由HCV引起的TGF-P受体活化的化合物、该化合物的筛选方法、以及用于预防或治疗由丙型肝炎病毒引起的疾病的组合物。用于解决课题的方法本发明者们为了实现上述目的而反复进行了深入研究，结果发现，来源于HCV的NS3蛋白酶与I型TGF-P受体结合、以及通过该结合使TGF-P受体被活化。另外，还发现通过该活化，促进成为肝纤维化的主要原因的肝星状细胞及肝细胞中的胶原蛋白产生。进而发现，鉴定NS3蛋白酶与I型TGF- P受体的结合位点，通过识别这些结合位点的抗体，能抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-P受体的活化，从而完成了本发明。本发明，更详细地说提供以下的发明。(I) 一种化合物，其具有以下活性:通过抑制NS3蛋白酶与I型TGF-P受体的结合，来抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-P受体活化。(2)根据(I)所述的化合物，其对NS3蛋白酶或I型TGF-P受体具有结合活性。(3)根据⑵所述的化合物，其对包含序列号I 6的任一项所记载的氨基酸序列的肽具有结合活性。(4)根据⑴ (3) 的任一项所述的化合物，其是针对NS3蛋白酶或I型TGF-3受体的抗体。(5) 一种用于预防或治疗由丙型肝炎病毒引起的疾病的组合物，其含有权利要求1 4的任一项所述的化合物作为有效成分。(6) 一种具有抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-P受体活化的活性的化合物的筛选方法，其包括以下的(a) (C)的工序:(a)在被检化合物的存在下，使NS3蛋白酶与I型TGF-P受体接触的工序，(b)检测NS3蛋白酶与I型TGF-P受体的结合的工序，(c)选择抑制上述结合的化合物的工序。(7) 一种具有抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-P受体活化的活性的化合物的筛选方法，其包括以下的(a) (C)的工序:(a)在被检化合物的存在下，使NS3蛋白酶与I型TGF-P受体接触的工序，(b)检测由NS3蛋白酶引起的TGF-P受体的活化的工序，(c)选择抑制上述活化的化合物的工序。(8) 一种抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-P受体的活化的方法，其特征在于，抑制NS3蛋白酶与I型TGF-P受体的结合。(9) 一种用于预防或治疗由丙型肝炎病毒引起的疾病的方法，其特征在于，抑制NS3蛋白酶与I型TGF-P受体的结合。发明的效果根据本发明，可提供能抑制由HCV引起的TGF-P受体的活化的化合物、以及其筛选方法，进而可提供用于预防或治疗由丙型肝炎病毒引起的疾病的组合物。


图1是显示NS3蛋白酶具有TGF-@ 2样抗原活性的图。图2是显示通过NS3蛋白酶而使TGF-P信号被活化的图。图3是显示通过NS3蛋白酶而促进胶原蛋白的产生的图。图4是显示推测的NS3蛋白酶与I型TGF-P受体的结合部位的图。图5是显示NS3蛋白酶中的、与I型TGF-P受体的预测结合位点及预测接触残基的氨基酸序列的图。图6是显示I型TGF-P受体中的、与NS3蛋白酶的预测结合位点及预测接触残基的氨基酸序列的图。 图7是显示在将各抗体与NS3蛋白酶同时添加于X9CAGA/CCL64细胞这样的条件下，通过与各预测结合位点结合的、抗I型TGF-P受体抗体及抗NS3抗体，而抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-P信号的活化的图。图8是显示在将各抗NS3抗体和NS3蛋白酶进行预温育这样的条件下，通过抗NS3抗体，而抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-P信号的活化的图。图9是显示在将各抗NS3抗体和NS3蛋白酶进行预温育这样的条件下，通过抗NS3抗体，而抗体用量依赖性地抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-P信号的活化的图。图10是显示在将各抗I型TGF- ^受体抗体和X 9CAGA/CCL64细胞进行预温育这样的条件下，通过抗I型TGF-P受体抗体，而抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-P信号的活化的图。图11是显示在将各抗I型TGF- ^受体抗体和X 9CAGA/CCL64细胞进行预温育这样的条件下，通过抗I型TGF-P受体抗体，而抗体用量依赖性地抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-P信号的活化的图。图12是显示通过不识别预测结合位点的抗TGF-P 2抗体等，不能抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-P信号的活化的图。图13是显示在将各抗NS3抗体与TGF- ^ 2进行预温育这样的条件下，通过抗NS3抗体，不能抑制由TGF-P 2引起的TGF-P信号的活化的图。图14是显示在将各抗I型TGF- ^受体抗体和细胞(Importer Assay (报告检测)系)进行预温育这样的条件下，通过抗I型TGF-P受体抗体，而部分地抑制由TGF-P 2引起的TGF-P信号的活化的图。图15是显示由NS3蛋白酶促进的胶原蛋白的产生，被抗NS3单克隆抗体(el211、e0458、s0647、P3-g0899，P3_gl390)抑制的图。
