蛋白酶活化受体-1(par1)的拮抗剂的制作方法

专利名称：蛋白酶活化受体-1(par1)的拮抗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白酶活化受体-l(PARl)的抗体和抗原结合分子拮抗剂。
背景技术：
蛋白酶活化受体l(PARl)是属于G蛋白偶联受体(GCPR)类别的凝血 酶受体。PARI在多种组织例如内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、神 经元和Ajk小板中表达。其涉及与止血、增殖和组织损伤相关的细胞应答。 通过PAR1经凝血酶介导的对血小板聚集的刺激是血管中血块形成和伤口 愈合中重要的步骤。凝血酶以如下方式活化PARI:蛋白水解去除PARI 的细胞外N-端结构域的一部分并暴露新的PARI N-端。然后，新PARI N-端的头几个氨基酸(SFLLRN; SEQ ID NO:37)作为束缚配体(tethered ligand)起作用，所述束縳配体与受体的另一部分结合，通过结合的G-蛋白 起始信号转导。也可以通过血块形成中涉及的其他丝氨酸蛋白酶活化 PARI,
对PARl-介导的信号转导活性的调节具有若干种治疗性应用。PARI 的抑制有助于治疗血栓形成和血管增生病症和抑制癌症的发展。见例如 Darmoul，等，Mol Cancer Res (2004) 2(9):514曙22和Salah， et al, Mol Cancer Res (2007) 5(3):229-40。 PARI抑制剂(包括拮抗剂抗体或抗原结合分子)可用于治疗由PARI细胞内信号转导介导的大量疾病状况。例如，PARI 抑制剂(包括拮抗剂抗体或抗原结合分子)可用于预防或抑制慢性肠道炎 性病症，包括炎性肠病(IBD)、肠易激综合征(IBS)和溃疡性结肠炎；和纤 维变性病症，包括肝纤维化和肺纤维化。见例如Vergnolle，等，J Clin Invest (2004) 114(10):1444; Yoshida， et al， Aliment Pharmacol Ther (2006) 24(Suppl 4):249; Mercer，等，Ann NY Acad Sci (2007) 1096:86-88; Sokolova and Reiser, Pharmacol Ther (2007) PMID:17532472。 PARI抑制剂(包括 拮抗剂抗体或抗原结合分子)还可用于预防或抑制缺血-再灌注损伤，包括 心肌、肾、脑和肠的缺血-再灌注损伤。参阅例如Strande，等，Basic Res. Cardiol (2007) 102(4):350-8; Sevastos，等，Blood (2007) 109(2):577-583; Junge，等，Proc Natl Acad Sci USA. (2003) 100(22): 13019-24和Tsuboi，等， Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol (2007) 292(2):G678陽83。抑制PARI 细胞内信号转导也可用于抑制细胞的单纯疱疹病毒(HSV1和HSV2)感 染。见Sutherland，等，J Thromb Haemost (2007) 5(5):1055-61。
发明概述
本发明一方面提供抗人蛋白酶活化受体-l(hPARl)的单克隆拮抗剂抗 体或抗原结合分子。该抗体或抗原结合分子以和第二抗体相同的结合特异 性结合人PAR1。所述第二抗体具有(i)SEQIDNO:5的重链可变区序列和 SEQ ID NO:6的轻链可变区序列，或(ii) SEQ ID NO:7的重链可变区序列 和SEQ ID NO:8的轻链可变区序列。
在一些实施方案中，抗体与下述hPARl表位特异结合，所述表位包 含氨基酸序列 SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTE (SEQ ID NO:38)或其片段，例如至少8、 9、 10、 11、 12、 13、 14或15个连续^JL 酸的片段。在一些实施方案中，抗体不与来自其他物种的PARI (例如小 鼠PARI (mPARl))或除PARI以外的其它PAR亚型如蛋白酶活化受体 -2(PAR2)发生显著结合(即交叉反应)。
一些抗体或抗原结合分子具有SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQID NO:23的重链互补性决定区(CDR)序列；或SEQ ID NO:24、 SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的轻链CDR序列。这些分子中的一些具有分别 为SEQ ID NO:21、 SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23的重链CDRl、 CDR2 和CDR3序列；和分别为SEQ ID NO:24、 SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26 的轻链CDR1、 CDR2和CDR3序列。
一些抗体或抗原结合分子具有SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的重链互补性决定区(CDR)序列；或SEQ ID NO:30、 SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32的轻链CDR序列。这些分子中的一些具有分别 为SEQ ID NO:27、 SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29的重链CDRl、 CDR2 和CDR3序列；和分别为SEQ ID NO:30、 SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32 的轻链CDR1、 CDR2和CDR3序列。
一些抗体或抗原结合分子具有与SEQ ID NO:5至少85%、卯％、95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同一性的重链可变区氨基酸序列，和与 SEQIDNO:6至少85%、卯％、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100% 同一性的轻链可变区^J^酸序列。而其他一些具有与SEQ ID NO:7至少 85%、卯％、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同一性的重链可变 区^J^紗列，和与SEQIDNO:8至少85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同一性的轻链可变区氨基酸序列。 一些分子具有SEQ ID NO: 5的重链可变区氨基^列和SEQ ID NO:6的轻链可变区^J^絲 列。其他一些具有SEQ ID NO:7的重链可变区M酸序列和SEQ ID NO:8 的轻链可变区氨基酸序列。
一些抗体或抗原结合分子具有与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7至少 85%、卯％、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同一性的重链可变 区JL&酸序列。 一些抗体或抗原结合分子具有与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8至少85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%同一性 的轻链可变区氨基酸序列。
本发明的一些抗-hPARl抗体或抗原结合分子是小鼠抗体。其他一些 是嵌合抗体。 一些抗-hPARl分子是人源化抗体。其他一些是人抗体。还有一些其他的是单链抗体、Fab片段或具有来自人纤连蛋白III型结构域 的支架(scaffold)的单抗体(monobody)。
另一方面，本发明提供了分离或重组的多核苷酸，其编码含有抗 -hPARl抗体或抗原结合分子的重链可变区或轻链可变区的多肽。 一些多 核苷酸编码含有人抗体可变区的多肽。该多肽可含有分别为SEQ ID NO:21、 SEQIDNO:22和SEQIDNO:23的重链CDR1、 CDR2和CDR3 序列；和分别为SEQ ID NO:24、 SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的轻链 CDR1、 CDR2和CDR3序列。多肽也可含有分别为SEQ ID NO:27、 SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29的重链CDR1 、 CDR2和CDR3序列；和分别 为SEQ ID NO:30、 SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的轻链CDRl、 CDR2 和CDR3序列。
一些多核苷酸编码与SEQ ID NO:5的成熟区至少卯％同一性的成熟 重链可变区序列，和/或与SEQ ID NO:6的成熟区至少90%同一性的成熟 轻链可变区序列。 一些其他的编码与SEQ ID NO:7至少90%同一性的成 熟重链可变区氨基酸序列，和/或与SEQ ID NO:8至少卯％同一性的成熟 轻链可变区^J^酸序列。 一些多核苷酸编码与SEQ ID NO:5的成熟区相同 的成熟重链可变区序列，和/或与SEQ ID NO:6的成熟区相同的成熟轻链 可变区序列。一些其他的编码与SEQIDNO:7的成熟区相同的成熟重链可 变区序列，和/或与SEQIDNO:8的成熟区相同的成熟轻链可变区序列。
本发明另一方面提供分离的宿主细胞，其含有(l)重组DNA区段，其 编码本发明的抗-PARl抗体或抗原结合分子的重链；和(2)第二重组DNA 区段，其编码抗体或抗原结合分子的轻链。在一些宿主细胞中，所述DNA 区段各自与启动子有效连接并能够在宿主细胞中表达。 一些宿主细胞能够 表达人来源的抗-PARl抗体或抗原结合分子。 一些宿主细胞能够表达下述 抗-hPARl抗体或抗原结合分子，所述抗体或抗原结合分子含有分别为 SEQ ID NO:21、 SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23的重链CDR1、 CDR2 和CDR3序列；和分别为SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26 的轻链CDR1、 CDR2和CDR3序列。 一些其他的表达下述抗-hPARl抗体或抗原结合分子，所述抗体或抗原结合分子含有分别为SEQIDNO:27、 SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29的重链CDR1、 CDR2和CDR3序列； 和分别为SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的轻链CDR1、 CDR2和CDR3序列。
本发明提供了包含与人PAR1的表位特异结合的抗体或抗原结合分子 的药物组合物，其中所述表位包含氨基酸序列 SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTE (SEQ ID NO:38)或其片段，且 其中所述抗体或抗原结合分子是PAR1拮抗剂。组合物中使用的抗体和抗 原结合分子的实施方案如本文所述。
本发明提供了改善疾病状况之症状的方法，所述疾病状况由通过 PARI的细胞内信号转导介导，所述方法包括对有需要的受试者施用与人 PARI表位特异结合的抗体或抗原结合分子，其中所W位包含氨基i^ 列SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTE (SEQ ID NO:38)或其片段， 且其中所述抗体或抗原结合分子是PAR1拮抗剂。该方法中使用的抗体和 抗原结合分子的实施方案如本文所述。
在一些实施方案中，疾病状况由通过PAR1的异常细胞内信号转导介 导。在一些实施方案中，疾病状况是血栓形成或血管增殖病症。在一些实 施方案中，疾病状况是异常表达PAR1的癌症，例如癌(carcinomas)或 上皮癌，包括例如皮肤癌(包括黑素瘤)、胃肠癌(包括结肠癌)、肺癌 和乳腺癌(包括乳癌和导管癌)、前列腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、腺癌 等等。在一些实施方案中，疾病状况是慢性肠道炎性病症，例如炎性肠病 (IBD)、肠易激综合征(IBS)和溃疡性结肠炎。在一些实施方案中，疾病状 况是纤维变性病症，例如肝纤维化和肺纤维化。
在一些实施方案中，疾病状况由通过PAR1的细胞内信号转导介导， 所述信号转导可以是或不是异常的。在一些实施方案中，所迷方法涉及抑 制或预防缺血-再灌注损伤，包括心肌、肾、脑和肠的缺血-再灌注损伤。 在一些实施方案中，所述方法涉及抑制或预防细胞的单纯疱疹病毒(HSV1 和HSV2)感染。可参考说明书的剩余部分和权利要求书实现对本发明的本质和优点 的进一步理解。
定义
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领 域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。以下的参考文献为技术人
员提供了本发明中使用的许多术语的 一般定义Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Smith等(eds.), Oxford University Press (revised ed.， 2000); Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, Singleton等(Eds.)， John Wiley & Sons (3PrdP ed.， 2002);和A Dictionary of Biology (Oxford Paperback Reference), Martin and Hine (Eds.)， Oxford University Press (4PthP ed.， 2000)。另外，提供以下的定义
帮助读者实践本发明。
术语"抗体"和"抗原结合分子"用于表示多肽链，其对(一个或多个)
给定的表位显示出强的单价、二价或多价结合。除非另有说明，本发明的 抗体或抗原结合分子可具有来自任何脊推动物、哺乳动物、驼科(camelid)、 禽或鱼纲物种的序列。它们可使用任何合适的技术产生，例如杂交瘤技术、 核糖体展示、噬菌体展示、基因改组文库、半合成或全合成的文库或其组 合。如本文所详述的，本发明的抗体或抗原结合分子包括完整的抗体、抗 原结合多肽链和其他i殳计抗体(designer antibody)(见例如Serafmi， J Nucl Med. 34:533-6， 1993 )。
