专利名称：用于抑制pf4和rantes相互作用的拮抗剂的制作方法
用于抑制PF4和RANTES相互作用的拮抗剂
本发明涉及一种多肽、其药理学上可接受的盐、衍生物和/或偶联物， 其在制备药物中的用途。该多肽可制备用于与单核细胞募集有关的疾病 的药物。
动脉血管的动脉硬化构成了心血管疾病的形态学背景。在这种情况 下原始的单核细胞募集对于动脉硬化早期病变的产生有着决定性的意 义。单核细胞在内皮上的固定，即所谓的单核细胞阻滞，在心血管疾病 病理学的初期表现出如动脉硬化、血管狭窄以及血^r等症状。已知的是，
趋化因子如RANTES(调节激活正常T细胞表达和分泌)作为信号分子与 该过程相关。
在现有技术中已知的一级以及二级预防通过^^用药物如阿司匹林 和氯吡格雷可以首先起到降低血脂以及抑制血小板的聚集和活化的作 用。使用这类药物的治疗方法的缺点是， 一方面只显示出很小的特异性， 另 一方面这类药物有严重的副作用，如M^病和高的出血危险。
此外在现有技术中已知的是将RANTES-多肽用作拮抗剂。例如专利 DE 10014516 Al公开了使用metRANTES作为拮抗剂抑制RANTES受 体CCR1。使用这类拮抗剂的缺点是，趋化因子作为信号分子大量参与
影响以及会表现出大量的副作用和严重后果。
本发明的目的在于提供一种治疗药物，它至少能克服现有技术中众 多缺点中的一种。本发明的目的特别在于提供一种具有较好特异性的治 疗药物。
本发明的目的可通过一种多肽、其药理学上可接受的盐、衍生物和 /或偶联物来实现，其中该多肽具有如下结构式(l)所示的SEQ ID NO: 1 的氨基酸序列<formula>formula see original document page 7</formula>
其中
Xi选自包含赖氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、组氨酸和/或天冬酰胺的
组，或氨基酸缺失；
X2选自包含谷氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酰胺的组，或氨基酸缺失；
X3选自包含甘氨酸、丝氨酸和/或丙氨酸的组；
X4选自包含赖氨酸、亮氨酸和/或精氨酸的组；
X5选自包含丝氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和/或苏氨酸的组；
X6选自包含丝氨酸、甘氨酸和/或苏氨酸的组；
X7选自包含天冬酰胺和/或谷氨酰胺的组；
X8选自包含脯氨酸、酪氨酸和/或甘氨酸的组；
X9选自包含甘氨酸、丙氨酸和/或丝氨酸的组；
Xw选自包含异亮氨酸、缬氨酸和/或天冬酰胺的组；
Xn选自包含缬氨酸、异亮氨酸和/或天冬酰胺的组；
X12选自包含苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸和/
或甲硫氨酸的组；
X13选自包含异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和/或苯丙氨酸 的组；
Xi4选自包含苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和/或酪氨酸的组；
X15选自包含精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和/或天冬酰胺的 组，或氨基酸缺失。
有利的是，本发明多肽作为拮抗剂适合于抑制血小板因子4和 RANTES的相互作用。
"用于抑制血小板因子4和RANTES相互作用的拮抗剂"的扭兑念可 以通过本发明多肽、蛋白质或其他的化合物来理解，其作为拮抗剂可以 对血小板因子4和趋化因子RANTES的相互作用起到抑制作用。
令人惊奇地发现，本发明多肽对与血小板因子4 (PF4)和趋化因子 RANTES的相互作用相关的单核细胞募集有特殊的效果。在这里最特别
的优点是，本发明多肽对趋化因子的众多功能不产生或者只产生很小的 影响。本发明多肽的优点尤其在于，它可以有选择性地阻断单核细胞的 募集，例如在内皮上。
在本发明中"单核细胞募集"的概念的意思是单核细胞在内皮上的 移入和移出、单核细胞的固定以及扩散例如在内皮的分裂。同样，单核 细胞的固定同样以单核细胞的粘附或者以单核细胞阻滞表现出来，在生 理学的情况下单核细胞的固定会造成剪切流动，例如在毛细血管、微血 管或动脉血管中。