具体实施例方式本发明的化合物的特征在于，具有以下活性:通过抑制NS3蛋白酶与I型TGF-3受体的结合，来抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-P受体活化。NS3蛋白酶是来源于丙型肝炎病毒(HCV)的非结构蛋白质的I种，包含631氨基酸。N端包含蛋白酶结构域、C端包含解螺旋酶结构域。作为蛋白酶结构域及解螺旋酶结构域的典型例子，可分别举出包含由GenBank ACCESSION N0.AAB27127.1所特定的蛋白质的1056 1204氨基酸的肽和包含1224 1455氨基酸的肽。另外，I型TGF- ^受体与II型TGF- ^受体、及作为这些受体的配基的TGF- ^结合而形成复合体，作为来源于人的典型例子，可举出由GenBank ACCESSION N0.BAG63449.1所特定的蛋白质。进而，在本发明中，所谓TGF-P受体的活化，是指成为以下状态:TGF-0受体通过形成复合体而能产生向下游的信号转导。通过该信号转导，可产生例如:该复合体的形成后产生的I型TGF-P受体的磷酸化、由被磷酸化的I型TGF-P受体而引起的Smad2/3的磷酸化、被磷酸化的Smad2/3与Smad4的复合体的形成、该Smad复合体向核内的移动、由移动至核内的Smad复合体引起的祀基因的转录活化。另外，本发明中的“抑制”包含完全的抑制(阻碍)及部分的抑制两者。另外，作为本发明的化合物，只要是能通过抑制NS3蛋白酶与I型TGF-P受体的结合来抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-3受体的活化的物质，则没有特别限制，从抑制该结合这样的观点出发，优选对NS3蛋白酶或I型TGF-P受体具有结合活性的化合物，更优选对包含下述序列号I 6的任一项所记载的氨基酸序列、即NS3蛋白酶与I型TGF-P受体的结合位点的肽具有结合活性的化合物。进而，作为本发明的化合物，从不影响由TGF-3 2引起的活化、特异性地抑制NS3蛋白酶与I型TGF-P受体的结合这样的观点出发，特别优选对包含下述序列号I 3的任一项所记载的氨基酸序列的肽具有结合活性的化合物。TGRDKNQVEGEVQVVSTATQS (序列号 I)
TNVDQDLVGWPAPPGARSLTP (序列号 2、RGDNRGSLLSPRPVSYLKGSS (序列号 3)FVSVTETTDKVIHNSM (序列号 4)IAEIDLIPRDRPFV (序列号 5)CAPSSKTGSVITTY(序列号 6)另外，序列号I 3所记载的氨基酸序列表示NS3蛋白酶侧的结合位点，序列号4 6所记载的氨基酸序列表示I型TGF-P受体侧的结合位点。本发明的化合物的I种方式为抗体。本发明中的“抗体”包含免疫球蛋白的所有类及亚类。“抗体”包含多克隆抗体、单克隆抗体，另外，也包含抗体的功能性片段的形式。另外，本发明的抗体包含嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、及这些抗体的功能性片段。作为抗体的功能性片段，可举出Fab、Fab’、F(ab’)2、可变区片段(Fv)、二硫键Fv、单链FV(scFv)、sc (Fv) 2、双体抗体(Diabody)、多特异性抗体及它们的聚合物等。在将本发明的抗体作为药物施与人的情况下，从降低副作用的观点出发，优选嵌合抗体、人源化抗体、或人抗体。抗体如果是多克隆抗体，则可用抗原(上述炎症性细胞因子等)将免疫动物进行免疫，由其抗血清通过现有的方法(例如，盐析、离心分离、透析、柱层析等)进行纯化来获得。另外，单克隆抗体可通过杂交瘤法、重组DNA法等来制作。嵌合抗体例如可以如下获得:用抗原对小鼠进行免疫，由该小鼠单克隆抗体的基因切下与抗原结合的抗体可变部(可变区)，与来源于人骨髓的抗体恒定部(恒定区)基因结合，通过将其插入表达载体丙导入宿主使嵌合抗体产生(例如，日本特开平7-194384号公报、日本特许3238049号公报、美国专利第4816397号公报、美国专利第4816567号公报、美国专利第5807715号公报)。人源化抗体例如可通过将非来源于人的抗体的抗原结合部位(CDR)的基因序列移植于人抗体基因(⑶R移植)来制作(例如，参照日本特许2912618号、日本特许2828340号公报、日本特许3068507号公报、欧洲专利239400号公报、欧洲专利125023号公报、国际公开90/07861号公报、国际公开96/02576号公报)。人抗体例如可以利用可生产人抗体谱的转基因动物(例如小鼠)来制作(例如，Nature, 362:255-258 (1992)、Intern.REV.1mmunol, 13:65-93 (1995)、J.Mo 1.biol, 222:581-597(1991)、Nature Genetics, 15:146-156(1997)、Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 97:722-727 (2000)、日本特开平10-146194号公报、日本特开平10-155492号公报、日本特许2938569号公报、日本特开平11-206387号公报、日本特表平8-509612号公报、日本特表平11-505107 号公报)。在本发明中使用的抗体中，包含在不减少期望的活性(通过抑制NS3蛋白酶与I型TGF-P受体的结合，来抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-P受体活化的活性)的条件下修饰其氨基酸序列而得的抗体。