完整的"抗体，，通常包含通过二硫键相互连结的至少两条重(H)链(约 50-70 kD)和两条轻(L)链(约25kD)。公认的编码抗体链的免疫球蛋白 基因包括k、 k、 ou y、 & s和H恒定区基因，以及无狄疫球蛋白可变 区基因。轻链被划分为K或k。重链被划分为y、 p、 a、 8或￡，它们又分 别定义免疫球蛋白类型IgG、 IgM、 IgA、 IgD和IgE。
抗体的每一条重链都由重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH) 和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、 CH2和CH3组成。
12每一条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区 组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。重链和轻链的可变区含有与抗 原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或 因子的结合，所述组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞) 和经典补体系统的第一个组分(Clq)。
抗体的VH和VL区可进一步细分为高变区，也称作互补性决定区 (CDR)，其间点缀更加保守的构架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和 四个FR组成，按以下的顺序从氨基端到氣基端排列为FR1、 CDR1、 FR2、 CDR2、 FR3、 CDR3、 FR4。例如Kabat等，Sequences of Proteins of
Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1987 and 1991)已定义了 CDR和FR区 的定位和编号体系。
来自免疫球蛋白成熟重链和轻链可变区的氨基酸分别被命名为Hx和 Lx，其中x是根据Kabat等上引文的方案定义M酸位置的编号。Kabat 等针对各亚组的抗体列出了许多氨基酸序列，并针对该亚组中每个残基位 置列出最常存在的氨基酸，以产生共有序列。Kabat等使用向所列序列中 各^J^酸指定残基编号的方法，并且指定残基编号的该方法已成为本领域 中的标准。通过参考保守氨基酸将问题抗体与Kabat等中的共有序列之一 进行比对，可将Kabat的方案扩展至他的目录中未包含的其他抗体。使用 Kabat编号体系能容易地鉴定不同抗体中等价位置上的氨基酸。例如，人 抗体L50位置上的氨基酸占据与小鼠抗体M酸位置L50等价的位置。同 样地，当根据Kabat编号规则比对相应核酸编码的氨基酸序列时，可以比 对编码抗体链的核酸。
抗体或抗原结合分子还包括含有完整抗体的抗原结合部分的抗体片 段，其保留结合关连(cognate)抗原的能力。这类抗体片段的实例包括(i)Fab 片段，其为由VL、 VH、 CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab，)2 片段，其为包含两个Fab片段的二价片段，所述两个Fab片段由铰链区的 二石克键连接；(iii)由VH和CHl结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段;(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward 等，Nature 341:544-546， 1989);和(vi)分离的互补性决定区(CDR)。另夕卜， 尽管Fv片段的两个结构域VL和VH可以由独立的基因编码，但是也可使 用重组的方法，通过合成的接头将它们连接在一起，使得它们能够被制成 单一蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称作单链Fv(scFv); 见例如Bird等，Science 242:423-426， 1988;和Huston等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883， 1988 )。
本发明的抗体或抗原结合分子还包括一条或多条与其他蛋白质化学 缀合或表达为与其他蛋白质的融合蛋白的免疫球蛋白链。还包括双特异性 抗体。双特异性或双功能抗体是具有两个不同的重^/轻链对和两个不同的
结合位点的人工杂种抗体。本发明的其他抗原结合片段或抗体部分包括二 价scFv (双抗体) 一一其中抗体分子识别两种不同表位的双特异性scFV 抗体、单结合结构域(dAb)和小抗体(minibody)。
可以通过完整抗体的酶学修饰或化学修饰产生本文所述的各种抗体 或抗原结合片段，或使用重组DNA方法从头合成(例如单链Fv)，或使 用噬菌体展示文库鉴定(见例如McCafferty等，Nature 348:552-554， 1990 )。例如，可使用本领域例如Vaughan and SoHazzo, Comb Chem High Throughput Screen. 4:417-30 2001中所述方法产生小抗体。可通过大量方 法产生双特异性抗体，所述方法包括杂交瘤的融合或Fab'片段的连接。见 例如Songsivilai & Lachmann， Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny等，J. Immunol. 148,1547-1553 (1992)。可使用噬菌体展示文库或 核糖体展示文库、基因改组文库鉴定单链抗体。这类文库可从合成的、半 合成的或幼稚的(nave)和具有免疫活性的来源构建。
"嵌合抗体"是一种抗体分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、替换或
更换，从而抗原结合位点(可变区)与类型、效应子功能和/或物种不同或 改变的恒定区连接，或与赋予嵌合抗体新特性的完全不同的分子连接，所 述分子例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或(b)可变区或其部分用 具有不同或改变的抗原特异性的可变区更换、替换或改变。例如，如下文实施例中所示，可通过用来自人免疫球蛋白的恒定区替换小鼠抗-hPARl 抗体的恒定区对其进行修饰。归因于用人恒定区的替换，该嵌合抗体能够 保留其识别人PAR1的特异性，同时与原始的小鼠抗体相比在人中具有降 低的抗原性。
"人源化的"抗体是保持非人抗体的反应性但在人中免疫原性较低的抗 体。这可以通过例如保留非人CDR区并将抗体的剩佘部分替换为其人类 对应物(即恒定区以及可变区的构架部分)达成。见例如Morrison等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855， 1984; Morrison and Oi， Adv. Immunol.， 44:65-92, 1988; Verhoeyen等，Science, 239:1534-1536， 1988; Padlan， Molec. Immun" 28:489-498， 1991;和Padlan， Molec. Immun.， 31:169-217， 1994。
术语"抗体结合分子"或"非抗体配体"是指使用非免疫球蛋白的蛋白质
支架的抗体才莫拟物，包括adnectin、 avimer、单链多肽结合分子和抗体样 结合性肽模拟物(antibody-like binding peptidomimetic)。
本文使用术语"拮抗剂"是指下述药剂(agent)，所述药剂能够特异结合 受体并抑制通过受体的信号转导，以完全阻断或可检测地抑制受体介导的 应答。例如，PARI的拮抗剂特异地结合该受体，并全部或部分地抑制 PARl-介导的信号转导。在一些情况下，能够通过PARl拮抗剂的下述能 力对其进行鉴定其能够结合PAR1并抑制继自PARI的细胞内信号转导 出现的凝血酶诱导的钙流或凝血酶诱导的IL-8生产(例如在FlipR测定法 中测量，或通过ELISA测量)。另外的测定法由Kawabata，等，J Pharmacol Exp Ther. (l外9) 288(l):358-70描述。当来自与本发明拮抗剂接触的PARI 的PARI细胞内信号转导(例如通过钩流或IL-8生产所测量的)与来自未 与拮抗剂接触的对照PARI的细胞内信号转导相比减少至少约10%，例如 减少至少约25%、 50%、 75%或被完全抑制时，发生抑制。对照PAR1可 不与抗体或抗原结合分子接触、或与特异结合另 一抗原的抗体或抗原结合 分子接触，或与已知不作为拮抗剂起作用的抗-PARl抗体或抗原结合分子 接触。"抗体拮抗剂"是指拮抗剂是抑制性抗体的情况。术语"蛋白酶活化受体-l"、"蛋白水解酶活化受体-l，，或"PARl，，可互换 地表示通过凝血酶切割以暴露N-端束绰配体而被活化的G-蛋白偶联受体。 PARI还称为"凝血酶受体"和"凝血因子II受体前体"。见例如Vu，等，Cell (1991) 64(6):1057-68; Coughlin， et al， J Clin Invest (1992) 89(2):351-55;和 GenBank登录号NM—001992。束縳配体与PARI细胞外结构域的分子内 结合引发细胞内信号转导和钙流。见例如Traynelis and Trejo， Curr Opin Hematol (2007) 14(3):230-5;和Hollenberg， et al， Can J Physiol Pharmacol. (1997)75(7):832-41。 PARI的核苷酸和氨基酸序列是本领域已知的。见例 如Vu，等，Cell (1991) 64(6): 1057-68; Coughlin， et al， J Clin Invest (1992) 89(2):351-55;和GenBank登录号NM—001992。人PARI的核酸序列作为 GenBank登录号NM_001992(也见M62424.1和gi4503636 乂>开。人PARI 的^J^^^列作为NP_001983和AAA36743公开。本文使用的PARI多 肽在功能上是G蛋白偶联受体，其被凝血酶活化，并在N-端束绰配体结 合后引发细胞内信号转导和钙流。PARlM^f列在结构上与GenBank 登录号NP—001983、 AAA36743或M62424.1的^J^酸有至少约90%、91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%的序列同一 性。PARI核苷酸序列在结构上与GenBank登录号NM_001992或 M62424.1的^J^酸有至少约90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%的序列同一性。
抗体或抗原结合分子的结合特异性是指抗体或抗原结合分子个体的 结合部位(combining site)与仅一种抗原决定簇反应的能力。典型的抗体的 结合部位位于分子的Fab部分，并由重链和轻链的高变区组成。在一些实 施方案中，结合特异性是指被本发明的抗体优先结合的PARI多肽中的特 定表位(例如SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTE或其片段)。共
有对特定表位的结合特异性的抗体会竟争结合该表位。如使用本领域已知 的任何结合测定法例如固相放射免疫测定法(SPRIA)所测量的，与共同表 位竟争结合的抗体能够彼此置换与该共同表位结合，在所述SPRIA测定法 中用放射性同位素标记第一竟争性抗体或第二竟争性抗体。共享结合特异性的竟争性抗体并不必与同一表位结合，而是可以与重叠的表位结合，从 而允许在结合测定法中发生竟争性置换。在一些实施方案中，结合特异性
是指与本发明的抗体优先结合的PAR亚型(例如PARI对PAR2或另一 PAR亚型，例jn PAR3或PAR4 )。
结合亲合力(binding affinity)是单个抗原决定簇和抗体或抗原结合分 子上的单个结合位点之间反应的强度。其是作用于抗原决定簇和结合位点 之间的吸引力和排斥力的总和。亲和力(affinity)是描述抗原抗体反应的平 衡常数。
短语"特异(或选择性)结合"是指在一群异质蛋白质和其他生物制品 中抗体或抗原结合分子(例如抗-hPARl抗体)和关连抗原(例如人PARI 多肽)之间的优先结合反应。短语"识别抗原的抗体"和"对抗原特异的抗体" 在本文中与术语"特异结合抗原的抗体"可互换使用。公认的是抗体和非靶
标表位之间可能发生某种程度的非特异相互作用。然而，特异结合可以通 过如下方式辨别其通过对靶标表位的特异识别来介导。特异结合通常导 致在递送的分子和带有耙标表位的实体(例如测定孔或细胞)之间比在所 结合抗体和缺乏靶标表位的实体(例如测定孔或细胞)之间有强得多的结 合。特异结合通常导致与结合到缺乏靶标表位的细胞或组织上的抗-PARl 抗体数量(每单位时间)相比，结合到带有靶标表位的细胞或组织上的抗 -PARI抗体数量(每单位时间)有大于约10倍且最优选大于100倍的增 加。两个实体之间的特异结合一般意味着至少1(^M"的亲和力。优选大于 108 M—1的亲和力。可使用本领域已知用于抗体结合的任何测定法测定特异 结合，包括Western印迹、ELISA、流式细胞术、免疫组织化学。
术语"表位，，表示能够特异结合抗体的蛋白质决定簇。表位通常由分子 的化学活性表面定群(grouping )如氨基酸或糖侧链组成，并通常具有特 异的三维结构特征以及特异的电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在 于存在变性剂时与前者的结合丧失而与后者的结合则不丧失。
术语"核酸，，在本文中与术语"多核苷酸"可互换使用，并表示单链或双 链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或键的核酸，其可以是合成的、天然存在 的和非天然存在的，其具有与参照核酸类似的结合特性，且其以类似于参 照核苷酸的方式代谢。这些类似物的实例包括，但不仅限于硫代磷酸酯、
氨基磷酸酯、曱基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
除非另有说明， 一个特定的核酸序列还隐含包括其保守修饰(例如简 并密码子替代)变体和互补序列，以及明确指出的序列。特别地，如下文 所述，可通过产生下述序列达成简并密码子替代，其中一个或多个选定的 (或所有)密码子的第三位被替代为混合的威基和/或脱氧肌苷残基(Batzer 等，Nucleic Acid Res. 19:5081， 1991; Ohtsuka等，J. Biol. Chem. 260:2605-2608， 1985;和Rossolini等，Mol. Cell. Probes 8:91-98， 1994)。
