一种CDK4/6抑制剂与雌激素受体拮抗剂联合在制备治疗乳腺癌的药物中的用途的制作方法

本发明涉及一种cdk4/6抑制剂与雌激素受体拮抗剂联合在制备治疗乳腺癌的药物中的用途。

背景技术：

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，具有发病率高，颇具侵袭性，但病程进展缓慢，中国人口协会2010年2月1日在北京发布了《中国乳腺疾病调查报告》，报告显示，我国城市地区乳腺癌的死亡率增长了38.91％，乳腺癌已经成为对妇女健康威胁最大的疾病，目前在研和上市的乳腺癌药物至少有156种，其中68％为靶向治疗药物。大量研究发现肿瘤与细胞周期异常相关，肿瘤细胞中有丝分裂信号蛋白的大量突变和抗有丝分裂信号蛋白缺陷导致增殖紊乱；同时大部分肿瘤都存在基因组不稳定性(gin)和染色体组不稳定性(cin)，这三种基本的细胞周期缺陷都直接或间接由cdks的失控引起。周期素依赖性蛋白激酶(cdk，cyclindependentkinase)抑制剂日益成为热门靶标。

目前开发的一代二代cdk抑制剂很多，最受关注的二代药物包括pfizer公司和onyx公司共同开发的cdk4/6抑制剂pd-0332991，其通过抑制cdk4/6的活性，抑制rb的磷酸化，使e2f-rb复合物留滞在胞浆中，阻断细胞周期的启动。临床试验结果(nct00721409)显示，来曲唑单药治疗的患者的无进展存活期(progression-freesurvival,pfs)为7.5月，而来曲唑和pd-0332991药物联用治疗的患者其无进展存活期则延长至26.1月，这一显著优势获得了广泛关注。对于在先接受过内分泌疗法后疾病进展的激素受体阳性转移性乳腺癌病人，pd-0332991与氟维司群联用相比于氟维司群单用也延长了其无进展生存期(palbociclibinhormone-receptor–positiveadvancedbreastcancer.thenewenglandjournalofmedicine.july16,2015vol.373no.3.)

wo2014183520公开了与pd-0332991结构相似的一系列满足式(i)通式的cdk4/6抑制剂，具有显著的cdk4/6的抑制活性和高度选择性，并预期这些化合物可能用于一系列肿瘤，并且可以与一系列现有的抗肿瘤剂联合使用，其中包括如下所示的式a化合物，其化学名为6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-((5-(哌啶-4-基)吡啶-2-基)氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8h)-酮：

然而上述文献并没有具体公开哪一个化合物与哪一种抗肿瘤剂联用时可以取得较好的效果，更没有预期一些特定的联用方式可以取得协同作用。

技术实现要素：

本发明惊奇地发现，化合物a或其可药用盐与雌激素受体拮抗剂联合使用时取得了显著的协同作用，从而完成了本发明。

本发明一方面提供了化合物a或其可药用盐与雌激素受体拮抗剂联合在制备治疗乳腺癌的药物中的用途。所述的雌激素受体拮抗剂可以是他莫昔芬、氟维司群，优选氟维司群。

其中所述的乳腺癌优选为雌激素受体阳性(er+)、和/或人表皮生长因子受体2阴性(her2-)的乳腺癌；更优选为上述表型的局部晚期或转移性乳腺癌。

在本发明中，化合物a在实际使用时，优选其可药用盐的形式，可以是各种有机酸或者无机酸的加成盐，其中特别优选羟乙基磺酸盐，其结构如下所示：

更优选地，本发明的化合物a的羟乙基磺酸盐以i型结晶的形式存在，使用cu-ka辐射，得到以2θ角度和晶面间距表示的x-射线粉末衍射图谱，所述i型结晶具有如图1所示的x-射线粉末衍射图谱，其中在约4.17(21.17)，8.26(10.69)，9.04(9.77)，10.78(8.20)，12.38(7.14)，14.01(6.32)，18.50(4.79)，18.89(4.70)，20.69(4.29)，21.58(4.11)，23.87(3.73)和28.15(3.17)有特征峰。

所述的i晶型经光照、高温和高湿条件下测试，稳定性良好，且溶解性、生物利用度优于化合物a本身。

在本发明中，化合物a或其可药用盐的每日用量(以化合物a计)范围可以是0.1mg/kg～1000mg/kg，优选0.5～10mg/kg，更优选0.5～5mg/kg。对于成年人类，优选以化合物a计，每日用量1mg～1000mg，优选10～500mg，最优选30至300mg。