另外，在所修饰的抗体中，对于不减少该期望的活性，可使用后述筛选方法的活性的评价系统来确认。本发明的抗体的氨基酸序列突变体，可通过对编码本发明的抗体链的DNA的突变引入，或者通过肽合成来制作。这样的修饰包含例如本发明的抗体的氨基酸序列内的残基的替换、缺失、添加和/或插入。抗体的氨基酸序列被改变的部位只要与改变前的抗体具有同等的活性，则可以是抗体的重链或轻链的恒定区，还可以是可变区(框架区及CDR)。认为CDR以外的氨基酸的改变对与抗原的结合亲和性的影响相对少，现在改变CDR的氨基酸来筛选对抗原的亲和性被提高的抗体的方法是公知的(PNAS，102 =8466-8471 (2005)、Protein Engineering, Design&Selection, 21:485-493 (2008)、国际公开第 2002/051870号、J.biol.Chem., 280:24880-24887 (2005)、Protein Engineering, Design&Selection,21:345-351(2008))。另外，抗体的改变例如可以是改变糖基化部位的数、位置、种类等的抗体的翻译后加工的改变。所谓抗体的糖基化，典型地是N-键或0-键。抗体的糖基化较大地依赖于用于表达抗体的宿主细胞。糖基化图谱的改变可通过参与糖生产的特定酶的导入或缺失等公知方法来进行(日本特开2008-113663号公报、日本特许4368530号公报、日本特许4290423号公报、美国专利第5047335号公报、美国专利第5510261号公报、美国专利第5278299号公报、国际公开第99/54342号公报)。进而，在本发明中，为了增加抗体的稳定性等目的，可通过将脱酰胺化的氨基酸或与脱酰胺化的氨基酸邻接的氨基酸替换成其他氨基酸来抑制脱酰胺化。另外，还可以将谷氨酸替换成其他的氨基酸来增加抗体的稳定性。在本发明中使用的抗体，也提供这样 进行稳定化后的抗体。作为本发明中使用的抗体，如前所述，只要是具有通过抑制NS3蛋白酶与I型TGF-^受体的结合来抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-P受体活化的活性的抗体即可，优选针对NS3蛋白酶或I型TGF-P受体的抗体，从特异性地抑制NS3蛋白酶与I型TGF-@受体的结合这样的观点出发，更优选与包含序列号I 6所记载的氨基酸序列的肽结合的抗体。进而在这些抗体中，从不影响由TGF-P 2引起的活化、特异性地抑制NS3蛋白酶与I型TGF-^受体的结合这样的观点出发，特别优选与包含序列号I 3所记载的氨基酸序列的肽结合的抗体。另外本发明的化合物的其他方式，是在NS3蛋白酶与I型TGF-P受体的结合以及由NS3蛋白酶引起的TGF-P受体的活化中，对NS3蛋白酶、I型TGF-P受体等具有显性负性的性状的多肽。作为这样的多肽，例如可举出由对序列号I 6的任一项所记载的氨基酸序列的进行了替换、缺失、添加和/或插入而得的的多肽和/或肽库，通过后述的筛选方法选择出的多肽。这样的显性负性体可通过重组DNA法、化学合成等来制作。进而本发明的化合物的其他方式，可举出具有抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-@受体活化的活性，能抑制NS3蛋白酶与I型TGF-P受体的结合的低分子化合物。该低分子化合物例如可以如下获得:以包含NS3蛋白酶或I型TGF-P受体中的序列号I 6的任一项所记载的氨基酸序列的肽部位的结构为基础来设计并合成，或者由合成低分子化合物文库通过后述的筛选方法来选择。另外，本发明提供含有本发明的化合物的组合物，作为本发明的组合物的形态，可以是药物组合物、饮食品(包含动物用饲料)、或用于研究目的(例如，体外和/或体内的实验)的试剂。本发明的组合物，通过含有本发明的化合物作为有效成分，从而抑制NS3蛋白酶与I型TGF-P受体的结合，具有抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-P受体活化的活性，因此可适合使用作为用于预防或治疗由丙型肝炎病毒引起的疾病，例如，急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝癌等而施与的药物组合物。另外本发明的组合物，通过含有本发明的化合物，从而还可以适合为了预防或改善这些疾病而作为日常性摄取的饮食品使用。进而本发明的组合物，通过含有本发明的化合物，从而抑制NS3蛋白酶与I型TGF-^受体的 结合，还可以适合作为抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-P受体的活化的试剂使用。本发明的组合物，可通过公知的制剂学方法进行制剂化。例如，可以制成胶囊剂、锭剂、丸剂、液剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、膜涂剂、颗粒(pellet)剂、片(troch)剂、舌下剂、咀嚼剂、含服剂、糊剂、糖浆剂、悬浮剂、酏剂、乳剂、涂布剂、软膏剂、硬膏剂、巴布膏剂、经皮吸收型制剂、洗剂、吸弓丨剂、喷雾剂、注射剂、栓剂等，可经口或非经口使用。在这些制剂化中，可以与药理学上或饮食品容许的载体或其他的添加剂等适宜组合，作为载体具体为灭菌水和/或生理盐水、植物油、溶剂、基剂、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、芳香剂、赋形剂、赋型剂(vehicIe)、防腐剂、结合剂、稀释剂、等渗剂、无痛化剂、增量剂、崩解剂、缓冲剂、涂剂、润滑剂、着色剂、甜味剂、粘稠剂、矫味矫臭剂、溶解辅助剂。