术语"氨基酸"是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存 在的氨基酸的方式发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的 氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及^皮随后修饰的氨基酸(例如羟脯 氨酸、y-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸)。氨基酸类似物是指与天然存在的 氨基酸具有相同基本化学结构(即与氢、羧基、氨基和R基团结合的a碳) 的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸曱基锍。 这类类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但是保 留与天然存在的M酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指下述化合 物，其具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但是以类似于天然存在
的氨基酸的方式发挥作用。
术语"多肽"和"蛋白质，，在本文中可互换使用表示氨基酸残基的聚合 物。该术语适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合 物，以及其中 一个或多个M酸残基是相应天然M酸的人工化学模拟物 的氨基酸聚合物。除非另有说明， 一个特定的多肽序列也隐含包括其保守 修饰的变体。
术语"保守修饰的变体"适用于氨基酸和核酸序列。就具体的核酸序列 而言，保守修饰的变体是指这些核酸编码相同或基本相同的氨基酸序列，
18或当这些核酸不编码M酸序列时，编码基^目同的序列。由于遗传密码 的简并性，任何给定的蛋白质都可以由大量功能上相同的核酸编码。例如，
密码子GCA、 GCC、 GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码 子规定丙氨酸的每个位置上，均可以将该密码子改变为所述的任何相应密 码子，而不改变所编码的多肽。这样的核酸变异是"沉默变异"，其是保守 修饰变异的一种。本文中编码多肽的每条核酸序列也描述了该核酸的每种 可能的沉默变异。本领域技术人员明白，核酸中的每个密码子(除了 AUG, 其通常是甲硫氨酸的唯一密码子，和TGG，其通常是色氨酸的唯一密码子) 均可以被改变，以产生功能上相同的分子。因此，在描述的每个序列中暗 含了编码多肽的核酸的每个沉默变异。
对多肽序列而言，"保守修饰的变体"包括对多肽序列的替代、缺失或 添加，其导致氨基酸被化学上相似的氨基酸替代。提供功能相似氨基酸的 保守替代表是本领域公知的。这类保守修饰的变体还可以是并且不排除多 态变体、种间同源物和本发明的等位基因。以下八组含有彼此是保守性替 代的氨基酸l)丙氨酸(A)、甘氨酸(G); 2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E); 3)天 冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q); 4)精氨酸(R)、赖氨酸(K); 5)异亮氨酸(1)、亮氨 酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V); 6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W); 7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(见例如 Creighton， Proteins (1984))。
与两条或两条以上核酸或多肽序列相关时，术语"同一(相同)"或百分 比"同 一性，，是指相同的两条或两条以上序列或亚序列。如果使用以下的序 列比较算法之一测量或通过手工比对和目视观察测量，当在比较窗口或指 定区域中为获得最大对应而进行比较和比对时两条序列具有规定百分比 的相同氨基酸残基或核苷酸(即在指定区域上或当在不指定时在整条序列 上有60%同一性，任选地65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%或 99%同一性)，则这两条序列是"基本同一"的。任选地，同一性存在于长 度至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域上，或更优选存在于长度 为100到500或1000到更多个核苷酸(或的区域上。
对序列比较而言，通常一条序列作为与待测序列进行比较的参照序 列。使用序列比较算法时，将待测和参照序列输入计算机，需要时指定亚 序列坐标，并指定序列算法程序参数。可使用默认的程序参数，或可指定 备选参数。随后序列比较算法以程序参数为基础计算待测序列相对于参照 序列的百分比序列同一性。
本文使用的"比较窗口 "包括提及具有选自以下的任一连续位置数目的
区段20到600，通常约50到约200，更通常约100到约150，其中可以 在将一条序列与具有相同连续位置数目的参照序列进行最佳比对之后比 较该两条序列。用于比较的序列比对方法是本领域^^知的。可如下进行为 了比较的最佳序列比对，例如通过Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482c, 1970的局部同源性算法；通过Needleman and Wunsch， J. Mol. Biol. 48:443， 1970的同源性比对算法；通过Pearson and Lipman， Proc. Nat，l. Acad. Sci. USA 85:2444， 1988的相似性搜索方法；通过这些算法的计 算机化执行程序(Wisconsin Genetics软件包中的TFASTA、 FASTA、 BESTFIT和GAP, Genetics Computer Group, Madison, WI);或通过手 动比对和目视观察(见例如Brent等,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed.， 2003))。
适用于测定百分比序列同 一 性和序列相似性的算法的两个实例是 BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等，Nuc. Acids Res. 25:3389-3402， 1977;和Altschul等，J, Mol. Biol. 215:403-410， 19卯中。公众 可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)获得用于进行BLAST分析的软件。该算法涉及首先，通过 在查询序列中鉴定长度为W的短字来鉴定高得分序列对(HSP)，所述短字 当与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或者满足某正值阈分数T。 T
是指相邻字得分阈值(上引文Altschul等)。这些初始的相邻字命中物(hit) 作为种子起作用，用于起始搜索以发现含有它们的更长HSP。将字命中物 在两个方向上沿着每个序列延伸，只要累计的比对分数能够提高即可。对核苷酸序列而言，使用参数M(—对匹配残基的奖励分数；始终X))和N (错配残基的惩罚分数；始终<0)计算累计分数。对M酸序列而言，使 用评分矩阵计算累计分数。字命中物在每个方向上的延伸在下列情形下终 止当累计比对分数从其达到的最大值减少数量X时；当累计分数由于一 个或多个负分残基比对的累计而走向零或低于零时；或当达到任一序列的 终点时。BLAST算法参数W、 T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN 程序(对核苷酸序列而言)默认使用ll的字长(W)、 IO的预期(E)、 M=5、 N二4和双链比较。对氨基酸序列而言，BLASTP程序默认使用3的字长、 10的预期(E)、BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff and Henikoff， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915， 1989 ) 50的比对(B)、 10的预期(E)、 M=5、 N=-4 和双链比较。
BLAST算法还进行两条序列之间相似性的统计学分析(见例如Karlin and Altschul， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787， 1993 ) 。 BLAST算 法提供的一种相似性度量是最小总和概率(P(N)),其指出两条核苷酸或氨 基酸序列之间由偶然而发生匹配的概率。例如，如果在待测核酸与参照核 酸的比较中最小总和概率少于约0.2，更优选少于约0.01，最优选少于约 0.001,则认为该核酸与参照序列类似。
除了上述的序列同 一性百分比以外，两条核酸序列或多肽基本同 一的 另 一指标是，第 一核酸编码的多肽可与抗第二核酸编码的多肽产生的抗体 发生免疫交叉反应，如下所述。因此，例如当多肽与第二多肽的差异仅在 于保守性替代时，该多肽通常与第二多肽是基本同一的。两条核酸序列基 本同一的另一指标是，两个分子或其互补体在严格条件下彼此杂交，如下 所述。两条核^列基本同一的又一指标是可使用相同的引物扩增序列。
术语"有效连接"是指两条或更多条多核苷酸(例如DNA)区段之间的 功能关系。通常，其是指转录调节序列与^L转录序列的功能关系。例如， 如果启动子或增强子序列刺激或调控编码序列在适当宿主细胞或其他表 达体系中的转录，则该启动子或增强子序列与该编码序列是有效连接的。 一般，与被转录序列有效连接的启动子转录调节序列将在物理上与被转录序列毗邻，即它们是顺式作用的。然而， 一些转录调节序列如增强子不必 与待由它们增强转录的编码序列在物理上毗邻或紧靠。
术语"载体"旨在表示能够转运与^目连的另 一多核苷酸的多核苷酸分
子。 一种类型的载体是"质粒"，其指额外的DNA区段可连接在其中的环 形双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可 以被连接进病毒基因组中。某些载体能够在其导入的宿主细胞中自主复制 (例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体 (例如非附加型哺乳动物载体)能够在引入宿主细胞后整合进宿主细胞的 基因组中，从而随宿主基因组一起复制。另外，某些载体能够指导与它们 有效连接的基因的表达。这类基因在本文中称作"重组表达栽体"(或简单 地称作"表达载体")。通常，重组DNA技术中使用的表达栽体常为质粒 形式。在本i兌明书中，"质粒"和"载体"可互换^f吏用，因为质粒是最常使用 的载体形式。然而，本发明旨在包括提供等价功能的其他形式的表达载体， 如病毒载体(例如复制缺陷的逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
术语"重组宿主细胞"(或简单地称作"宿主细胞")是指其中引入了重 组表达载体的细胞。应当理解，这类术语旨在不仅指该特定的主题细胞， 而且指该细胞的后代。因为在随后的世代中可由于突变或环境的影响发生 某些修饰，所以事实上这些后代与亲本细胞可能不同，但是仍然包括在本 文使用的术语"宿主细胞"的范围内。
术语"受试者，，包括人和非人动物。非人动物包括所有的脊推动物，例 如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类、绵羊、犬、牛、鸡、两栖动物 和爬行动物。除非另有说明，术语"患者，，或"受试者"在本文中可互换使用。 术语"治疗"包括施用化合物或药剂，以预防或延迟疾病(例如肿瘤) 的症状、并发症或生物化学指标的出现，减轻症状或阻止或抑制疾病、状 况或病症的进一步发展。治疗可以是预防性的(以预防或延迟疾病的发生， 或预防其临床或亚临床症状的显现)，或是疾病显现后症状的治疗性阻抑 或减轻。
短语"信号转导途径"或"信号途径"(例如PARI信号转导途径)是指至少一种生物化学反应，但是更通常表示一系列生物化学反应，其由细 胞与刺激性化合物或药剂的相互作用引起。因此，刺激性化合物(例如凝 血酶)与细胞的相互作用导致"信号"，所述信号通过信号转导途径传递， 最终引起细胞应答。
附图概述


图1显示小鼠抗-hPARl抗体克隆4E7J14丄16和6E11.H6.A9的可变 区核苷酸序列(SEQ ID NOS:l-4)。加下划线的残基指出CDR区。其他残 基表示构架区。
图2显示小鼠抗-hPARl抗体克隆4E7.J14.L16和6E11.H6.A9可变区 的M酸序列(SEQ ID NOS:5-8)。加下划线的序列表示CDR区，其他序 列部分表示构架区。
图3显示由凝血酶刺激的HUVEC细胞的IL-8分泌被小鼠抗-hPARl 抗体克隆4E7J14丄16或6E11.H6.A9抑制。
图4阐述了在钙流(FlipR)测定法中测量的克隆4E7.J14的强拮抗剂活性。
图5阐述了在钙流(FlipR)测定法中测量的克隆6Ell.H6的强拮抗剂活性。
发明详述
介绍
分子。在小鼠中产生的该抗-hPARl抗体或在体外创建的该嵌合抗-hPARl 抗体能够与人PAR1多肽特异结合。另外，发现这些抗体能够抑制PARI 信号转导介导的活动，例如凝血酶介导的白介素分泌。因此，这些抗体可 用作大量疾病或病症的治疗性或预防性药剂，所述疾病或病症由PARI信 号转导活性介导或与:M目关，例如肠易激综合征或肝纤维化。以下的小节 提供了制造和使用本发明組合物的指导。2. 人PARI的拮抗剂抗体或抗原结合分子 a.综述
本发明提供了特异结合人PARI的抗体或抗原结合分子。这些抗 -hPARl药剂能够拮抗PARI介导的信号转导活性，例如PARI介导的白 介素分泌，如下文实施例中所述。制备单克隆或多克隆抗体的一般方法是 本领域公知的。见例如Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1998; Kohler & Milstein, Nature 256:495-497， 1975; Kozbor等， Immunology Today 4:72， 1983;和Cole等,pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 1985。
优选本发明的抗-hPARl抗体是单克隆抗体，如以下实施例中描述的 抗-hPARl抗体克隆4E7,J14丄16或克隆6E11.H6.A9。这两个举例的抗 -hPARl单克隆抗体的可变区的多核苷酸序列和氨基酸序列分别显示在图 1和图2中。单克隆抗体是指来自单个克隆的抗体。可使用生产单克隆抗 体的任何技术生产本发明的抗-hPARl抗体，例如B淋巴细胞的病毒转化 或致癌性转化。 一种制备杂交瘤的动物系统是鼠系统。小鼠中的杂交瘤生 产是一种已非常完善的操作程序。如以下的实施例中所阐述的，可通过用 hPARl多肽或其片段、融合蛋白或变体免疫非人动物(例如小鼠)产生单 克隆抗-hPARl抗体。然后将分离自该动物的B细胞与骨髓瘤细胞融合， 产生生产抗体的杂交瘤。可通过在ELISA测定法中使用hPARl多肽或融 合蛋白筛选杂交瘤，获得单克隆小鼠抗-hPARl抗体。免疫方案和分离用 于融合的经免疫的脾细胞的技术是本领域公知的。融合配偶体(例如鼠骨 髓瘤细胞)和融合步骤也是本领域公知的，例如上引文Harlow & Lane。
