Flt3蛋白在制备肝癌对索拉菲尼疗效评估试剂盒中的应用
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，具体是Flt3蛋白在制备肝癌对索拉菲尼疗效评估试剂盒中的应用。本发明的Flt3蛋白与肝癌相关性的发现为预测肝癌患者服用索拉菲尼提供全新的生物学标志物，对肝癌患者是否服用索拉菲尼具有重要指导作用。Flt3蛋白高表达的肝癌病人对索拉菲尼治疗敏感，适于用索拉菲尼进行治疗，且治疗后预后较好，这对于肝癌病人服用索拉菲尼具有重要的指导意义。
【专利说明】
F113蛋白在制备肝癌对索拉菲尼疗效评估试剂盒中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域，涉及一种Flt3蛋白的应用，具体地说，是Flt3蛋白在制备肝癌对索拉菲尼疗效评估试剂盒中的应用。
【背景技术】
[0002]肝癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率长期居高不下。我国是世界上肝癌发病最多的国家，据“全球最新癌症统计数据公布”数据显示，肝癌全球每年有78.2万新发病例，74.5万死亡病例。其中，中国的新发病例数及死亡病例数均占了约50 %左右。
[0003]近年来，应用分子靶向药物治疗肝癌的研究逐渐受到重视，正在成为新的热点。多靶点受体酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼(多吉美)是唯一一个被FDA批准用于肝癌靶向治疗的药物，其对中晚期肝癌的治疗效果已得到确认，也证明了分子靶向治疗在肝癌治疗中是可行的。但在临床应用中发现，索拉菲尼只对小部分晚期肝癌患者效果明显，多数肝癌患者服用索拉菲尼后疗效不显著，甚至出现强烈的副作用和药物耐受情况。目前，发现可预测肝癌对索拉菲尼疗效的生物标记物用于指导索拉菲尼临床用药是亟需解决的问题。
[0004]本领域迫切需要发现在肝癌中能预测索拉菲尼疗效的生物标志物，这方面的研究对临床治疗肝癌及指导索拉菲尼临床用药有重要意义。
[0005]Flt3蛋白(FMS-like receptor tyrosine kinase-3,FMS样的酪氨酸激酶3，简称Flt3，GeneID: 2322)是ΙΠ型受体型酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)家族成员之一，在正常造血及免疫系统发育中起着重要作用。Flt3基因突变与急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia，AML)的发生、预后密切相关。以Flt3作为革El分子已成为AML治疗的一种新策略。(参见文献:Rosnet O,Marchetto S，deLapeyriere 0，et al.MurineFlt3，a gene encoding a novel tyrosinekinase receptor of the PDGFR/CSFlRfamily[J].0ncogene,1991,6:1641-1650.；Matthews ff,Jordan CT,ffiegand Gff,et al.Areceptor tyrosine kinase specificto hematopoietic stem and progenitor cell-enriched populat1ns!! J].Cell，1991，65:1143-1152.)目前为止，Flt3在肝癌中的研究尚无文献报道，其在肝癌发生、发展中的分子机制仍不清楚。
[0006]目前还未见Flt3蛋白在制备肝癌术后索拉菲尼/疗效评估试剂盒中的应的研究报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供Flt3蛋白的新应用，特别是在制备肝癌对索拉菲尼疗效评估试剂盒中的应用。
[0008]本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测Flt3蛋白在肝癌术后服用索拉菲尼病人肝癌组织中的表达量，能够判断术后肝癌患者对于索拉菲尼药物的敏感性。基于Flt3蛋白的表达量与肝癌的这种相关性，以该蛋白作为分子标志物，对其表达量进行检测可以用于肝癌病人服用索拉菲尼的判断指标。
[0009]本发明的第一方面，提供Flt3蛋白在制备肝癌索拉菲尼疗效评估试剂或试剂盒中的应用。
[0010]所述的试剂或试剂盒检测Flt3蛋白在术后肝癌组织或者原发灶穿刺组织中的表达量。
[0011]优选的，所述的试剂或试剂盒采用免疫组化方法检测Flt3蛋白在术后肝癌组织或者原发灶穿刺组织中的表达量。
[0012]更优选的，所述的试剂或试剂盒是将Flt3蛋白作为分子标记，利用Flt3单克隆抗体或多克隆抗体，以及免疫组化试剂，分析Flt3蛋白在术后肝癌组织或者原发灶穿刺组织中的表达量，预测肝癌患者服用索拉菲尼的疗效。