在使用本发明的组合物作为药物组合物的情况下，也可与用于预防或治疗由丙型肝炎病毒引起的疾病的公知的药物组合物合并使用。作为公知的药物，例如，可举出PEG干扰素和/或利巴韦林。进而，也考虑与现在进入III期临床试验的NS3蛋白酶的活性抑制剂(Vertex 社制的 Telaprevir、Schering-Ploug 社制的 Boceprevir 等)的合并使用。这些活性抑制剂在以NS3蛋白酶作为对象的方面与本发明的化合物相同，但目标到底是HCV病毒的粒子的成熟化所必要的蛋白酶的活性，在由丙型肝炎病毒引起的疾病的发病机制中的作用点与本发明的化合物不同。因此，通过合并使用本发明的化合物和PEG干扰素、利巴韦林、NS3蛋白酶的活性抑制剂，可以期待在将使用的各药物的浓度抑制得较低的同时，抑制由丙型肝炎病毒引起的病态的发展，排除病毒，实现由丙型肝炎病毒引起的肝疾病的根治治疗。在使用本发明的组合物作为饮食品使用的情况下，该饮食品可以是例如健康食品、功能性食品、特定保健用食品、营养辅助食品、病人用食品、食品添加物、或动物用饲料。本发明的饮食品，除了可作为如上述的组合物摄取以外，还可作为各种饮食品来摄取。作为饮食品的具体例，可举出食用油、调味品、蛋黄酱、人造黄油等含油分的制品；汤类、乳饮料、清凉饮料水、茶饮料、酒精饮料、饮剂、果子冻状饮料、功能性饮料等液状食品；饭类、面条类、面包类等含碳水化物食品；火腿、香肠等的畜产加工食品；鱼糕(如i ff 二 )、干货、水产腌制品(塩辛)等水产加工食品；腌菜等蔬菜加工食品；果子冻、酸奶等半固态食品；酱、发酵饮料等发酵食品；西点类、日本点心类、糖果类、口香糖类、软糖、冷冻点心、冰点等各种点心类；咖喱、浇汁、中式例汤等的即食制品；速溶汤、速溶酱汁等方便食品和/或微波炉对应食品等。进而，还可举出粉末、颗粒、片剂、胶囊剂、调制成液状、糊状或果子冻状的健康饮食品。本发明的组合物可将包含人的动物作为对象来使用，作为除人以外的动物没有特别限制，可以以各种家畜、家禽、宠物、实验用动物等作为对象。具体地可举出猪、牛、马、绵羊、山羊、鸡、野鸭、鸵鸟、鸭、狗、猫、兔、仓鼠、小鼠、大鼠、猴等，但并不限定于这些。本发明的饮食品的制造可通过该技术领域中公知的制造技术来实施。在该饮食品中，还可添加对于预防或改善由丙型肝炎病毒引起的疾病有效的I种或2种以上的成分。另夕卜，通过与发挥除了预防或改善由丙型肝炎病毒引起的疾病以外的功能的其他成分或其他功能性食品组合，也可制成多功能性的饮食品。在施与或摄取本发明的组合物时，其施与量或摄取量根据对象的年龄、体重、症状、健康状态、组合物的种类(药物、饮食品等)等进行适宜选择。例如，本发明组合物的每
I次的施与量或摄取量，通常为0.0lmg/kg体重体重 100mg/kg体重。本发明的组合物的制品(药物、饮食品、试剂)或其说明书可以附加用于抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-P受体的活化的意思的表示。在这里所谓“在制品或说明书附加表示”，是指在制品的本体、容器、包装等附加表示，或在公开制品信息的说明书、附加文件、宣传物、其他的印刷物等中附加表示。在用于抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-P受体的活化的意思的表示中，可包含关于通过施与或摄取本发明的组合物来抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-^受体的活化的机理的信息。作为机理，例如，可举出涉及通过抑制NS3蛋白酶与I型TGF-P受体的结合来抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-P受体的活化的信息。另外，在用于抑制NS3蛋白酶与I型TGF-P受体的结合的意思的表示中，可包含涉及用于由丙型肝炎病毒引起的疾病的预防或治疗等的信息。
另外，本发明如前所述，通过将本发明的化合物或组合物施与对象或使对象摄取等，从而可以抑制NS3蛋白酶与I型TGF-P受体的结合，抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-3受体的活化。进而，通过抑制该活化，也可预防或治疗由丙型肝炎病毒引起的疾病。因此，本发明提供:以抑制NS3蛋白酶与I型TGF-P受体的结合为特征的、抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-P受体的活化的方法；以及以抑制NS3蛋白酶与I型TGF-P受体的结合为特征的、用于预防或治疗由丙型肝炎病毒引起的疾病的方法。进而，本发明还提供具有抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-P受体活化的活性的化合物的筛选方法，其包含以下(a) (C)的工序:(a)在被检化合物的存在下，使NS3蛋白酶与I型TGF-P受体接触的工序，(b)检测NS3蛋白酶与I型TGF-P受体的结合的工序，(c)选择抑制上述结合的化合物的工序。作为在本发明的筛选方法中使用的被验化合物没有特别限制，例如可举出基因文库的表达产物、合成低分子化合物文库、肽库、抗体、细菌释放物质、细胞(微生物、植物细胞、动物细胞)的提取液及培养上清、纯化或部分纯化多肽、来源于海洋生物、植物或动物的提取物、土壤、噬菌体随机展示肽文库。另外，通过本方法筛选的化合物，是抑制NS3蛋白酶与I型TGF-P受体的结合，具有抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-P受体活化的活性的化合物。