SEQ ID NOS:5-8中显示了下文实施例中描述的示范性小鼠抗-PARl 抗体(克隆4E7J14丄16和6E11.H6.A9 )的重链和轻链可变区的氨基# 列。克隆4E7J14丄16的重链可变区的CDR序列为DYYMN(CDRl; SEQ ID NO:21)、 VIDPHNGRSRYNQMFKG (CDR2; SEQ ID綠22)和 DDGPSHWYFDV (CDR3; SEQ ID NO:23)。其轻链可变区的CDR序列为RSSQNIVHSNGNTYLE (CDR1; SEQ ID NO:24)、 KVSNRFS (CDR2; SEQ ID NO:25)和FQGSHVPFT (CDR3; SEQ ID NO:26)。克隆 6E11.H6.A9的重链可变区的CDR序列为DHTFH (CDR1; SEQ ID NO:27) 、 YIFPRDGSTKYNEKFKG (CDR2; SEQ ID NO:28)和 HYYGSFEY (CDR3; SEQ ID NO:29)。其轻链可变区的CDR序列为 RSSQSLVHSNGNTYLH (CDR1; SEQ ID餘30)、 KVSNRFS (CDR2; SEQ ID NO:31)和SQSTHLPLT (CDR3; SEQ ID NO:32)。
典型的完整抗体主要通过位于六个重链和轻链互补性决定区(CDR)内 的氨基酸残基与靶标抗原相互作用。通常，本发明的抗-hPARl抗体的重 链CDR序列或轻链CDR序列中至少一个与抗-PARl抗体克隆 4E7.J14.L16或6E11.H6.A9的相应CDR序列相同。本发明这些抗-hPARl 抗体中的一些与参照抗体具有相同的结合特异性，因此与参照抗体竟争 PARI N-端束绰配体内的表位，例如氨基酸序列 SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTE (SEQ ID NO:38)或其片段(例 如前述氨基酸序列中的8、 9、 10、 11、 12、 13、 14或15个连续氨基酸) 内的表位。本发明的一些抗-hPARl抗体在其重链和轻链可变区内的所有 CDR序列分别与抗-PARl抗体克隆4E7,J14丄16或6E11.H6.A9的相应 CDR序列相同。因此，这些抗-hPARl抗体可具有分别与SEQIDNO:21、 SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23相同的三条重链CDR序列，和分别与 SEQ ID NO:24、 SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26相同的三条轻链CDR 序列。它们也可以具有分别与SEQ ID NO:27、 SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29相同的三条重链CDR序列，和分别与SEQ ID NO:30、 SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32相同的三条轻链CDR序列。
本发明的一些抗-hPARl抗体具有分别与小鼠抗体克隆4E7,J14丄16 或6E11.H6.A9的相应可变区序列相同的完整重链和轻链可变区序列。在 一些其他的实施方案中，除了相同的CDR序列以外，抗体在可变区的构 架部分中含有与小鼠抗-PARl抗体克隆4E7,J"丄16或6E11.H6.A9的相 应氨基酸残基不同的氨基酸残基(例如下文所述的一些人源化抗-hPARl抗体)。然而，这些抗体通常在整个可变区序列上与小鼠抗-PARl抗体克 隆4E7,J14丄16或克隆6E11.H6.A的相应可变区序列基本(例如75%、 85%、 90%、 95%或99%)同一。
本发明的抗-hPARl抗体可以是含有两条重链和两条轻链的完整抗 体。它们也可以是完整抗体的抗原结合分子或单链抗体。本发明的抗 -hPARl抗体包括在非人动物中生产的抗体(例如小鼠抗-hPARl抗体克隆 4E7,J14丄16或6E11.H6.A)。它们也包括修饰的抗体，其为小鼠抗-hPARl 抗体克隆4￡7.^4丄16或6￡11.116丄的修饰形式。通常，该修饰的抗体是 重组抗体，其具有相对于示例的小鼠抗体的特性而言相似或改进的特性。 例如，可以通过删除恒定区并用不同的恒定区替换来修饰在下文实施例中 示例的小鼠抗-hPARl抗体，所述不同的恒定区可导致抗体的提高的半衰 期(例如血清半衰期)、稳定性或亲和力。例如可通过构建表达载体创建 修饰的抗体，所述表达载体包含被移植到具有不同特性的来自不同抗体的 构架序列上的来自小鼠抗体的CDR序列，(Jones等1986， Nature 321， 522-525)。这样的构架序列可得自公众DNA数据库(例如来自 www.kabatdatabase.com )。
一些修饰的抗体是嵌合抗体，其含有部分人免疫球蛋白序列(例如恒 定区)和部分非人免疫球蛋白序列(例如小鼠抗-hPARl抗体克隆 4E7,J14丄16或6E11.H6.A的小鼠抗-hPARl抗体可变区序列)。 一些其他 的修饰的抗体为人源化抗体。人源化抗体一般具有引入其中的来自非人来 源的一个或多个氨基酸残基。人源化非人抗体的方法是本领域公知的，例 如U.S. Pat. Nos. 5,585,089和5,693,762; Jones等，Nature 321: 522-25， 1986; Riechmann等，Nature 332: 323-27， 1988;和Verhoeyen等，Science 239: 1534-36， 1988。这些方法可容易地用于产生本发明的人源化抗-hPARl抗 体，其通过用来自非人抗-hPARl抗体的至少一部分CDR替代人抗体的相 应区域进行。在一些实施方案中，本发明的人源化抗-hPARl抗体的每条 免疫球蛋白链中的所有三个CDR均来自小鼠抗-hPARl抗体克隆 4E7,J14丄16或6E11.H6.A 5，其净皮移植进相应的人构架区中。上述抗-hP AR1抗体在可变区和恒定区二者中均可以经受非关键性氨 基酸的替代、添加或缺失而不会丧失结合特异性或效应子功能，或不会出 现不能容忍的亲合力降低。通常，掺入这类改变的抗体显示出与它们来源 自的参照抗体(例如小鼠抗-hPARl抗体克隆4E7,J14丄16或6E11.H6.A) 具有实质上的序列同一性。例如，本发明的一些抗-hPARl抗体的成熟轻 链可变区与示例的小鼠抗-hPARl抗体的成熟轻链可变区的序列具有至少 75%或至少85%的序列同一性。类似地，该抗体的成熟重链可变区通常显 示出与示例的抗-hPARl抗体的成熟重链可变区序列具有至少75%或至少 85%的序列同一性。 一些修饰的抗-hPARl抗体具有与示例的小鼠抗 -hPARl抗体相比相同的特异性和提高的亲和力。通常，修饰的抗-hPARl 抗体的亲和力在参照小鼠抗-hPARl抗体的2、 5、 10或50倍内。
b.嵌合和人源化的抗-hPARl抗体
本发明的一些抗-hPARl抗体是嵌合(例如小鼠/人)抗体，其由来自 非人抗-hPARl抗体拮抗剂的区域与人抗体的区域一起组成。例如，嵌合 H链可包含本文示例的小鼠抗-PAR1抗体的重链可变区的抗原结合区(例 如SEQ ID NO:5或7)，其与人重链恒定区的至少一部分连接。该嵌合重 链可与嵌合L链組合，所述嵌合L链含有示例性小鼠抗-hPARl抗体的轻 链可变区的抗原结合区(例如，SEQIDNO:6或8)，其与人轻链恒定区 的至少一部分连接。
本发明的嵌合抗-hPARl抗体可根据下文实施例中的公开内容以及本 领域已知的方法生产。例如，可用限制性酶消化编码鼠抗-hPARl抗体或 抗原结合分子的重链或轻链的基因，以去除鼠Fc区，并用编码人Fc恒定 区的基因的等价部分替代。适用于表达重组抗体，尤其是表达人源化抗体 的表达载体和宿主细胞是本领域公知的。可使用标准的重组技术，例如 Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (3rd ed.， 2001);和Brent等，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed.， 2003)，构建表达嵌合基因的 载体，所述嵌合基因编码抗-hPARl免疫球蛋白链。人恒定区序列可选自多种参照来源，包括但不仅限于Kabat等，S叫uences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1991中所列的那些。本 领域也已教导了通过DNA重组生产嵌合抗体的更具体教导，例如 Robinson等，国际专利申请PC1YUS86/02269; Akira等，欧洲专利申请 184,187; Taniguchi， M.，欧洲专利申请171,496; Morrison等，欧洲专利 申请173,494; Neuberger等，国际申请WO 86/01533; Cabilly等美国专利 No. 4，816，567; Cabilly等，欧洲专利申请125,023; Better等，Science 240:1041-1043， 1988; Liu等，PNAS 84:3439-3443, 1987; Liu等，J. Immunol. 139:3521-3526， 1987; Sun 等，PNAS 84:214-218， 1987; Nishimura等，Cane. Res. 47:999-1005， 1987; Wood等，Nature 314:446-449， 1985; Shaw等，J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559， 1988。
可对具有来自非人抗体的完整可变区的嵌合抗体进一步人源化，以降 低该抗体在人中的免疫原性。这通常如下完成将Fv可变区(构架区或 非-CDR区)中的某些序列或氣基酸残基替为来自人Fv可变区的等价序列 或氨基酸残基。这些被额外替代的序列或氨基酸残基通常不直接参与抗原 结合。更通常如下进行非人抗体的人源化仅用非人抗体(例如本文示例 的小鼠抗-PARl抗体)的CDR替换人抗体中的CDR。在一些情况下，随 后将人构架区中的一些额外的残基替成来自非人供体抗体的相应残基。为 了改进与抗原的结合，常需要这些额外的移植。这是因为仅具有移植自非 人抗体的CDR的人源化抗体与非人供体抗体相比，可能具有不够完善的 结合活性。因此，除CDR以外，在本发明的人源化抗-hPARl抗体的人构 架区内通常一些氨基酸残基可能被替换为来自非人供体抗体(例如本文示 例的小鼠抗体)的相应残基。通过CDR替代生产人源化抗体的方法，包 括选择用于替换的构架区残基的标准，是本领域公知的。例如，除了涉及 生产嵌合抗体的上述技术夕卜，在例如Winter等，UK Patent Application GB 2188638A (1987)， U.S. Patent 5,225,539; Jones等，Nature 321:552-525， 1986; Verhoeyan等，Science 239:1534, 1988;和Beidler等，J. Immunol.Ul"053-4060， 19幼中提供了制造人源化抗体的其它教导。也可以使用如 题为"Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes."的WO 94/10332中所述的寡核普酸定点 诱变进行CDR替代。
本发明的嵌合或人源化的抗-hPARl抗体可以是单价、二价或多价的 免疫球蛋白。例如，单价嵌合抗体是二聚体(HL),其由通过二硫键与嵌合 的L链结合的嵌合的H链形成，如上所述。二价嵌合抗体是四聚体(H2 L2)， 其由通过至少一个二硫键结合的两个HL 二聚体形成。多价嵌合抗体基于 链的聚集。
c.人抗-hPARl抗体
除了嵌合的或人源化的抗-hPARl抗体以外，还包括在本发明中的是 完全人抗体，其显示相同的结合特异性和相当的或更好的结合亲合力。例 如，人抗-hPARl抗体可具有相对于参照非人抗-PARl抗体(例如小鼠抗 -hPARl抗体克隆4E7J14丄16或6E11.H6.A )而言相同或更好的结合特征 (例如结合特异性和/或结合亲合力)。参照非人抗体可以是含有SEQ ID NO:5的重链可变区序列和SEQ ID NO:6的轻链可变区序列的小鼠抗 -PARI抗体。其还可以是含有SEQ ID NO:7的重链可变区序列和SEQ ID NO:8的轻链可变区序列的小鼠抗-PARl抗体。与嵌合的或人源的化抗体 相比，本发明的人抗-hPARl抗体施用给人受试者时具有进一步降低的抗 原性。
可使用本领域已知的方法产生人抗-hPARl抗体。例如，美国专利申 请系列号10/778，726(公开号No. 20050008625 )中已公开了下述体内方法 在抗体中用人可变区替换非人抗体可变区，同时相对于非人抗体的结合特 征而言维持相同的或提供更好的结合特征。该方法依赖于表位引导的、完 全人抗体对非人参照抗体可变区的替换。得到的人抗体一般在结构上与参 照非人抗体无关，但是与参照抗体结合相同抗原上的相同表位。简言之， 如下实现系列表位引导的互补性置换法在存在报告分子体系时，在细胞 中建立"竟争者，，和的如下文库之间对有限量抗原的结合竟争，其中所述文
29库由参照抗体的各种杂种("受试抗体")組成，所述报告分子体系将响应
受试抗体与抗原的结合。竟争者可以是参照抗体或其衍生物，如单链Fv 片段。竟争者也可以是与参照抗体结合相同表位的抗原的天然或人工配 体。竟争者的唯一要求是其与参照抗体结合相同的表位，并且其与参照抗 体竟争结合抗原。受试抗体具有共同的一个来自非人参照抗体的抗原结合 V-区，而另一个V-区随机选自不同的来源，如人抗体全文库(repertoire library)。来自参照抗体的共同V-区发挥向导作用，使受试抗体以相同的 方向定位于抗原的相同表位上，从而导致偏向于对参照抗体的最高抗原结 合保真度(fidelity)的选择。
可使用许多类型的报告分子体系检测受试抗体和抗原之间期望的相 互作用。例如，可以将互补的报告分子片段分别与抗原和受试抗体相连， 从而只有当受试抗体与抗原结合时才发生通过片段互补而致的报告分子 活化。当受试抗体-和抗原-报告分子片段融合物与竟争者共表达时，报告 分子的活化将取决于受试抗体与竟争者竟争的能力，所述能力与受试抗体 对抗原的亲和力成比例。可使用的其他报告分子体系包括美国专利申请系 列No. 10/208,730 (公开号20030198971 )中公开的自抑制的报告分子再活 化体系(RAIR)中的再活化因子(reactivator)，或美国专利申请系列No. 10/076,845 (公开号20030157579)中公开的竟争性活化体系。