[0013]所述的Flt3单克隆抗体，为商品化抗体，如兔Flt3单克隆抗体(ABclonalA7897)
[0014]优选的，所述的免疫组化试剂包括二甲苯，乙醇，3%H202溶液，I %BSA封闭液，DAB显色试剂，苏木素和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG。
[0015]本发明的第二方面，提供Flt3蛋白在制备判断肝癌患者对于索拉菲尼敏感性的试剂或试剂盒中的应用。肝癌组织中Flt3高表达的肝癌病人对索拉菲尼治疗敏感。
[0016]本发明的第三方面，提供Flt3蛋白在制备指导肝癌患者索拉菲尼用药的试剂或试剂盒中的应用。肝癌组织中Flt3高表达的肝癌病人适于用索拉菲尼进行治疗。
[0017]本发明的第四方面，提供Flt3蛋白在制备判断服用索拉菲尼肝癌患者的预后的试剂或试剂盒中的应用。肝癌组织中Flt3高表达的肝癌病人用索拉菲尼治疗其预后更好，Flt3低表达的是否服用索拉菲尼并不影响患者预后。
[0018]本发明的第五方面，提供一种判断服用索拉菲尼肝癌患者的预后的方法，所述的方法为检测Flt3蛋白在肝癌组织中的表达量。高表达的肝癌病人用索拉菲尼治疗其预后更好，Flt3低表达的是否服用索拉菲尼并不影响患者预后。
[0019]所述的检测Flt3蛋白在肝癌组织中的表达量的方法，包括以下步骤:
[0020](a)利用免疫组化试剂二甲苯，乙醇，3 % H2O2溶液，I % BSA封闭液，DAB显色试剂，苏木素和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG将肝癌组织切片进行免疫组化染色；
[0021](b)利用显微镜和成像装置拍摄为数码照片；
[0022](c)根据免疫组化染色结果人工评分原则，给出评分。
[0023]优选的，所述的方法具体步骤如下:
[0024](I)制备肝癌组织石蜡切片，60°C烤箱过夜；
[0025](2)切片脱腊至水；
[0026](二甲苯I①1miη—二甲苯 Π ②1miη—二甲苯ΙΠ③1min—100 % 乙醇5min—95% 乙醇 5min—85% 乙醇 5min—75% 乙醇 5min—双蒸水 5min)
[0027](3)3% H2O2 溶液，室温放置 20min ；
[0028](4)双蒸水洗 5minX3;
[0029](5)抗原修复:切片放入0.0lM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中煮沸301^11;
[°03°] (6)自然冷却至室温，双蒸水洗5minX3;
[0031](7)1%85厶封闭3011^11，37。(:；
[0032](8)用去封闭液，不洗，直接加一抗(兔F113单克隆抗体，购自ABc 1naI公司，稀释比例1:50)。置入湿盒中4 °C冰箱过夜16小时；
[0033](9)4。(:取出，室温复温1511^11，然后0.0謹 PBS洗5minX4;
[0034](10)滴加二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG，购自丹麦DAKO公司，即用型，无需稀释)45min，37°C ；
[0035](11)0.0lM PBS洗5minX4，DAB显色2-10min，镜下观察；
[0036](12)双蒸水终止显色，苏木素复染10秒；
[0037](13)分化后自来水返蓝，蒸馏水浸泡；
[0038](14)脱水透明，盖玻片覆盖；
[0039](15)显微镜下观察阳性染色，于肝癌组织随机选取3个视野并拍照；
[0040](16)采用高倍镜下综合染色强度和阳性细胞所占比例进行半定量测定。具体评分如下:
[0041 ] I，染色强度评分标准:不着色O分，黄色I分，棕黄色2分;黄褐色3分。
[0042]2，阳性细胞所占比例评分标准:阳性细胞数彡5 %为O分;5 %?25 %为I分;25 %?50 %为2分;50 %?75 %为3分;75 %以上为4分。
[0043]3，两种评分相乘，0-4分为阴性;4-8为弱阳性;8分以上为强阳性。
[0044]根据上述方法检测病人肝癌组织中Flt3表达情况，进行评分，阴性和弱阳性组为低表达，强阳性为高表达，肝癌组织中Flt3高表达的肝癌病人术后索拉菲尼疗效较好。
[0045]本发明的Flt3蛋白与肝癌相关性的发现，为预测肝癌患者服用索拉菲尼的疗效提供了全新的生物标志物，对肝癌患者是否服用索拉菲尼具有重要指导作用。Flt3蛋白高表达的肝癌病人对索拉菲尼治疗敏感，适于用索拉菲尼进行治疗，且治疗后预后较好。
[0046]本发明利用免疫组化技术、显微镜拍照和人工半定量测定肿瘤组织中Flt3蛋白的表达量，并结合术后随访信息，确定Flt3蛋白表达量与肝癌术后服用索拉菲尼病人的生存期存在相关性，Flt3蛋白能用于判断肝癌患者是否应当服用索拉菲尼的生物标志物，对于肝癌病人术后服用索拉菲尼具有重要的指导意义。对于失去手术时机的肝癌患者，可以利用穿刺获得肝癌组织进行Flt3表达水平的检测，或者通过收集患者血液中的循环肿瘤细胞进行Flt3基因扩增的检测，从而评估其对索拉菲尼的敏感性。