因此，这些化合物如前所述，可成为由丙型肝炎病毒引起的疾病的预防或治疗药的候选。另外，这里使用的NS3蛋白酶及I型TGF-P受体，例如，作为NS3蛋白酶，可举出包含前述的GenBank ACCESSION N0.AAB27127.1所特定的蛋白质的1056 1204氨基酸和1224 1455氨基酸的肽，作为I型TGF- ^受体，可举出GenBank ACCESSIONN0.BAG63449.1所特定的蛋白质。另外，除了这些天然型的蛋白质，还可使用维持对各自的结合活性的片段、改变体、修饰体等，例如，可使用作为与用于使检测容易的标志物蛋白质、碱性磷酸酶(SEAP)、^ -半乳糖苷酶等酶、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、绿色荧光蛋白质(GFP)等突光蛋白质的融合蛋白质表达而得到的蛋白质。I型TGF-0受:体可使用在细胞表面表达的形态的物质。另外，关于NS3蛋白酶也可使用如后述的实施例所记载的那样的、在N末端侧融合了 NS4A的一部分序列而得的蛋白质。另外，NS4A与NS3蛋白酶同样地是来源于HCV的蛋白质，是与NS3蛋白酶的N末端部位结合而形成复合体，作为使蛋白酶活性增强的辅因子发挥功能的蛋白质。在(a)的工序中，使彼此结合的NS3蛋白酶与I型TGF-P受体在被验化合物存在下进行接触，该接触可以在被验化合物不存在下，在不抑制NS3蛋白酶与I型TGF-P受体的结合的条件下进行。另外在(b)的工序中，检测NS3蛋白酶与I型TGF-@受体的结合，对该结合的检测没有特别限制，可适当采用公知的手法。例如，可采用免疫共沉降法、酵母双杂交系统、ELISA法、使用利用了表面等离子体共振现象的检测装置(例如，BIAcore (GE ^ > 7社制))的方法、利用了 FRET(荧光共振能量移动)的方法。进而在(C)的工序中，选择抑制上述结合的化合物，例如，在使用免疫共沉降法的情况下，在被验化合物存在下，通过将在利用NS3蛋白酶的特异性的抗体使NS3蛋白酶沉降时共沉淀的I型TGF-P受体的量、与在被验化合物不存在下的I型TGF-P受体的量(对照值)进行比较来评价。即，在被验化合物存在下的I型TGF-P受体的量与被验化合物不存在下的量相比较低的情况(例如，对照的值的80%以下、50%以下、30%以下的情况)下，可将该被验化合物评价为具有抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-P受体活化的活性的化合物。在上述结合的检测中使用除免疫沉降法以外的方法的情况下也同样，使用被验化合物不存在下的上述结合的程度作为对照值来进行评价。

进而，本发明还提供具有抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-P受体活化的活性的化合物的筛选方法，其包括以下的(a) (C)的工序:
(a)在被检化合物的存在下，使NS3蛋白酶与I型TGF-P受体接触的工序，(b)检测由NS3蛋白酶引起的TGF-P受体的活化的工序，(c)选择抑制上述结合的化合物的工序。在该筛选方法中使用的被验化合物、NS3蛋白酶、及I型TGF-@受体、以及(a)的工序，与上述筛选方法相同。另外在(b)的工序中，检测由NS3蛋白酶引起的TGF-P受体的活化，对该活化的检测没有特别限制，可适宜采用公知的方法。例如，可采用利用磷酸化位点特异性抗体的I型TGF-P受体和/或Smad2/3等的磷酸化的检测、用荧光蛋白质等标记的Smad复合体的向核内的转移的检测、如后述的实施例6 8所记载的Reporter Assay。进而在(c)的工序中选择抑制上述活化的化合物,例如,在使用Reporter Assay时，可通过将被验化合物存在下的荧光素酶活性的值与被验化合物不存在下的荧光素酶活性的值(对照值)进行比较来评价。即，在被验化合物存在下的荧光素酶活性的值与被验化合物不存在下的值相比较低的情况(例如，对照的值的80%以下、50%以下、30%以下的情况)下，可将该被验化合物评价为具有抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-P受体活化的活性的化合物。在上述活化的检测中使用除Reporter Assay以外的方法时也同样,可使用被验化合物不存在下的上述活化的程度作为对照值来进行评价。实施例以下，基于实施例及比较例更具体地说明本发明，但本发明并不限定于以下的实施例。另外，本实施例中使用的“纯化重组NS3蛋白质”如下述那样进行制备。<纯化重组NS3蛋白质>首先，培养用插入了以下基因的质粒载体PET32a(+) (Novagen社制)转化而得的大肠杆菌KRX株，所述基因编码在来源于HCV的NS3蛋白酶结构域区域(GenBank ACCESSIONN0.AAB27127.1所特定的蛋白质中的1027 1445氨基酸)的N末端(该蛋白质中的1027 1206氨基酸)介由接头(SGS)而融合有来源于HCV的NS4A的一部分序列(GenBankACCESSION N0.AAB27127.1 所特定的蛋白质中的 1678 1690 氨基酸，GSVVIVGRIILSG)而得的蛋白质，即scNS4A-NS3蛋白酶(参照Protein Sc1.，1998年，7卷，10号，2143 2149页，包含序列号7所记载的氨基酸序列的蛋白质)。然后，用IPTG (异丙基-P -硫代吡喃半乳糖苷)诱导添加了来源于pET32a(+)载体的trx-His-S标签的目的蛋白质的表达后，回收菌体。