使用系列表位引导的互补性置换体系进行选择，鉴定表达竟争者、抗 原和报告分子组分以及单个受试抗体的细胞。在这些细胞中，各受试抗体 与竟争者一对一地竟争结合有限量的抗原。才艮告分子的活性与受试抗体所 结合的抗原量成比例，所述抗原量又与受试抗体对抗原的亲和力和受试抗 体的稳定性成比例。最初相对于作为受试抗体表达时的参照抗体的活性， 以受试抗体的活性为基础选择受试抗体。第一轮选择的结果是一组"杂种" 抗体，其中每个杂种抗体都由相同的来自参照抗体的非人V-区和来自文库 的人V-区组成，并均与参照抗体一样结合抗原上的相同表位。在第一轮选 出的杂种抗体中 一个或多个将具有与参照抗体相当或更高的抗原亲和力。
在第二个V-区置换步骤中，将第一步选出的人V-区用作向导，用于从具有多种多样的关连(cognate)人V区的文库中选择剩余的非人参照抗体 V区的人类置换物。在第一轮中选择的杂种抗体也可以用作第二轮选择的 竟争者。第二轮选择的结果是一组完全人抗体，其在结构上与参照抗体不 同，但是其与参照抗体竟争结合相同的抗原。 一些选择的人抗体与参照抗 体结合相同抗原上的相同表位。在这些选择的人抗体中， 一个或多个将与 参照抗体相比以相当或更高的亲和力结合相同的表位。
使用上文作为参照抗体描述的小鼠或嵌合抗-hPARl抗体之一，可容 易地使用本方法产生人抗体，所述人抗体以相同的结合特异性和相同或更 好的结合亲合力结合人PAR1。另外，这样的人抗-hPARl抗体也可商业得 自定制生产人抗体的7^司，例如KaloBios， Inc. (Mountain View, CA)。为 了获得对特定表位具有与初始非人抗体(例如小鼠抗-PARl抗体)相同或 更好的亲和力的人抗体，KaloBios, Inc. technologies使用人"受体"抗体文 库。然后产生定向的或表位聚焦的人抗体文库，该文库中的人抗体与非人 抗体结合同一表位，尽管具有不同的亲和力。然后在表位聚焦文库中选择 与初始非人抗体相比具有相似或更高亲和力的抗体。然后进一步分析鉴定 到的人抗体的亲和力和序列身份。
d.其他类型的抗-hPARl抗体
本发明的抗-hPARl抗体或抗原结合分子还包括单链抗体、双特异性 抗体和多特异性抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体是单链抗体。单 链抗体在单条稳定折叠的多肽链中含有来自重链和轻链二者的抗原结合 区。由此，单链抗体通常保持单克隆抗体的结合特异性和亲和力，但是比 起经典的免疫球蛋白具有相当小的尺寸。对某些应用而言。本发明的抗 -hPARl单链抗体与完整的抗-hPARl抗体相比可以提供许多有利的特性。 这些特性包括例如从身体中更快的清除、对诊断性成像和治疗而言更大的
组织透过率、和与基于小鼠的抗体相比免疫原性的显著降低。使用单链抗 体的其他可能益处包括在高通量筛选方法中增强的筛选能力和非肠胃外
应用的潜能。
可使用本领域已描述的方法制备本发明的单链抗-hPARl抗体。这类技术的示例包括描述于美国专利Nos. 4,946,778和5,258,498; Huston等， Methods in Enzymology 203:46-88， 1991; Shu等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995-7999， 1993;和Skerra等，Science 240:1038-1040， 1988中的技术。
在一些实施方案中，本发明提供了下述抗-hPARl抗体，其通过衍生 化或连接至另一功能性分子而产生结合多个结合位点或耙标表位的双特 异性或多特异性分子。该功能性分子包括另一肽或蛋白质(例如细胞因子、 细胞毒性剂、免疫刺激或抑制剂、Fab'片段或如上所述的其他抗体结合片 段)。例如，抗-hPARl抗体或其抗原结合部分可与另一个或多个结合分 子如另一抗体、抗体片段、肽或结合模拟物功能性连接(例如通过化学偶 联、遗传融合、非共价结合或其他方式)。因此，本发明的双特异性和多 特异性抗-hPARl抗体包含至少一个单克隆抗-hPARl抗体或其抗原结合 片段，并具有对人PAR1的第一结合特异性和针对第二乾标表位的第二结 合特异性。第二靶标表位可以是Fc受体，例如人FqRI或人Fey受体。 因此，本发明包括能够与表达FcyRl、 FcyR或FcsR的效应细胞(例如单 核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))和表iiA PARI的靶细胞(例如 癌细胞)二者结合的双特异性和多特异性分子。这些多特异性(例如双特 异性或多特异性)分子将人PARl-表达细胞靶向效应细胞，并引发Fc受 体介导的效应细胞活性，如对人PARl-表达细胞的吞噬、抗体依赖型细胞 介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放或超氧阴离子的产生。
可以通过本领域已描述的方法制造本发明的双特异性和多特异性抗 -hPARl分子。这些方法包括化学技术(见例如Kranz等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807， 1981) 、 polydoma技术(见例如美国专利No. 4,474,893 ) 或重组DNA技术。也可以通过使用本领域已知和本文所述的方法将组分 结合特异性(例如抗-FcR和抗-hPARl结合特异性)偶联，制备本发明的 双特异性和多特异性分子。例如，可独立地产生双特异性和多特异性分子
的各个结合特异性，然后使之彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时， 可使用多种偶联或交联剂用于共价缀合。交联剂的实例包括蛋白A、碳二
32亚胺、N-琥珀酰亚胺-S-乙酰硫代乙酸酯(SATA)、 N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡咬
二硫基)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-l-
羧酸酯(磺基-SMCC )。当结合特异性是抗体(例如两个人源化抗体)时，
它们可通过两条重链C-端铰链区的巯基成键而缀合。可在缀合前修饰铰链 区以含有奇数个(例如一个)巯基残基。
可通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)或 Western印迹测定法验证双特异性和多特异性分子与其特异把标的结合。 这些测定法一般通过使用对目的复合物特异的标记试剂(例如抗体)来检 测尤其感兴趣的蛋白质-抗体复合物的存在。例如，可使用例如酶联抗体或 抗体片段检测FcR-抗体复合物，其中所述酶联抗体或抗体片段识别并特异 结合该抗体-FcR复合物。或者，可使用多种其他免疫测定法中的任何一种 检测复合物。例如，可对抗体进行放射性标记，并在放射免疫测定(RIA) 中4吏用(见例如Weintraub, B.， Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986 )。可通过例如4吏用，计数器或闪烁计数器或通过》文 射自显影的手段检测该放射性同位素。
本发明的抗-hPARl抗体或抗原结合分子还包括具有驼科支架的单结 构域抗原结合单位。驼科动物包括骆駝、美洲驼和羊驼。驼科动物生产缺 乏轻链的功能性抗体。重链可变(VH)结构域自发折叠并独立地作为抗原结 合单位发挥功能。与经典的抗原结合分子(Fab)或单链可变区(scFv)中六个 CDR相比，其结合表面仅涉及三个CDR。驼科抗体能够达到与常规抗体 相当的亲合力。可使用本领域公知的方法，例如Dumoulin等，Nature Struct. Biol. 11:500—515， 2002; Ghah削di等，FEBS Letters 414:521-526， 1997;和Bond等，J Mol Biol. 332:643-55， 2003，生产基于驼科支架的抗 -PARI分子，其具有本文示例的小鼠抗-PARl抗体的结合特异性。
e.特异结合hPARl的非抗体配体
本发明的抗-PARl抗体或抗原结合分子还包括单抗体，其为使用纤连 蛋白m型结构域(FN3)支架的小抗体模拟物。纤连蛋白是在细胞外基质形成和细胞-细胞相互作用中起关键作用的大蛋白。其由三类(I、 II和III)
小结构域的许多个重复组成。FN3自身是免疫球蛋白超家族的一大亚家族 (FN3家族或s-型免疫球蛋白家族)的范例。FN3家族包括细胞粘附分子、 细胞表面激素和细胞因子受体、陪伴蛋白和碳水化合物结合结构域。FN3 支架发挥有效构架的作用，其上可以嫁接用于特异建造功能(specific building functions)的环。人纤连蛋白中存在15个FN3重复单位。通常， 本发明的这类抗原结合分子利用人纤连蛋白的第十个FN3单位作为支架。 其为小的单体，并且不具有二硫键。可使用本领域例如Koide等，J. Mol. Biol. 284: 1141-1151， 1998; Koide等，Proc. Natl Acad. Sci. USA 99:1253—1258， 2002;和Batori等，Protein Eng. 15:1015-20， 2002中所述的方 法，制备基于FN3的抗原结合分子，其显示与本文中示例的小鼠抗-PARl 抗体相同的结合特异性。也参见美国专利Nos. 6,818,418和7,115,396。
本发明的一些其他抗原结合分子使用来自A-结构域的支架。A-结构域 以多结构域串的形式存在于若干种细胞表面受体中。该家族的结构域结合 许多已知的靶标，包括小分子、蛋白质和病毒。截短分析显示靶标通常与 多个A-结构域接触，其中每个结构域独立地结合独特的表位。通过将多个 结合结构域组合产生的亲合力(avidity)是一种提高亲和性和特异性的有力 途径。可使用例如Gliemann等，Biol. Chem. 379:951-964， 1998; Koduri等， Biochemistry 40:12801—12807， 2001和Silverman等，Nat Biotechnol. 23:1556-61,2005中所述的方法产生这类结合PARI的抗原结合分子，其具 有本文示例的小鼠抗-PARl抗体的结合特异性。
已开发了以类似于抗体的方式靶向和结合靶标的其他化合物。这些"抗 体模拟物"中的某些使用非免疫球蛋白的蛋白质支架作为抗体可变区的备 选蛋白质构架。
例如，Ladner等(美国专利No. 5,260,203 )描述了具有下述结合特异 性的单多肽链结合分子，所述结合特异性与聚集的但是分子分离的抗体的 轻链和重链可变区的结合特异性类似。该单链结合分子含有通过肽接头连 结的抗体重链和轻链可变区二者的抗原结合位点，并会折叠成与两个肽抗体相似的结构。单链结合分子展示了超过常规抗体的若干优点，包括更小 的尺寸、更大的稳定性和更容易被修饰。
Ku等(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92(14):6552-6556 (1995))公开了 基于细胞色素b562的抗体的备选方案。Ku等(1995)产生了一个文库，其 中细胞色素b562的两个环被随机化，然后选择针对牛血清白蛋白的结合。 发现突变体个体和抗-BSA抗体相似地选择性地与BSA结合。
Beste等(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96(5):1898-1903 (1999))公开了 基于脂笼蛋白支架的抗体模拟物(Anticalin⑧)。脂笼蛋白由卩桶组成，在该 蛋白质的末端具有四个超变环。Beste (1999)对环进行随机诱变并选择例如 与荧光素的结合。三个变体显示与荧光素的特异结合，其中一个变体显示 与抗-荧光素抗体相似的结合。其他分析揭示所有被随机化的位置都是可变 的，说明Anticalin⑧将适合用作抗体的备选方案。
Anticalins⑧是小的单链肽，通常在160和180个残基之间，其提供了 超过抗体的若干优点，包括降低的生产成本、提高的储存稳定性和降低的 免疫反应。
Hamilton等(美国专利No. 5,770,380 )公开了使用calixarene的刚性 非肽有机支架的合成抗体模拟物，其中该支架与用作结合位点的多个可变 肽环结合。相对于彼此，这些肽环均在几何学上从calixarene的同侧射出。 由于该几何学的确定性，所有的环均可用于结合，提高了对配体的结合亲 合力。然而，与其他抗体模拟物相比，基于calixarene的抗体模拟物并不 绝对地由肽组成，因此，其较不容易被蛋白酶攻击。该支架不是纯由肽、 DNA或RNA组成，意味着该抗体模拟物在极端环境条件下相对稳定并且 具有长寿命。另外，因为基于calixarene的抗体模拟物相对较小，其较不 可能引起免疫原性应答。
Murali等(Cell. Mol. Biol. 49(2):209-216 (2003))讨论了将抗体简化为 更小的肽模拟物的方法，他们将所述肽模拟物称作"抗体样结合性肽模拟 物"(ABiP)，其也可用作抗体的备选方案。
3.用于生产抗-hPARl抗体的多核苷酸、载体和宿主细胞本发明提供了基本纯化的多核苷酸(DNA或RNA)，其编码下述多 肽，所述多肽包含上述抗-hPARl抗体链或抗原结合分子的区段或结构域。 本发明的一些多核苷酸包含SEQIDNO:l或3中所示的重链可变区的核苷 酸序列，和/或SEQ ID NO:2或4中所示的轻链可变区的核苷酸序列。本 发明的一些其他多核苷酸包含下述核苷酸序列，其与SEQ ID NOS:l-4中 所示核苷酸序列之一基本同一 (例如至少65%、 80%、 95%或99%)。从 适当的表达载体表达时，由这些多核苷酸编码的多肽能够显示抗原结合能 力。
本发明中还提供了如下多核苷酸，其编码下文实施例中所述的小鼠抗 -hPARl抗体的重链或轻链的至少一个CDR区，并通常编码所有三个CDR 区。 一些其他多核苷酸编码小鼠抗-hPARl抗体重链和/或轻链可变区序列 的全部或几乎全部。例如，这些多核苷酸中的一些编码SEQIDNO:5或7 中所示重链可变区的^J^酸序列和/或SEQ ID NO:6或8.中所示的轻链可 变区的M^列。因为密码简并，这些免疫球蛋白M^列之每一个 均可以由多种核酸序列编码。
本发明的多核苷酸能够仅编码抗-hPARl抗体的可变区序列。它们也 可编码抗体的可变区和恒定区二者。本发明核酸的一些多核苷酸序列编码 下述成熟的重链可变区序列，其与SEQ ID NO:5或7中所示成熟重链可变 区序列基本同一 (例如至少80%、 90%或99% )。 一些其他多核苷酸序列 编码下述成熟的轻链可变区序列，其与SEQ ID NO:6或8中所示成熟轻链 可变区序列基本同一。 一些多核苷酸序列编码下述多肽，其包含示例的小 鼠抗-PARl抗体之一的重链和轻链二者的可变区。 一些其他的多核苷酸编 码两条多肽区段，所述区段分别与所述小鼠抗体之一的重链和轻链的可变 区基本同一。
可通过从头固相DNA合成或通过PCR诱变编码抗-hPARl抗体或其 结合片段的现有序列(例如下文实施例中所述的序列)，生产多核苷, 列。核酸的直接化学合成可以通过本领域已知的方法完成，例如Narang 等，Meth. Enzymol. 68:90， 1979的磷酸三酯方法；Brown等，Meth.