在本发明中，对于成年人类，雌激素受体拮抗剂的每次用量为1～2000mg，优选10～1000mg，更优选100～1000mg。

本发明中所述的联合使用，并不限定化合物a或其可药用盐与雌激素受体拮抗剂同时施用，也可以二者先后施用；另外，为了用药方便，还可将化合物a与雌激素受体拮抗剂制成药物组合物。

附图说明

图1：显示化合物a的羟乙基磺酸盐的i晶型的xrd图谱；

图2：显示化合物a的羟乙基磺酸盐的i晶型的dsc图谱图；

图3：pd-0332991、化合物a单用或与氟维司群合用对人乳腺癌mcf-7裸小鼠皮下移植瘤的疗效；

图4：pd-0332991、化合物a单用或与氟维司群合用对荷瘤裸小鼠体重的影响；

图5：pd-0332991、化合物a单用或与氟维司群合用对人乳腺癌mcf-7裸小鼠皮下移植瘤的疗效(肿瘤照片)。

具体实施方式

以下结合实施例用于进一步描述本发明，但这些实施例并非限制本发明的范围。

实验所用的测试仪器

1、dsc谱

仪器型号：mettlertoledodsc1stareesystem

吹扫气：氮气

升温速率：10.0℃/min

温度范围：40-400℃

2、x-射线衍射谱

仪器型号：brukerd8focusx-射线粉末衍射仪

射线：单色cu-kα射线(λ＝1.5406)

扫描方式：θ/2θ，扫描范围：2-40°

电压：40kv，电流：40ma

实施例1：6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-((5-(哌啶-4-基)吡啶-2-基)氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8h)-酮羟乙基磺酸盐的制备

步骤1：6-((6-(1-丁氧基乙烯基)-8-环戊基-5-甲基-7-羰基-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)-5',6'-二氢-[3,4'-联吡啶]-1'(2'h)-甲酸叔丁酯的制备

氩气保护下，将(10g，29.06mmol)2-氨基-6-(1-丁氧乙烯基)-8-环戊基-5-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8h)-酮(按wo2014183520公开方法制备)、碳酸铯(14.22g，43.75mmol)、pd2(dba)3(2.12g，2.31mmol)、4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽(2.69g，4.69mmol)和125.00g二氧六环投入三口反应瓶中，搅拌均匀后加热至回流，缓慢滴加原料4-(6-氯吡啶-3-基)-5,6-二氢吡啶-1(2h)-羧酸叔丁酯(10.34g，35.00mmol,购自盐城市瑞康医药化工有限公司)和二氧六环(65.62g，0.74mol)的混合液(滴加时间约5h)。滴毕继续回流搅拌反应1～1.5h，tlc监控原料2-氨基-6-(1-丁氧乙烯基)-8-环戊基-5-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8h)-酮反应完全(展开剂：石油醚：乙酸乙酯＝2:1，原料rf＝0.6，产物rf＝0.7)，终止反应。反应液冷却至室温，过滤，滤饼用二氯甲烷17.19g×3洗涤。将滤液于65℃减压浓缩干。残留物加入137.50g二氯甲烷溶解，加入56.25g纯化水，分液，水相再用68.75g二氯甲烷萃取。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤饼用23.44g二氯甲烷洗，滤液于45℃减压浓缩至油状液体。加入150g丙酮溶解，室温搅拌约2h，冰水浴搅拌约3h。过滤，滤饼用冷丙酮25g×4洗涤，室温减压干燥8～10h，得固体约14.84g，收率：80～92％，hplc检测纯度不低于90％。esi/ms:[m+h]＝601.43。

步骤2：4-(6-((6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-7-羰基-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯的制备

将6-((6-(1-丁氧基乙烯基)-8-环戊基-5-甲基-7-羰基-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)-5',6'-二氢-[3,4'-联吡啶]-1'(2'h)-甲酸叔丁酯(14.84g，24.69mmol)和75g乙酸投入三口反应瓶中，通氩气保护。加入10％pd/c(5g)，氢气置换三次，搅拌下于50～60℃常压加氢反应30～32h。hplc法监测中间态剩余量(6-((6-(1-丁氧基乙烯基)-8-环戊基-5-甲基-7-羰基-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)-5',6'-二氢-[3,4'-联吡啶]-1'(2'h)-甲酸叔丁酯脱掉正丁基保护但双键未被还原的中间体)＜0.3％，终止反应。反应液冷却至室温，体系氩气置换后过滤，滤饼用37.50g二氯甲烷洗涤。将滤液于65℃减压浓缩至干。残留物氩气保护用50g无水乙醇回流打浆0.5h，搅拌下自然冷却至室温，冰浴搅拌约4h。过滤，滤饼用冷无水乙醇12.50g×2洗涤。所得湿品加入二氯甲烷31.25g搅拌，过滤不溶物，滤液搅拌下缓慢加入异丙醇118.75g，冰浴搅拌约3h，过滤后减压干燥8～10h得固体约8.75g，产率：60～72％，hplc检测纯度不低于98％。esi/ms:[m+h]＝547.26。