将回收的菌体悬浮于缓冲液(20mM 1'1^8-11(:1[口11值8.0]、3001111似(:1、41111 MgCl2,10%甘油、ImM DTT,0.l%n_ctyl-P-0-吡喃葡萄糖苷)后，用超声波破碎并离心，将分离的上清用0.45 ii m孔径大小的过滤器进行过滤。将过滤的上清用HiSTrap HP柱(GE ^夕7社制)进行亲和纯化，用HiPr印26/60Desalting柱(GE、卟义夕了社制)交换成缓冲液(20mM 1'1^5-11(:1[ 11值8.0 ]，3001111 NaCl, 0.1mM CaCl2, 2mM DTT)后，为了除去 IPS，使其通过EndoTrap Blue柱(GE ^ 7社制)后，将回收的穿流(flow-through)作为纯化重组NS3蛋白质供于本实施例。(实施例1)NS3蛋白酶的TGF-P2样抗原活性的确认首先，为了研究来源于HCV的NS3蛋白酶与TGF-P信号转导有无关联，使用TGF- ^ 2Emax (R) ImmunoAssay System(Promega 社制)通过 ELISA 法来研究纯化重组 NS3蛋白质的TGF-P 2样抗原活性。即，用碳酸缓冲液(pH值9.2)将试剂盒中附带的TGF-3涂布抗体稀释至1/1000，在96孔ELISA用板(NUNC社制)中以各100 yl/孔添加，在4°C静置一夜，对板进行涂布。将涂布后的板用含0.05%Tween20的磷酸缓冲液(以下，也称为“PBST”)洗涤后，将试剂盒附带的TGF-P封闭溶液以各270 U I/孔添加，在37°C静置35分钟进行封闭。接着用PBST洗涤进行了封闭处理的板，添加制备的TGF-P 2标准溶液及上述纯化重组NS3蛋白质溶液，在4°C静置一夜。另外，纯化重组NS3蛋白质通过试剂盒中附带的TGF-P样品稀释溶液进行稀释至终浓度为2.5、5、10、20ii g/ml，作为ELISA的样品，分别添加各IOOiU/孔。用PBST洗涤添加了样品的板后，将用TGF-P样品稀释溶液稀释至1/2000的抗TGF-P 2多克隆抗体以各100 iil/孔添加，室温下振荡2小时。接着，用PBST洗涤添加了多克隆抗体的板后，将用TGF-P样品稀释溶液稀释至1/100的过氧化物酶标记TGF- P以各100 u I/孔添加，室温下静置2小时。进而用PBST洗涤添加了 TGF- ^的板后，作为过氧化物酶底物用显色底物将TMB (四甲基联苯胺)溶液以各IOOiU/孔添加，在室温下使其最大显色15分钟，在得到充分的显色的时刻等量添加lmol/1的盐酸停止反应。其后，测定在450nm的波长下板内的各孔的吸光度。接着，使用TGF- ^ 2标准品来绘制标准曲线，将纯化重组NS3蛋白质的TGF- ^ 2样抗原活性换算成活性型TGF- ^ 2量来求出。将得到的结果示于图1。正如由图1所示的结果明确的那样，确认了来源于HCV的NS3蛋白酶显示TGF- ^ 2样抗原活性，启示了其参与HCV感染时的肝细胞内的TGF-P信号转导。另外，NS3蛋白酶的抗原活性强度为TGF-P 2的抗原活性强度的1/50000 1/100000左右。(实施例2)由NS3蛋白酶引发的TGF-P信号活化的研究接着，用Reporter Assay来研究来源于HCV的NS3蛋白酶在细胞内是否活化TGF-^信号。即，使用以下细胞株来研究纯化重组NS3蛋白质的TGF-P 2样活性，所述细胞株是将在荧光素酶基因的上游插入9个对于TGF- ^靶基因的转录重要的转录因子Smad的DNA结合序列(CAGA)而得的PGl报告质粒(Promega社制)导入貂肺上皮细胞(CCL64细胞)中而构建的(以下，也称为“X9CAGA/CCL64细胞”)。具体地说，在添加了 10%胎牛血清(EQUITECH-B10社制)和 1%防腐剂(青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液，Invitrogen社制)的 Dulbecco’ s Modified Eagle Medium(DMEM, Invitrogen 社制)(以下，也称为“培养培养基”)中以2 X IO5个/ml悬浮X 9CAGA/CCL64细胞，在96孔的细胞培养用板(TPP社制)中以各IOOiU/孔接种，在5%C02存在下，在37°C培养一夜。接着，从板中吸引除去培养上清，用含钙-镁的磷酸缓冲液(以下，也称为“PBS(+)”)洗涤细胞后，在含有0.1%牛血清白蛋白(EQUITECH-B10社制)和上述1%防腐剂的DMEM(以下，也称为“处理培养基”)中以终浓度为12.5、25、50、100ii g/ml加入添加有纯化重组NS3蛋白质的物质100 yl，在5%C02存在下，在37°C进一步培养20小时。第二天，使用荧光素酶分析系统(Promega社制)，按照该试剂盒的附加文件来测定板内的细胞中的荧光素酶活性。即，吸引除去培养上清后，用PBS(+)洗漆细胞,在各孔中添加将试剂盒中所附的Passive Lysis Buffer(5X)稀释I倍而得的液体20 u 1，室温下振荡15分钟溶解细胞。其间，预先用IOml的LuciferaseAssay Reagent II (荧光素酶测定试剂II，以下，也称为"LARII溶液，，)来溶解I小瓶的Luciferase Assay Substrate (突光素酶测定底物)，在96孔的突光素酶分析用板(Costar社制)中分注各100 u I/孔。接着，将细胞溶解液各10 u I加入到预先分注的LARII溶液中，用移液器进行混和后，用发光光度计(制品名:ARV0(TM) ,PerkinElmer社制)测定发光强度。