36Enzymol. 68:109， 1979的鳞酸二酯方法；Beaucage等，Tetra. Lett" 22:1859， 1981的二乙基亚磷酰胺法；和美国专利No. 4,458,066的固体支持物方法。 可按例如 PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.)， Freeman Press, NY， NY， 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis等(Ed.)， Academic Press, San Diego， CA， 19卯；Mattila等，Nucleic Acids Res. 19:967， 1991 ;和 Eckert等，PCR Methods and Applications 1:17， 1991中所述，通过PCR向 多核苷酸序列引入突变。
本发明中还提供了生产上述抗-hPARl抗体的表达载体和宿主细胞。 可使用多种表达载体表达编码抗-PARl抗体链或结合片段的多核苷酸。基 于病毒的和非病毒的表达载体均可用于在哺乳动物宿主细胞中生产抗体。 非病毒载体和体系包括质粒、附加型载体(通常具有表达蛋白质或RNA 的表达盒)和人工染色体(见例如Harrington等，Nat Genet 15:345， 1997)。例如，适用于在哺乳动物(例如人)细胞中表达抗-hPARl多核 苷酸和多肽的非病毒载体包括pThioHis A、 B & C， pcDNA3.1/His, pEBVHisA、 B&C(Invitrogen，SanDiego，CA)， MPSV栽体和大量本々页 域已知用于表达其他蛋白质的其他载体。有用的病毒载体包括基于逆转录 病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱渗病毒的载体，基于SV40、乳头状瘤病 毒、HBP EB病毒、痘苗病毒载体和Semliki Forest病毒(SFV)的载体。 见Brent等，同上引文；Smith, Anrni. Rev. Microbiol. 49:807， 1995;和 Rosenfeld等，Cell 68:143， 1992。
表达载体的选择取决于预期要在其中表达载体的宿主细胞。通常，表 达载体含有与编码抗-hPARl抗体链或片段的多核苷酸有效连接的启动子 和其他调节序列(例如增强子)。在一些实施方案中，使用诱导型启动子 防止插入的序列在诱导条件以外的其它条件下表达。诱导型启动子包括例 如阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热激启动子。转化的生物的培养 物可在非诱导条件下扩增，不使该群体偏向于表达产物可以被宿主细胞更 好地耐受的编码序列。除了启动子以外，为了抗-hPARl抗体链或片段的有效表达，也可能需要或期望其他调节元件。这些元件通常包括ATG起 始密码子和邻近的核糖体结合位点或其他序列。另外，可通过包含适于所
使用的细胞体系的增强子来增强表达的效率(见例如Scharf等，Results Probl. Cell Differ. 20:125， 1994;和Bittner等，Meth. Enzymol.， 153:516， 1987)。例如，SV40增强子或CMV增强子可用于提高在哺乳动物宿主细 胞中的表达。
表达载体也可以提供分泌信号序列位置，从而与插入的抗-hPARl抗 体序列编码的多肽形成融合蛋白。插入的抗-hPARl抗体序列更通常在包 含在栽体中之前与信号序列连接。要用于接受编码抗-hPARl抗体轻链和 重链可变结构域的序列的载体有时也编码恒定区或其部分。这类载体允许 将可变区表达为与恒定区的融合蛋白，从而导致完整抗体或其片段的生 产。通常，这类恒定区是人的。
用于包含并表达抗-hPARl抗体链的宿主细胞可以是原核的或真核 的。大肠杆菌(E. coli)是适用于克隆和表达本发明的多核苷酸的一种原核宿 主。其他适合使用的微生物宿主包括芽孢杆菌(bacilli)如枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)和其他肠杆菌(enterobacteriaceae)如沙门氏菌 (Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)和多种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。 在这些原核宿主中也可以制造表达载体，其通常含有与宿主细胞兼容的表 达控制序列(例如复制起点)。另外，可存在任何数量的公知启动子，例 如乳糖启动子体系、色氨酸(trp)启动子体系、p-内酰胺酶启动子体系或来 自于噬菌体X的启动子体系。启动子通常控制表达(任选地与操纵基因序 列一起)，并具有核糖体结合位点序列等等，用于起始和完成转录和翻译。 其他微生物如酵母也可用于表达本发明的抗-hPARl多肽。也可以与杆状 病毒载体组合使用昆虫细胞。
在一些优选的实施方案中，使用哺乳动物宿主细胞表达和生产本发明 的抗-hPARl多肽。例如，它们可以是表达内源免疫球蛋白基因的杂交瘤 细胞系(例如实施例中所述的骨髓瘤杂交瘤克隆)或载有外源表达载体的 哺乳动物细胞系(例如下文示例的SP2/0骨髓瘤细胞)。这些包括任何正常的非永生化的动物或人细胞，或正常或异常的永生化的动物或人细胞。 例如，已开发了能够分泌完整免疫球蛋白的大量合适的宿主细胞系，包括
CHO细胞系、多种Cos细胞系、Hela细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B-细 胞和杂交瘤。哺乳动物组织细胞培养物表达多肽的用途一般在例如 Winnacker， From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y.， N.Y.， 1987中讨 论。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可包含表达控制序列，例如复制起 点、启动子和增强子(见例如Queen等，Immunol. Rev. 89:49-68， 1986 )， 和必需的加工信号位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷 酸化位点和转录终止序列。这些表达载体通常含有来自哺乳动物基因或来 自哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞种类特异 的、阶段特异的，和/或可调控或可调节的。有用的启动子包括，但不限于 金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型 MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、组成型MPSV启动 子、四环素诱导型CMV启动子(例如人立即早期CMV启动子)、组成 型CMV启动子，和本领域已知的启动子-增强子组合。
引入含有目的多核苷酸序列的表达载体的方法因细胞宿主的类型而 异。例如，原核细胞通常使用氯化钙转染，而其他细胞宿主可以使用磷酸 4丐处理或电穿孔(一般见Sambrook等上引文)。其他方法包括例如电穿 孔、磷酸钓处理、脂质体介导的转化、注射和显微注射、生物轰击方法、 病毒体、免疫脂质体、多聚阳离子:核酸缀合物、棵DNA、人工病毒体、 与疱渗病毒结构蛋白VP22融合(Elliot and O'Hare， Cell 88:223， 1997)、试 剂增强的DNA摄取，和离体转导。为了重组蛋白质的长期、高产量生产， 通常期望稳定的表达。例如，可使用如下本发明的表达载体制备稳定表达 抗-hPARl抗体链或结合片段的细胞系，所述本发明的表达载体含有病毒 复制起点或内源表达元件和可选择标记基因。引入载体后，可允许细胞在 富集培养基中生长1-2天，之后将其移至选择培养基。可选择标记的目的 是赋予对选择的抗性，其存在使得成功表达引入序列的细胞能够在选择培 养基中生长。可使用适合该细胞类型的组织培养技术增殖有抗性的、稳定转染的细胞。
4. 抗-hPARl抗体或抗原结合分子的特性
一旦上述抗-hPARl抗体或抗原结合分子被合成，或在宿主细胞中从 表达载体表达，或在杂交瘤中内源表达后，它们可以被容易地纯化，例如 从培养基和宿主细胞中纯化。通常，抗体链被表达为带有信号序列，并因 此被释放至培养基。然而，如果抗体链不能由宿主细胞天然分泌，则可通 过用温和去污剂处理来释放抗体链。然后可通过常规方法纯化抗体链，所 述常规方法包括硫酸铵沉淀、利用固定化的靼标的亲和层析、柱层析、凝 胶电泳等等。这些方法是公知的，并在本领域中常规使用，例如Scopes, Protein Purification, Springer画Verlag， NY， 1982;和Harlow & Lane上引 文。
例如，可在转瓶中培养选择的表达本发明抗-hPARl抗体的杂交瘤， 用于单克隆抗体纯化。可过滤上清液并通过4吏用蛋白A- sepharose或蛋白 G- sepharose柱进行亲和层析而浓缩。可通过凝胶电泳和高效液相色镨检 查从柱中洗脱的IgG进行分析，以确保纯度。可将该緩冲溶液更换为PBS， 并通过OD280读数测定浓度。可将单克隆抗体等分并储存于-8(TC 。
无论其制备方法如何，本发明的抗-hPARl抗体或抗原结合分子都特 异结合hPARl或其抗原性片段。当抗体结合hPARl或其抗原性片段的解 离常数为^HM，优选^100nM，最优选SlnM时，存在特异结合。可如下 检测抗体结合hPARl的能力直接标记目的抗体，或可不标记抗体而使 用多种夹心分析测定方式间接检测结合。见例如上引文Harlow & Lane。 具有这类结合特异性的抗体更可能具有下文实施例中讨论的小鼠或嵌合 抗-hPARl抗体显示的有利特性。通常，本发明的抗-PARl抗体或抗原结 合分子以至少1 x 107 M"、 108 M-1、 109 M"或10ie M"的平衡結合常数(Ka) 结合PAR1多肽或抗原片段。另外，它们也具有约lxlO-3 s"、 lxl(TV1、 1 x 10-5 s"或更低的动态解离常数(kd),并以下述亲和力结合人PAR1，与 结合非特异性抗原(例如BSA)的亲和力相比所述亲和力至少大两倍。
在一些实施方案中，本发明的抗-hPARl抗体或抗原结合分子阻断或竟争参照抗-hPARl抗体对hPARl多肽的结合。参照抗-hPARl抗体可具 有SEQ ID NOS:5和6或SEQ ID NOS:7和8中所示的重链和轻链可变区 序列，例如下文实施例中所述的小鼠抗-PARl抗体或其嵌合抗体。这些可 以是上文所述的完全人抗-hPARl抗体。它们也可以是与参照抗体结合相 同表位的其他小鼠、嵌合或人源化抗-hPARl抗体。能够阻断或竟争参照 抗体与hPARl的结合的能力表明，所测试的抗-hPARl抗体或抗原结合分 子结合参照抗体所定义的相同或相似表位，或结合与参照抗-hPARl抗体 所结合的表位足够接近的表位。这类抗体特别可能具有针对参照抗体所确 定的有利特性。可通过例如竟争结合测定法测定阻断或竟争参照抗体的能 力。通过竟争结合测定法，检查所测试的抗体抑制参照抗体对共同抗原(例 如PAR1多肽)或该抗原上表位的特异结合的能力。如果过量的受试抗体 实质性地抑制参照抗体的结合，则该受试抗体与参照抗体竟争对抗原或表 位的特异结合。实质性抑制表示受试抗体通常使参照抗体的特异结合减少 至少10%、 25%、 50%、 75%或90%。
存在大量已知的竟争结合测定法，可用于评价受试抗-hPARl抗体或 抗原结合分子与参照抗-hPARl抗体对人PAR1结合的竟争。这些方法包 括例如固相直接或间接放射免疫测定法(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定 法(EIA)、夹心竟争测定法(见Stahli等，Methods in Enzymology 9:242-253， 1983 );固相直接生物素-亲和素EIA (见Kirkland等，J. Immunol. 137:3614-3619， 1986);固相直接标记测定法、固相直接标记夹心测定法 (见上引文Harlow & Lane);使用1-125标记的固相直接标记RIA (见 Morel等，Molec. Immunol, 25:7-15， 1988 );固相直接生物素-亲和素 EIA(Cheung等，Virology 176:546-552， 1990); 和直接标记的 RIA(Moldenhauer等，Scand. J. Immunol. 32:77-82， 19卯)。通常，这样的 测定法涉及使用与固体表面结合的纯化的抗原或带有该抗原的细胞、未标 记的受试抗-hPARl抗体和标记的参照抗体。通过测定存在受试抗体时与 固体表面或细胞结合的标记的量，测量竟争抑制。通常，受试抗体过量存 在。通过竟争测定法鉴定的抗体(竟争抗体)包括与参照抗体结合相同表位的抗体，和结合下述邻#位的抗体，所述邻a位与参照抗体结合的 表位足够接近，从而发生空间位阻。
为了确定受试抗-PARl抗体或抗原结合分子和参照抗-PARl抗体是 否结合独特的表位，则可使用可商业获得的试剂(例如来自Pierce, Rockford， IL的试剂)将各抗体生物素化。可使用PARI多肽包被的ELISA 平板以及使用未标记的单克隆抗体和生物素化的单克隆抗体进行竟争研 究。可使用链霉亲和素-碱性磷酸酶探针检测生物素化的MAb结合。为了 测定纯化的抗-PARl抗体的同种型，可进行同种型ELISA。例如，可在4°C 用1照/ml抗人IgG将微量滴定板的孔包被过夜。在用1% BSA封闭后， 将平板与1照/ml或更少的单克隆抗-hPARl抗体或纯化的同种型对照在 室温下反应1到2个小时。然后将孔与人IgGl或人IgM-特异的碱性磷酸 酶缀合的探针反应。然后将平板显色并分析，从而可以确定纯化的抗体的 同种型。