步骤3：6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-((5-(哌啶-4-基)吡啶-2-基)氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8h)-酮羟乙基磺酸盐的制备

将4-(6-((6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-7-羰基-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(8.75g，15.94mmol)和56.25g无水甲醇投入三口反应瓶中，搅拌均匀。将80％羟乙基磺酸(8.81g，55.94mmol)和水0.94g溶于13.75g无水甲醇中，滴加到上述溶液中，溶液变澄清。滴毕加热回流搅拌反应3～3.5h，tlc检测原料反应完全(石油醚：乙酸乙酯＝1:1，原料rf＝0.3，产物rf＝0)，终止反应，趁热过滤。滤液搅拌下滴加三乙胺(4.00g，39.38mmol)，滴毕继续搅拌约1h，冰浴搅拌约3h。过滤，滤饼用冷无水甲醇7.19g×2洗涤，40℃减压干燥6～8h得固体约7.97g，收率：82～93％，hplc检测纯度不低于98％。tof-ms:[m+h]＝447.2503(6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-((5-(哌啶-4-基)吡啶-2-基)氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8h)-酮结合一个氢离子的离子峰)。该结晶样品的x-射线衍射谱图见图1。该结晶在约4.17(21.17)，8.26(10.69)，9.04(9.77)，10.78(8.20)，12.38(7.14)，14.01(6.32)，18.50(4.79)，18.89(4.70)，20.69(4.29)，21.58(4.11)，23.87(3.73)和28.15(3.17)处有特征峰。dsc谱图见图2，在324℃附近有熔融吸热峰，将此晶型定义为i晶型。经光照、高温和高湿条件下测试，该晶型的稳定性良好。

实施例2：化合物a和pd-0332991单用或与氟维司群合用对人乳腺癌mcf-7裸小鼠皮下移植瘤的疗效。

1受试药物

药物名称：pd-0332991的羟乙基磺酸盐为黄色结晶性粉末，根据cn1835951b公开的方法制备；化合物a的羟乙基磺酸盐为白色粉末，由实施例1制备得到；氟维司群为白色粉末，由上海恒瑞医药有限公司提供。

配制方法：化合物a的羟乙基磺酸盐用50mm柠檬酸+0.5％cmc+0.5％tween80配制；pd-0332991的羟乙基磺酸盐用含0.1％tween80的蒸馏水配制并稀释；氟维司群用市售大豆油配制。

2实验动物

balb/ca-nude裸小鼠，6-7周，♀，购自上海灵畅生物科技有限公司。生产许可证号：scxk(沪)2013-0018；动物合格证号2013001812696。饲养环境：spf级。

3实验步骤

裸小鼠皮下埋植雌激素缓释片(0.72mg/片,60天释放，innovativeresearchofamerica)，第二天接种人乳腺癌mcf-7细胞，待肿瘤生长至100-200mm³后，将动物随机分组(d0)。给药剂量和给药方案见表1。每周测2-3次瘤体积，称鼠重，记录数据。肿瘤体积(v)计算公式为：

v＝1/2×a×b²其中a、b分别表示长、宽。

t/c(％)＝(t-t0)/(c-c0)×100其中t、c为实验结束时的肿瘤体积；t0、c0为实验开始时的肿瘤体积。

4试验结果

化合物a(75mg/kg,po,qd16)显著抑制表达雌激素受体人乳腺癌mcf-7裸小鼠皮下移植瘤的生长，抑瘤率为130％，有8/8肿瘤部分消退；参比药物pd-0332991相同剂量和方案对mcf-7的抑瘤率为124％，有7/8肿瘤部分消退；氟维司群(1mg/只，单次皮下注射)对mcf-7的抑瘤率为25％；化合物a、pd-0332991与氟维司群合用抑瘤率均明显提高，分别从单用化合物a、pd-0332991时的130％和124％提高到148％和143％(p<0.05,与单用化合物a或pd-0332991比较)。荷瘤小鼠对以上药物均能很好耐受，没有明显体重减轻等症状发生。相比较，无论是单用还是对氟维司群的增效作用，化合物a和pd-0332991对mcf-7的疗效相当。