对于各处理，例数为3，以未处理的细胞的报告活性为1，将纯化重组NS3蛋白质处理细胞的活性量作为相对值来求出。将得到的结果示于图2。由图2表示的结果可知，纯化重组NS3蛋白质浓度依赖性地增加荧光素酶活性。由此显示，NS3蛋白酶以某种方式作用于TGF-P受体，动员TGF-P信号。(实施例3)NS3蛋白酶对肝星状细胞的胶原蛋白产生的促进化的研究已知TGF-P作用于肝脏的星状细胞，促进由星状细胞的胶原蛋白的异常产生，弓丨起肝纤维化。因此，接下来对于NS3蛋白酶与胶原蛋白产生促进的关联性进行研究。S卩，将Wistar系大鼠(SPF下饲养，雄性，15周龄)在戊巴比妥麻醉下开腹后，在门静脉中插入导管，按照脱血用洗涤液、0.06%链霉蛋白酶溶液(Carbiochem社制)、0.03%胶原酶(和光纯药社制)溶液的顺序进行灌流。其后，摘出肝脏，在含有0.057%链霉蛋白酶、0.057%胶原酶的肝星状细胞分离用缓冲液中加入了 2mg/ml DNaseI (Roche Diagnostics社制)Iml而得的溶液中，在30分钟、36°C的温浴中进行温育。另外，其间，用IN NaOH将溶解液中的pH值保持为7.2 7.4。接着，将该肝组织溶解液通过筛网进行过滤，加入肝星状细胞分离用缓冲液使总量为150ml并分注于3支50ml聚丙烯管中，在4°C以2000转/分钟离心8分钟。进而吸引除去聚丙烯管中的上清，在各管中加入DNaseI溶液各0.2ml，添加格氏平衡盐类溶液并用移液器混和，使总量为IOOml，再次分注于2支50ml聚丙烯管中，在4°C以2000转/分钟离心8分钟。吸引除去聚丙烯管中的上清后，在各管中加入0.2ml的DNaseI溶液，添加格氏平衡盐类溶液并用移 液器混和后，使总量为67.5ml并移至烧杯中，加入通过0.22 um过滤器灭菌后的Nycodenz (SIGMA社制)溶液(终浓度7.75%) 27ml进行混和。将该细胞溶液分注于8支15ml管中，重层Iml的格氏平衡盐类溶液，在4°C以3200转/分钟离心15分钟来分离肝星状细胞。将分离的肝星状细胞以I X IO5个/ml的浓度悬浮于含有10%胎牛血清(EQUITECH-B10社制)和1%防腐剂(Invitrogen社制)的DMEM培养基中，在直径6cm的细胞培养用皿(CORNING社制)中接种各3ml，在37°C、5%C02存在下培养一夜。第二天，在交换培养基的同时开始处理使得纯化重组NS3蛋白质的终浓度为20 u g/ml，隔天交换培养基并培养7天。另外，作为控制准备没有用纯化重组NS3蛋白质等处理的细胞(未处置细胞)，隔天交换培养基并培养7天。7天后，由这些细胞使用RNA纯化试剂盒RNeasy MicroKit (QIAGEN社制)提取mRNA，使用分光光度计(Nano Drop)测定260nm的吸光度，求出浓度。接着将该mRNA作为模板,使用PrimeScript (TM) RT reagent Kit (TAKARA社制)，按照附加文件进行RT反应。进而使用SYBR(R)Premix EX Taq(TM) II (TAKARA社制)，按照附加文件制备反应液，使用胶原蛋白(Collagenla I)、a平滑肌肌动蛋白(a SMA)、TGF_ P 1、及作为内标的GAPDH的各引物(Invitrogen公司制)进行PCR反应，将mRNA表达量与未处置细胞的mRNA表达量比较。将得到的结果示于图3。由图3表示的结果可知，在处理了纯化重组NS3蛋白质的培养大鼠原代肝星状细胞中，Collagen a I基因的表达与未处置细胞相比增加约6倍，确认了 NS3蛋白酶显著地促进肝星状细胞的胶原蛋白产生。另外，已知通过TGF-@的活化，作为星状细胞的活化的标志物的a SMa基因的表达量和/或TGF-P I基因的表达量没有变化，由图3表示的结果可知，即使用NS3蛋白酶处理星状细胞，这些基因的表达量也没有变化。因此，由实施例1 3表示的结果启示，NS3蛋白酶如TGF-P那样，通过大概结合于TGF-P受体来作用，通过将其活化来传达TGF-P信号，促进胶原蛋白的产生，由此引起肝纤维化。(实施例4)NS3蛋白酶与I型TGF- ^受体的对接模拟TGF-^已知与I型TGF-^受体及II型TGF-^受体形成复合体来传达信号(参照“Joan Massague, Mol Cell，2008 年 2 月 I 日，29 卷，2 号，149-150 页”)。因此，由 NS3 蛋白酶具有TGF-P样活性，启示在分子生物学上，在NS3蛋白酶与I型TGF-P受体的间发生分子间相互作用，形成这些复合体。因此，实施蛋白质间对接模拟(Docking Simulation),研究这些蛋白质间相互作用的有无。另外，还可预测NS3蛋白酶内及TGF-P受体内的哪个氨基酸残基参与这些相互作用。另外，在目前，不存在完全的蛋白质间相互作用预测装置，提出了由现存的蛋白质间相互作用数据库来学习的方法、基于经验物理函数的方法等。本次实施的方法，是全面地评价蛋白质的几何互补性(换言之即蛋白质的凹凸)情况的方法，基于“MolecularSurface recognition !Determination of geometric fit between proteins and theirligands by correlation techniques, Proc.Nat1.Acad.Sc1., 1993 年 3 月，89 卷，2195-2199页”的记载进行安装。即，将蛋白质座标投射于以等间隔分割的三维栅格中，各栅格分派表面得分、分子内部得分。对于受体及配基进行该操作。接着，进行得到的栅格间的卷积计算，全面地探索表面，由得分算出结合状态的互补性。