为了证明单克隆抗-hPARl抗体或抗原结合分子对表达hPARl多肽的 肝细胞的结合，可使用流式细胞术。简言之，可将表达hPARl的细胞系 (在标准生长条件下生长)与多种浓度的抗-hPARl抗体在含0.1% BSA 和10%胎牛血清的PBS中混合，并在37。C孵育1小时。洗涤后，在与初 级抗体染色相同的条件下，将细胞与荧光素标记的抗人IgG抗体反应。可 通过FACScan设备分析样品，所述设备使用光散射和侧向散射特性对单 个细胞进行门控(gate)。(除了或代替)流式细胞计量术，(还)可使用基于 荧光显微术的备选测定法。可如上所述对细胞染色并通过荧光显微镜检 查。
可通过免疫印迹进一步测试本发明的抗-hPARl抗体与hPARl多肽或 抗原性片段的反应性。简言之，可以制备纯化的hPARl多肽或融合蛋白， 或来自表达PARI的细胞的细胞提取物，并对其进行十二烷基》危酸钠聚丙 烯酰胺凝胶电泳。电泳后将分离的抗原转移至硝酸纤维素膜，用10%胎牛 血清封闭，并用要测试的单克隆抗体探测。可使用抗人IgG碱性磷酸酶检 测人IgG结合，并用BCIP/NBT底物片(Sigma Chem. Co" St. Louis， MO)显色。
5. 治疗性应用和药物组合物
本文所述的抗-hPARl抗体或抗原结合分子可通过抑制PARI信号转 导活性用于许多治疗性或预防性应用中。在治疗性应用中，对已经受到疾 病或状况影响的受试者施用包含抗-hPARl拮抗剂抗体或抗原结合分子 (例如人源化的抗-hPARl抗体)的组合物，所述疾病或状况由PARI信 号转导介导、引起或与^目关。该组合物以足够抑制、部分停止、或可检 测地减緩状况*及其并发症的量含有抗体或抗原结合分子。
在预防性应用中，对尚未患有PARl-信号转导相关病症的患者施用含 有抗-hPARl抗体或抗原结合分子的组合物。更确切地说，它们被施用给 下述患者，所述患者有患这类病症的风险，或具有发生这类病症的素质。 这些应用允许增强患者的抗性，或延緩由PAR1信号转导介导的病症的发 展。
大量疾病状况是由反常的或异常高的PARl-介导的细胞内信号转导 所介导的。异常高的PARl-介导的细胞内信号转导可由例如以下引起受 体暴露于异常高浓度的活化蛋白酶(例如凝血酶)或异常高的PARI细胞 表面表达水平。PARI的抑制有助于治疗血栓形成和血管增生病症，以及 抑制癌症的i^A。见例如Darmoul，等，Mol Cancer Res (2004) 2(9):514-22 和Salah， et al， Mol Cancer Res (2007) 5(3):229-40。还发现抑制PARI在预 防或抑制慢性肠道炎性病症(包括炎性肠病(IBD)、肠易激综合征(IBS)和 溃疡性结肠炎)和纤维变性病症(包括肝纤维化和肺纤维化)中的用途。 见例如Vergnolle，等，J Clin Invest (2004) 114(10):1444; Yoshida， et al， Aliment Pharmacol Ther (2006) 24(Suppl 4):249; Mercer，等，Ann NY Acad Sci (2007) 1096:86-88; Sokolova and Reiser, Pharmacol Ther (2007) PMID:17532472。
可以被本发明的抗-PARl抗体或抗原结合分子抑制或预防的癌症包 括但不仅限于上皮癌，包括癌(carcinomas);胶质瘤、间皮瘤、黑色素 瘤、淋巴瘤、白血病、腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、成胶质细胞瘤、白血病、'淋巴瘤、前列腺癌和伯基特淋巴瘤(Burkitt，slymphoma)、头颈癌、 结肠癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、食管癌、胃癌、胰腺 癌、肝胆管癌、胆嚢癌、小肠癌、直肠癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、阴 茎癌、尿道癌、睾丸癌、子宫颈癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌、甲状腺癌、 甲状旁腺癌、肾上腺癌、胰腺内分泌癌、类癌、骨癌、皮肤癌、成视网膜 细胞瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(另外的癌症见 CANCER:PRINCIPLES AND PRACTICE (DeVita， V.T.等eds 1997))。还发现抑制PARI在预防或抑制下述疾病状况中的用途，所述疾病状 况可由反常的或异常高的PARI表达或细胞内信号转导介导或不由其介 导。例如，抑制PARl可以用于预防或抑制缺血-再灌注损伤，包括心肌、 肾、脑和肠的缺血-再灌注损伤。见例如Strande，等，Basic Res, Cardiol (2007) 102(4):350-8; Sevastos，等，Blood (2007) 109(2):577陽583; Junge，等， Proc Natl Acad Sci USA. (2003) 100(22): 13019-24和Tsuboi，等，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol (2007) 292(2):G678-83。抑制PARI细胞 内信号转导也可以用于抑制细胞的单纯疱疹病毒(HSV1和HSV2)感染。见Sutherland，等，J Thromb Haemost (2007) 5(5): 1055-61。本发明提供了包含抗-hPARl抗体或抗原结合分子的药物组合物，所 述抗体或抗原结合分子与可药用载体配制在一起。该组合物可额外含有适 用于治疗或预防给定病症的其他治疗剂。药物载体可以增强或稳定所述组 合物，或利于组合物的制备。可药用载体包括生理学相容的溶剂、分敉介 质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。本发明的药物组合物可通过本领域已知的各种方法施用。施用途径和 /或模式根据期望的结果变化。优选施用是静脉内、肌内、皿内或皮下， 或施用至靼位点附近。可药用载体应当适用于静脉内、肌内、皮下、肠胃 外、脊推或表皮施用(例如通过注射或输注)。根据施用的途径，可将活 性化合物(即抗体、双特异性和多特异性分子)包在下述材料中，所述材 料保护化合物免受酸和可能使化合物失活的其他天然条件的作用。在一些实施方案中，组合物是无菌的并且是流体。可例如通过使用包衣料如卵磷脂、在*体的情况下通过维持所需的颗粒大小和通过使用表 面活性剂，维持适当的流动性。在许多情况下，优选组合物中包含等渗剂， 例如糖、多元醇如甘露醇或山梨糖醇，和氯化钠。可通过在组合物中包含 延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝或明胶)导致可注射组合物的长期吸收。 可根据本领域公知和常规使用的方法制备本发明的药物组合物。见例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed.， 2000;和Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed.， Marcel Dekker, Inc., New York, 1978。优选在 GMP条件下制造药物组合物。通常，在本发明的药物组合物中使用治疗 有效剂量或生效剂量的抗-hPARl抗体。可以通过本领域"t支术人员已知的 常规方法将抗-hPARl抗体配制成可药用的剂型。调整给药方案，以提供 最佳期望应答(例如治疗性应答)。例如，可施用单个大丸剂(bolus)，可 在一段时间施用几个分剂量，或可根据治疗情势的紧迫性所示，成比例地 降低或提高剂量。为了施用的便利和剂量的一致性，将肠胃外组合物配制 为单位剂型是特别有利的。本文使用的单位剂型是指适于作为单个剂量给 予待治疗的受试者的、物理分离的单位；每个单位含有与所需药物载体组 合的预定量的活性化合物，所述预定量经计算可以产生期望的疗效。可改变本发明药物组合物中活性成分的实际给药水平，从而获得如下 活性成分量，针对具体患者、組合物和施用模式而言所述量能有效地达到 所期望的治疗反应，但是对患者没有毒性。所选择的给药水平取决于多种 药物代谢动力学因素，包括使用的本发明具体组合物或其酯、盐或酰胺的 活性，施用的途径，施用时间，使用的具体组合物的排泄率，治疗的持续 时间，与使用的该具体组合物組合使用的其他药物、化合物和/或材料，治 疗的患者的年龄、性别、体重、状况、 一般健康和先前药物史，和类似的 因素。医生或兽医可以将药物组合物中使用的本发明抗体的起始剂量定在 ^f氐于达到期望疗效所需的水平，然后逐渐提高剂量，直到达到期望的疗效。 本发明组合物的有效剂量一般因许多不同的因素而异，包括有待治疗的特定疾病或状况、施用手段、耙位点、患者的生理学状态(无论患者是人或 是动物)、施用的其他药物，和治疗是预防性的或是治疗性的。需要滴定
治疗剂量，以最优化安全性和功效。对抗体施用而言，剂量范围在约0.0001 到100mg/kg宿主体重，更通常在0.01到5 mg/kg宿主体重。例如，剂量 可以是1 mg/kg体重或10 mg/kg体重或在1-10 mg/kg的范围内。示例性 治疗方案需要每两周施用一次，或每个月一次，或每3到6个月一次。
抗体通常多次施用。单次给药之间的间隔可以是每周、每月或每年。 间隔也可以是不规则的，如由测量患者中抗-hPARl抗体的血液水平来指 示。在一些方法中，调整剂量以达到1-1000 jag/m，的血浆抗体浓度，在一 些方法中达到25-300照/ml的血浆抗体浓度。或者，可以以持续释放制剂 形式施用抗体，在该情况下需要频度较低的施用。剂量和频率根据抗体在 患者中的半衰期而变化。人源化抗体一般显示比嵌合抗体和非人抗体更长 的半衰期。施用的剂量和频率可根据治疗是预防性的或是治疗性的而变 化。在预防性应用中，在一个长时间段中以相对不频繁的间隔施用相对低 的剂量。 一些患者可以在其剩余生命中持续接受治疗。在治疗性应用中， 有时需要以相对短的间隔施用相对高的剂量，直到疾病的发展减速或终 止，优选直到患者显示部分或完全的疾病症状改善。此后，可对该患者施 用预防性方案。
实施例
提供以下的实施例进一步阐述本发明，但不限制其范围。本发明的其 他变体方案对本领域普通技术人员而言是显而易见的，并包括在后附权利 要求书中。
实施例1:开发小鼠抗-hPARl拮抗剂抗体
该实施例描述了小鼠抗-hPARl拮抗剂抗体的开发。用人PAR1 (AA #27-102) /硫氧还蛋白融合蛋白免疫Bc12 Wehi22小鼠。免疫在18天中进 行8次。从外周淋巴结中分离B-细胞并与FO骨髓瘤细胞(ATCC， Manassas，VA)融合。通过ELISA针对hPARl/硫氧还蛋白融合蛋白篩选抗体生产。 总计获得了 IO个克隆，其生产特异识别hPARl的抗体。使用细胞ELISA 在HT29细胞(PARI阳性)和colo50细胞(PARI阴性)上分析hPARl 抗体与细胞表面PAR1的结合。简言之，细胞与杂交瘤培养物上清液一起
孵育，然后与HRP-缀合的抗小鼠IgG孵育。添加TMB底物(KPL， Gaithersburg，MD)， 20分钟后用硫酸(2N)酸化孔，并在450 nm处测量颜 色。结果显示10个克隆中的5个杂交瘤克隆能够结合该细胞表面受体。
自每个细胞结合阳性克隆纯化单克隆抗体(mAb)。简言之，在G蛋白 树月旨(Amersham Biosciences, Piscataway， NJ)上纯4匕无血清的^^t培养基。 另外，通过有限稀释对10个产抗体的克隆进行亚克隆，并通过ELISA和 细胞ELISA针对PARI结合评价得到的克隆。还如下所述针对功能性评 价功能性亚克隆。
使用hPARl-依赖性钙流测定法筛选功能性hPARl拮抗剂抗体。已知 凝血酶切割PARI的N-端结构域，去除约15个氨基酸。剩余的N-端结构 域(称作束缚配体)负责起始PARI介导的信号转导。凝血酶对PAR-1 的该切割导致细胞中快速和瞬时的钙流，其能够使用可商业获得的试剂 (Molecular Devices)测量。具体地，在HT-29、 HCT-116和DU145细胞上 评价纯化的抗体抑制凝血酶处理后的钙流的能力。将FlipR染料(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)中的细胞用G蛋白纯化的抗体预孵育1小时，并 用多种浓度的凝血酶诱导Ca"+流。该结果表明，来自两个克隆(4￡7.114& 6E11.H6)之每个的亚克隆显示强拮抗剂活性。还使用DU145和HCT116 细胞二者对功能性克隆进行FlipR测定。两种细胞系均证实了功能性抗体 拮抗剂的活性。
为了评价拮抗剂的机制，还检查了凝血酶切割后抗体结合PARI受体 的能力。用凝血酶完全切割PARl/硫氧还蛋白。中和凝血酶后，添加等份 的全长PARl/硫氧还蛋白。将抗体与G蛋白结合，并使用固定化的抗体免 疫沉淀经切割的/全长的PARI融合蛋白混合物。分离树脂、洗涤并通过 SDS-PAGE鉴定捕获的蛋白质。评价的克隆中三个能够结合与硫氧还蛋白融合蛋白邻近的PARI部分，包括两个功能性克隆4E7和6E11。 PARI 的该结构域代表了凝血酶切割后留在细胞表面上的束缚配体。该结果还表 明下述抗体在FlipR测定法中效力差得多，所述抗体封闭PARI的凝血酶 切割，但是不能结合束縳配体。因此，似乎结合束繂配体对功能活性而言 是必需的但不是充分的。
通过RT-PCR克隆了两条功能性重链(VH)和轻链(VL)的区域。用于鉴 定两个克隆(4E7,J14丄16 & 6E11.H6,A9)的重链和轻链可变区的引物序列 相同并且见如下。用于VH的引物为(1)
HV1:GGGTCTAGACACCATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT (SEQ ID NO:33) 和 (2) H- 恒 定 区
GCGTCTAGAAYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC (SEQ ID NO:34)。 用 于 VL 的引物为 (1) LV5: GGGTCTAGACACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGDNA (SEQ ID NO:35) 和 (2)L- 恒 定 区
GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG (SEQ ID隐36)。
简言之，分离总RNA。用针对任一重链或轻链可变区的信号序列的正 向引物，和针对重链CH1区或轻链K恒定区的反向引物进行RT-PCR。 将PCR产物克隆进pCR II或pcDNA3.1/V5-His-TPOP-TA载体中用于测 序。然后测定这些抗体克隆的重链和轻链可变区序列的多核苷^f列(图 1)。图2显示这些可变区的相应M酸序列。图2中还指出根据Kabat 等上引文的编号系统推出的CDR区和构架区。
实施例2:产生嵌合的抗-hPARl抗体
该实施例描述了嵌合的抗-hPARl抗体的产生和表征。该嵌合抗体含 有来自上述小鼠抗-hPARl抗体的可变区和来自人免疫球蛋白的恒定区。
为了产生嵌合抗体，用下述引物对针对人PARI克隆的小鼠抗体的可 变区进行再次PCR，所述引物被设计用于克隆进盒载体。然后将所述可变 区分别克隆进盒载体，所述盒载体含有与人免疫球蛋白前导序列、J-区段和剪接-供体信号的读框内融合。然后将该序列转移进含有人免疫球蛋白恒定区的哺乳动物表达载体中，在重链上进行新霉素选择、在轻链上进行
dhfr选择、并使用甲氨喋呤进行基因扩增。
将嵌合IgGl重链和k轻链的DNA质粒共同电穿孔进SP2/0骨髓瘤细
胞中。用遗传霉素选择细胞，然后在含有遗传霉素和甲氨喋呤的生长培养基中培养和扩增。使细胞适应用于抗体纯化的无血清培养基。纯化从转染
的SP2/0细胞分泌的嵌合IgGl抗体。可与小鼠抗-hPARl抗体类似地在FlipR测定法中检查纯化的嵌合IgGl抗体的拮抗剂活性。该测试可揭示嵌合抗-hPARl抗体显示与小鼠IgGl抗体类似的拮抗剂活性。
实施例3:抗-hPARl抗体抑制凝血酶介导的IL-8分泌该实施例描述了抗-hPARl拮抗剂抗体对凝血酶介导的自HUVEC的IL-8分泌的抑制。将细胞与凝血酶接触过夜，这导致分泌进入培养基的IL-8提高。在凝血酶处理前1小时添加抗体。通过ELISA测量的结果显示于图3中。如图中所示，两种小鼠抗-hPARl抗体均能够抑制自凝血酶处理的HUVEC的IL-8分泌的提高。
应当理解本文所述的实施例和实施方案仅用于举例说明的目的，鉴于其，本领域技术人员可以被提示多种修饰或改变，且所述修饰或改变包括在本申请的精神和范围和后附的权利要求的范围内。本文中引用的所有出版物、专利和专利申请特此为所有的目的而完整地并入作为参考。
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权利要求
1.与人PAR1的表位特异结合的抗体或抗原结合分子，其中该表位包含氨基酸序列SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTE(SEQ IDNO38)，且其中该抗体或抗原结合分子是PAR1拮抗剂。
2. 4又利要求1的抗体或抗原结合分子，其包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23的重链互补性决定区(CDR)序列；或SEQ ID NO:24、 SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的轻链CDR序列。
3. 权利要求1的抗体或抗原结合分子，其包含分别为SEQ ID NO:21、 SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23的重链CDR1、 CDR2和CDR3序列； 和分别为SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的轻链CDRl、 CDR2和CDR3序列。
4，权利要求l的抗体或抗原结合分子，其包含SEQIDNO:27、SEQID NO:28或SEQ ID NO:29的重链互补性决定区(CDR)序列；或SEQ ID NO:30、 SEQ ID NO:31,或SEQ ID NO:32的轻链CDR序列。
5. 权利要求1的抗体或抗原结合分子，其包含分别为SEQ ID NO:27、 SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29的重链CDR1、 CDR2和CDR3序列； 和分别为SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的轻链CDRl、 CDR2和CDR3序列。
6. 权利要求1的抗体或抗原结合分子，其包含(i)与SEQ ID NO:5具 有至少85%同一性的重链可变区^酸序列和与SEQ ID NOA具有至少 85%同一性的轻链可变区氨基酸序列，或(ii)与SEQ ID NO:7具有至少 85。/。同一性的重链可变区M酸序列和与SEQ ID NO:8具有至少85%同 一性的轻链可变区JlJ^酸序列。
7. 权利要求1的抗体或抗原结合分子，其包含(i) SEQ ID NO:5的重 链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:6的轻链可变区氨基酸序列，或(ii) SEQ ID NO:7的重链可变区^J^酸序列和SEQ ID NO:8的轻链可变区氨 基酸序列。
8. 权利要求l的抗体或抗原结合分子，其为小鼠抗体。
9. 权利要求l的抗体或抗原结合分子，其为单克隆抗体。
10. 权利要求1的抗体或抗原结合分子，其为嵌合抗体。
11. 权利要求10的抗体或抗原结合分子，其包含人重链恒定区和人轻 链恒定区。
12. 权利要求1的抗体或抗原结合分子，其为人源化的抗体。
13. 权利要求l的抗体或抗原结合分子，其为人抗体。
14. 权利要求1的抗体或抗原结合分子，其为单链抗体。
15. 权利要求1的抗体或抗原结合分子，其为Fab片段。
16. 权利要求l的抗体或抗原结合分子，其为具有来自人纤连蛋白III 型结构域的支架的单抗体。
17. 分离的或重组的多核苷酸，其编码与人PAR1的表位特异结合的 抗体或抗原结合分子，其中该表位包含氨基酸序列 SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTE (SEQ ID NO:38)，且其中该抗 体或抗原结合分子为PARI拮抗剂。
18. 权利要求17的多核苷酸，其中该抗体或抗原结合分子是人抗体。
19. 权利要求17的多核苷酸，其中该抗体或抗原结合分子包含(i)分别 为SEQ ID NO:21、 SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23的重链CDR1、 CDR2 和CDR3序歹'h和分别为SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26 的轻链CDR1 、 CDR2和CDR3序列；或(ii)分别为SEQ ID NO:27、 SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29的重链CDR1 、 CDR2和CDR3序列；和分别为 SEQ ID NO:30、 SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的轻链CDR1、 CDR2 和CDR3序列。
20. 权利要求17的多核苷酸，其中该抗体或抗原结合分子包含(i)与 SEQ ID NO:5的成熟区具有至少90%同一性的成熟重链可变区序列，和与 SEQ ID NO:6的成熟区具有至少90%同一性的成熟轻链可变区序列；或(ii) 与SEQ ID NO:7具有至少90%同一性的成熟重链可变区氨基酸序列，和 与SEQ ID NO:8具有至少卯％同一性的成熟轻链可变区#^酸序列。
21. 权利要求17的多核苷酸，其中该抗体或抗原结合分子包含(i)与 SEQ ID NO:5的成熟区相同的成熟重链可变区序列，和与SEQ ID NO:6 的成熟区相同的成熟轻链可变区序列；或(ii)与SEQ ID NO:7的成熟区相 同的成熟重链可变区序列，和与SEQ IDNO:8的成熟区相同的成熟轻链可 变区序列。
22. 权利要求17的多核苷酸，其为DNA。
23. 分离的宿主细胞，其包含(l)编码权利要求1的抗体或抗原结合分 子的重链的重组DNA区段，和(2)编码该抗体或抗原结合分子的轻链的第 二重组DNA区段;其中所述DNA区段分别与第一和第二启动子有效连接， 并能够在所述宿主细胞中表达。
24. 权利要求23的宿主细胞，其中该抗体或抗原结合分子是人单克隆 抗体。
25. 权利要求23的宿主细胞，其中该抗体或抗原结合分子包含(i)分别 为SEQ ID NO:21、 SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23的重链CDR1、 CDR2 和CDR3序列；和分别为SEQ ID NO:24、 SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26 的轻链CDR1、 CDR2和CDR3序列；或(ii)分别为SEQ ID NO:27、 SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29的重链CDR1 、 CDR2和CDR3序列；和分别为 SEQ ID NO:30、 SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的轻链CDR1、 CDR2 和CDR3序列.
26. 权利要求23的宿主细胞，其中该抗体或抗原结合分子包含(i)与 SEQ ID NO:5的成熟区具有至少卯％同一性的成熟重链可变区序列，和与 SEQ ID NO:6的成熟区具有至少90%同一性的成熟轻链可变区序列；或(ii) 与SEQ ID NO:7具有至少90%同一性的成熟重链可变区#^酸序列，和 与SEQ ID NO:8具有至少90%同一性的成熟轻链可变区氨基酸序列。
27. 权利要求23的宿主细胞，其中该抗体或抗原结合分子包含(i)与 SEQ ID NO:5的成熟区相同的成熟重链可变区序列，和与SEQ ID NO:6 的成熟区相同的成熟轻链可变区序列；或(ii)与SEQ ID NO:7的成熟区相 同的成熟重链可变区序列，和与SEQ ID NO:8的成熟区相同的成熟轻链可变区序列。
28. 权利要求23的宿主细胞，其为非人哺乳动物细胞系。
29. 药物组合物，其包含与人PAR1的表位特异结合的抗体或抗原结合分子，其中该表位包含氨基酸序列SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTE (SEQ ID NO:38)，且其中该抗体或抗原结合分子为PARI拮抗剂。
30. 权利要求30的药物组合物，包含下述抗体，所述抗体包含分别为SEQ ID NO:21、 SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23的重链CDR1、 CDR2和CDR3序列；和分别为SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的轻链CDR1、 CDR2和CDR3序列。
31. 权利要求30的药物组合物，包含下述抗体，所述抗体包含分别为SEQIDNO:27、 SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29的重链CDR1、 CDR2和CDR3序列；和分别为SEQ ID NO:30、 SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的轻链CDR1、 CDR2和CDR3序列。
32. 改善疾病状况的症状的方法，所述疾病状况由通过PARI的异常细胞内信号转导所介导，所述方法包括对有需要的受试者施用与人PARI表位特异结合的抗体或抗原结合分子，其中所述表位包含氨基酸序列SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTE (SEQ ID NO:38)，且其中所述抗体或抗原结合分子是PARI拮抗剂。
33. 权利要求32的方法，包括施用抗体，所述抗体包含分别为SEQ IDNO:21、 SEQIDNO:22和SEQIDNO:23的重链CDRl、 CDR2和CDR3序列；和分别为SEQ ID NO:24、 SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的轻链CDR1、 CDR2和CDR3序列。
34. 权利要求32的方法，包括施用抗体，所述抗体包含分别为SEQ IDNO:27、 SEQIDNO:28和SEQIDNO:29的重链CDRl、 CDR2和CDR3序列；和分别为SEQ ID NO:30、 SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的轻链CDR1、 CDR2和CDR3序列。
35. 权利要求32的方法，其中由通过PAR1的异常细胞内信号转导所介导的疾病状况是慢性肠道炎性病症。
36. 权利要求32的方法，其中由通过PAR1的异常细胞内信号转导所 介导的疾病状况是纤维变性病症。
37. 权利要求32的方法，其中由通过PAR1的异常细胞内信号转导所 介导的疾病状况是过表达PAR1的癌症。
38. 权利要求32的方法，其中由通过PAR1的异常细胞内信号转导所 介导的疾病状况是缺血-再灌注损伤。
全文摘要
本发明提供特异识别并拮抗人PAR1受体的抗体或抗原结合分子。本发明还提供编码这些分子的多核苷酸和载体，和含有所述多核苷酸或载体的宿主细胞。
文档编号C07K16/28GK101516398SQ200780034441
公开日2009年8月26日 申请日期2007年7月18日 优先权日2006年7月18日
发明者M·纳索弗, S·B·科恩 申请人:Irm责任有限公司