【附图说明】
[0047]图1为182例经手术治疗的肝癌患者(93例术后服用索拉菲尼，89例术后未服用索拉菲尼)肝癌组织中Flt3的免疫组化染色的代表性图，可见肿瘤组织中Flt3表达高低情况。
[0048]图2为索拉菲尼未用药组和用药组中Flt3低表达组患者的生存分析图，可见Flt3低表达组中是否服用索拉菲尼并不影响患者预后。
[0049]图3为索拉菲尼未用药组和用药组中Flt3低表达组患者的生存分析图，可见Flt3高表达组中用药的患者预后更好。
[0050]图4为Flt3在病例I的肝癌组织中免疫组化染色结果图，可见肿瘤组织中Flt3着色很弱。
[0051]图5为Flt3在病例2的肝癌组织中免疫组化染色结果图，可见肿瘤组织中Flt3没有着色。
[0052]图6为Flt3在病例3的肝癌组织中免疫组化染色结果图，可见肿瘤组织中Flt3着色较强。
[0053]图7为Flt3在病例4的肝癌组织中免疫组化染色结果图，可见肿瘤组织中Flt3着色较强。
【具体实施方式】
[0054]下面结合实施例对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0055]实施例1:
[0056]随机选取89例肝癌患者术后未服用索拉菲尼的肝癌组织石蜡切片(肝癌组织切片均来自东方肝胆外科医院，由2名病理科医生确诊为肝细胞癌)，采用免疫组化方法检测Flt3蛋白在肝癌组织中的表达量并计算免疫组化评分，具体步骤如下:
[0057](I)制备肝癌组织石蜡切片，60 °C烤箱过夜；
[0058](2)切片脱腊至水；
[0059](二甲苯I①1miη—二甲苯 Π ②1miη—二甲苯ΙΠ③1min—100 % 乙醇5min—95% 乙醇 5min—85% 乙醇 5min—75% 乙醇 5min—双蒸水 5min)
[0060](3)3% H2O2 溶液，室温放置 20min ；
[0061](4)双蒸水洗 5minX3;
[0062](5)抗原修复:切片放入0.0lM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中煮沸301^11;
[0063](6)自然冷却至室温，双蒸水洗5minX3;
[0064](7)1%85厶封闭3011^11，37。(:；
[0065](8)用去封闭液，不洗，直接加一抗(兔F113单克隆抗体，购自ABc1nal公司，稀释比例1:50)。置入湿盒中，4 °C冰箱过夜16小时；
[0066](9)4°(:取出，室温复温1511^11，然后0.0謹 PBS洗5minX4;
[0067](10)滴加二抗，45min，37°C;
[0068](11)0.0lM PBS洗5minX4，DAB显色2-10min，镜下观察；
[0069](12)双蒸水终止显色，苏木素复染10秒；
[0070](13)分化后自来水返蓝，蒸馏水浸泡；
[0071 ] (14)脱水透明，盖玻片覆盖；
[0072](15)显微镜下观察阳性染色，于肝癌组织随机选取3个视野并拍照；
[0073](16)采用病理科经典的免疫组化染色判读方法，即高倍镜下综合染色强度和阳性细胞比例进行半定量分析，具体评分标准如下:
[0074]I，染色强度评分标准:不着色O分，黄色I分，棕黄色2分，黄褐色3分。
[0075]2，阳性细胞所占比例评分标准:阳性细胞数彡5 %为O分;5 %?25 %为I分;25 %?50 %为2分;50 % -75 %为3分;75 %以上为4分。
[0076]3，两种评分相乘，0-4分为阴性;4-8为弱阳性;8分以上为强阳性。
[0077]采用以上免疫组化方法的试验步骤检测Flt3蛋白在89例术后未服用索拉菲尼患者的肝癌组织中表达情况，并依据评分标准进行评分。结果表明:根据评分将患者分为阴性13例、弱阳性42例、强阳性34例;将阴性和弱阳性定义为低表达组，强阳性定义为高表达组，其中低表达组55例，高表达组34例(见图1)。
[0078]实施例2:
[0079]结合预后信息，对实施例1的182例病人中Flt3蛋白低表达的肝癌患者(用药组64和未用药组55例)进行生存分析，数据分析采用SPSS软件18.0，生存曲线分析使用Kaplan-Meier法，两组之间比较用log-rank检验。结果发现在用药组中Flt3低表达患者生存和未用药组中Flt3低表达患者之间并没有统计学差异(P = 0.187)(见图2)。结果提示:Flt3低表达组中是否服用索拉菲尼并不影响患者预后。
[0080]实施例3:
[0081]结合预后信息，对实施例1的182例病人中Flt3蛋白高表达的肝癌患者(用药组29和未用药组34例)进行生存分析，数据分析采用SPSS软件18.0，生存曲线分析使用Kaplan-Me i er法，两组之间比较用I og-rank检验。结果发现在用药组中Flt3高表达患者生存明显比未用药组中Flt3高表达好，两组生存分析有统计学差异(P = 0.038)(图3)。结果提示:Flt3蛋白高表达组术后服用索拉菲尼预后更好。
[0082]实施例4:
[0083]病例1:某肝癌患者肿瘤的组织切片，采用以上免疫组化方法的试验步骤检测Flt3蛋白的表达量，结果发现Flt3低表达(肝癌组织染色结果的显微图片如图4所示)。
[0084]经术后随访知，该患者术后服用索拉菲尼药物预后较差，其总生存时间为7个月，并且术后3个月出现复发转移。
[0085]实施例5:
[0086]病例2:某肝癌患者肿瘤的组织切片，采用以上免疫组化方法的试验步骤检测Flt3蛋白的表达量，结果发现Flt3低表达(肝癌组织染色结果的显微图片如图5所示)。
[0087]经术后随访知，该患者术后服用索拉菲尼药物预后较差，其总生存时间为6.3个月，并且术后2个月出现复发转移。
[0088]实施例6:
[0089]病例3:某肝癌患者肿瘤的组织切片，采用以上免疫组化方法的试验步骤检测Flt3蛋白的表达量，结果发现Flt3高表达(肝癌组织染色结果的显微图片如图6所示)。
[0090]经术后随访知，该患者术后服用索拉菲尼药物预后较好，总生存时间为26个月，并且术后未发现复发转移。
[0091]实施例7:
[0092]病例4:某肝癌患者肿瘤的组织切片，采用以上免疫组化方法的试验步骤检测Flt3蛋白的表达量，结果发现Flt3高表达(肝癌组织染色结果的显微图片如图7所示)。
[0093]经术后随访知，该患者术后服用索拉菲尼药物预后较好，其总生存时间为32个月，并且术后未发现有复发转移。
[0094]由以上试验结果可知，通过采用免疫组化的方法检测Flt3蛋白分子表达量能指导索拉菲尼术后用药。当免疫组化染色为Flt3高表达的肝癌患者，其术后服用索拉菲尼效果更好。显然，Flt3蛋白的表达量与术后服用索拉菲尼肝癌患者的预后具有相关性，因此，以Flt3蛋白作为分子标志物，对其表达量进行检测能指导索拉菲尼术后用药。相应的，特异性抗Flt3蛋白的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，能用于制备判定肝癌术后是否服用索拉菲尼的试剂或试剂盒，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。
[0095]以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
【主权项】
1.Flt3蛋白在制备肝癌对索拉菲尼疗效评估试剂或试剂盒中的应用。2.根据权利要求1所述的Flt3蛋白在制备肝癌对索拉菲尼疗效评估试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的试剂或试剂盒检测Flt3蛋白在术后肝癌组织或者原发灶穿刺组织中的表达量。3.根据权利要求2所述的Flt3蛋白在制备肝癌对索拉菲尼疗效评估试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的试剂或试剂盒采用免疫组化方法检测Flt3蛋白在术后肝癌组织或者原发灶穿刺组织中的表达量。4.根据权利要求3所述的Flt3蛋白在制备肝癌对索拉菲尼疗效评估试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的试剂或试剂盒是将Flt3蛋白作为分子标记，利用Flt3单克隆抗体或多克隆抗体，以及免疫组化试剂，分析Flt3蛋白在术后肝癌组织或者原发灶穿刺组织中的表达量，预测肝癌患者服用索拉菲尼的疗效。5.根据权利要求4所述的Flt3蛋白在制备肝癌对索拉菲尼疗效评估试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的免疫组化试剂包括二甲苯，乙醇，3^H2O2溶液，I %BSA封闭液，DAB显色试剂，苏木素和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG。6.Flt3蛋白在制备判断肝癌患者对于索拉菲尼敏感性的试剂或试剂盒中的应用。7.Flt3蛋白在制备指导肝癌患者索拉菲尼用药的试剂或试剂盒中的应用。8.Flt3蛋白在制备判断服用索拉菲尼肝癌患者的预后的试剂或试剂盒中的应用。9.一种判断服用索拉菲尼肝癌患者的预后的方法，其特征在于，所述的方法为检测Flt3蛋白在肝癌组织中的表达量。
【文档编号】G01N33/574GK106093394SQ201610399149
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】丁劲, 王红阳, 刘辉, 李晓峰, 程卓, 汪珍光
【申请人】中国人民解放军第二军医大学