即，作为得分(互补性得分)越高则互补性越好来评价。另外，该方法的一个优点在于，由于通过将蛋白质座标变换为三维栅格座标，并可以通过采用高速傅里叶变换来算出得分，从而执行速度为高速，因此可以不是考虑受体的一部分，而是考虑全部的受体表面与配基表面的互补性。另外，该方法的另一个优点在于，即使在不存在由外部的结合部位指定的状态下，也可预测结合部位。在本实施例中，具体地说，作为蛋白质的座标，HCV NS3蛋白酶使用TOB Code:1NS3，I 型 TGF-^ 受体使用 PDB Code2PJY 的 B 链(type-1I)、C 链(type-1)。将得到的结果示于图4。另外，作为预测结构，通过12.0刻度的欧拉角的组合，产生360X360X180/12=18000的结构。图4所示的预测结构为互补性得分上位的20结构，该20结构的得分的分布为 760 740 731 720 708 690 687 686 684 684 682 677 669 666 663 662 662 661660 659，平均值为435.5，中央值为428.0，标准偏差为54.6。另外，互补性得分上位的结合状态中较多出现的氨基酸残基，可推测为容易出现在实际与受体的相互作用中的残基，因此在预测结合状态下，将原子间距离为3.8人以内的氨基酸残基定义为接触残基，作为NS3蛋白酶与I型TGF-P受体的预测接触残基。将得到的结果示于图5及图6。另外，图5中记载的氨基酸序列表示NS3蛋白酶的蛋白酶结构域的氨基酸序列(序列号8所记载的氨基酸序列)，图6中记载的氨基酸序列表示I型TGF- ^受体的细胞外结构域的氨基酸序列(序列号9所记载的氨基酸序列)。另外，在图5及6中，带有下划线的氨基酸残基表示在预测结合状态下是原子间的距离为3.8人以内的氨基酸残基(预测接触残基)，带有阴影的部位表示是参与NS3蛋白酶与I型TGF-P受体的结合的部位(预测结合位点)。由图4所示的结果可知，采用上述方法的结果，预测了 NS3蛋白酶与I型TGF-3受体在3个位置结合。另外，如图5及图6所示，还推定了参与这些结合的部位(预测结合位点)或氨基酸残基(预测接触残基)。
(实施例5)抗体的制作方法为了证实介由上述预测结合位点(序列号I 6所记载的氨基酸序列)，NS3蛋白酶与I型TGF-P受体结合，由NS3蛋白酶引起的TGF-P受体的活化发生，如以下那样基于上述预测结合位点的氨基酸序列制备合成肽等，制作以这些合成肽等作为抗原的多克隆抗体。<合成肽的制备>将以NS3蛋白酶或I型TGF-P受体的预测结合位点(序列号I 6记载的氨基酸序列)作为靶的多克隆抗体制作中使用的合成肽的序列的一览示于表I。另外，在表I中，“NH2”及“C00H”分别表示各合成肽的N末端侧及C末端侧。另外N末端侧的“C”表示为了使后述的mcKLH与各合成肽结合所需的半胱氨酸残基。进而“miniPEG”表示作为间隔分子插入，为了改善抗原肽 与载体蛋白的位阻而付与的平均分子量6000的聚乙二醇。表I
权利要求
1.一种化合物，其具有以下活性:通过抑制NS3蛋白酶与I型TGF-P受体的结合，来抑制由NS3蛋白酶引起的TGF- ^受体活化。
2.根据权利要求1所述的化合物，其对NS3蛋白酶或I型TGF-P受体具有结合活性。
3.根据权利要求2所述的化合物，其对包含序列号I 6的任一项所记载的氨基酸序列的肽具有结合活性。
4.根据权利要求1 3所述的任一项所述的化合物，其是针对NS3蛋白酶或I型TGF-^受体的抗体。
5.一种用于预 防或治疗由丙型肝炎病毒引起的疾病的组合物，其含有权利要求1 4的任一项所述的化合物作为有效成分。
6.一种具有抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-P受体活化的活性的化合物的筛选方法，其包括以下的(a) (C)的工序: (a)在被检化合物的存在下，使NS3蛋白酶与I型TGF-P受体接触的工序， (b)检测NS3蛋白酶与I型TGF-P受体的结合的工序， (c)选择抑制上述结合的化合物的工序。
7.一种具有抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-P受体活化的活性的化合物的筛选方法，其包括以下的(a) (C)的工序: (a)在被检化合物的存在下，使NS3蛋白酶与I型TGF-P受体接触的工序， (b)检测由NS3蛋白酶引起的TGF-P受体的活化的工序， (c)选择抑制上述活化的化合物的工序。
8.一种抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-P受体的活化的方法，其特征在于，抑制NS3蛋白酶与I型TGF-P受体的结合。
9.一种用于预防或治疗由丙型肝炎病毒引起的疾病的方法，其特征在于，抑制NS3蛋白酶与I型TGF-P受体的结合。
全文摘要
本发明以提供能抑制由HCV引起的TGF-β受体的活化的化合物、以及该化合物的筛选方法为课题，发现了来源于HCV的NS3蛋白酶与I型TGF-β受体结合，通过该结合使TGF-β受体活化。进而还发现了鉴定了NS3蛋白酶与I型TGF-β受体的结合位点，通过识别这些结合位点的抗体，能抑制由NS3蛋白酶引起的TGF-β受体的活化。另外，发现了可以以NS3蛋白酶与I型TGF-β受体的结合的抑制等为指标，来筛选抑制TGF-β受体活化的化合物。
文档编号C07K16/28GK103119066SQ201180042019
公开日2013年5月22日 申请日期2011年8月30日 优先权日2010年8月30日
发明者小岛聪一, 原详子, 松本武久, 高谷大辅 申请人:独立行政法人理化学研究所