本发明多肽很大的优点是，具有高特异性，并且对众多的、与趋化
因子RANTES和PF4相关的新陈代谢过程，例如免疫或凝血系统没有 或者仅仅只有很小的副作用。特别是通过使用本发明多肽的药物疗法可 以避免在常规的心血管疾病的药物治疗中出现的出血危险。
本发明中"C"代表通常使用的半胱氨酸的氨基酸字母代码，相应 的"Y"代表酪氨酸，"F"代表苯丙氨酸，"T"代表苏氨酸，"S"代 表丝氨酸。
本发明多肽在氨基端和羧基端都有一个半胱氨酸残基，其可以形成 多肽的环化。本发明的优点特别在于，环化的多肽具有更好的稳定性。 本发明多肽起效时间较长，因此所使用的量也较少。
本发明中"多肽"的含义是使用合成的或非合成的肽类化合物，如 纯的或修饰的天然蛋白质片段、天然形式的或重组的肽或蛋白质。同时 本发明中"多肽，，的含义包括相应多肽的药理学可接受的盐、药理学可 接受的衍生物和/或偶联物。
优选的药理学可接受的衍生物例如酯类、酰胺、N-酰基-和/或0-酰 基衍生物、羧基化的多肽、乙酰化的多肽、磷酸化的多肽和/或糖基化的 多肽。优选的偶联物例如糖-或聚乙二醇-偶联物、生物素化的、放射性 的或有荧光标记的多肽。
本发明多肽的长度最多不超过25个氨基酸是有利的。优选的本发 明多肽的氨基酸的数目为15-25个氨基酸，特别优选为15-22个。在实 验中可以确定的是，多肽的长度会对其效果产生影响。尤其令人惊奇的 是，具有这样长度的氨基酸序列对单核细胞阻滞有抑制作用。
在优选的实施方案中，本发明多肽的氨基酸数目为18-23个，进一
步优选为18-22个，在非常优选的实施方案中，本发明多肽的氨基酸数 目为19-22个，在进一步优选的实施方案中，氨基酸的数目为20-21个。 本发明多肽尤其优选为22个氨基酸。本发明多肽中"氨基酸数目"的 含义当然意味着多肽的氨基酸序列长度。
在本发明多肽优选的实施方案中Xi为赖氨酸，或者在氨基酸序列的 X,位置上为氨基酸缺失，特别优选的是X,为赖氨酸。此外在本发明多 肽优选的实施方案中谷氨酸适合于X2 ,或者在该位置上为氨基酸缺失。 特别优选的是X2为谷氨酸。令人惊奇的是在X,和/或X2位置上有氨基 酸缺失的多肽能够发挥拮抗作用。X,和X2位置适合设置为氨基酸缺失。
X3优选为小的、中性的和柔性的氨基酸。在本发明多肽优选的实施 方案中&选自包含甘氨酸和/或丝氨酸的组，特别优选为甘氨酸。可以 确定的是，该氨基酸对多肽的结构稳定性有积极的作用。这样的稳定性 提高的特别的优点在于，其可以使得多肽稳定性提高，以至于多肽和趋 化因子PF4的相互作用时间可以延长。因此提高了的多肽的稳定性可以 增强多肽的拮抗性。
在本发明多肽优选的实施方案中X4为赖氨酸。
Xs优选自包含丝氨酸、甘氨酸和/或苏氨酸的组。在本发明多肽优选 的实施方案中Xs为丝氨酸。这种多肽的实施方案可以以有利的方式来改 善多肽的溶解性。多肽溶解性的提高特别可以提高多肽在水中的可适用 性。这就有可能简化多肽的给药，即通常基于水的给药方式。此外通过 多肽溶解性的提高可以改善多肽在体内含水系统中的分散性，特别是在 血液中的分散性。
x6优选为丝氨酸。在多肽的进一步优选实施方案中，x7为天冬酰胺。 x8为优选自包含脯氨酸和/或酪氨酸的组的氨基酸。x8特别优选为 脯氨酸。
在本发明多肽特别优选的实施方案中X9为甘氨酸。可以确定的是，
在氨基酸序列的这个位置上的甘氨酸可以使得多肽的连接稳定性非常 惊人。
X10和Xn各自独立地优选自包含缬氨酸和/或异亮氨酸的组。在本 发明多肽优选的实施方案中Xn)为异亮氨酸。在本发明多肽进一步优选 的实施方案中，Xu为异亮氨酸。在本发明多肽特别优选的实施方案中， X,o和Xu均为异亮氨酸。可以确定的是，在多肽的Xw和Xn上的异亮 氨酸有助于提高多肽构象的稳定性。
Xn优选为缬氨酸。乂12优选自包含苯丙氨酸和/或酪氨酸的组，X12
特别优选为苯丙氨酸。Xi4优选为苏氨酸。
X,5优选为精氨酸，此外在X,5位置上也可以为氨基酸缺失。X！、 X2和/或Xu优选为氨基酸缺失。优选的是Xi 、 X2或X!s氨基酸中的一 个被除去，同样X和X2位置上也可以都设置为氨基酸缺失。在本发明 多肽的进一步实施方案中，X!、 X2和X,5都可以设置为氨基酸缺失。在 本发明多肽的优选实施方案中，自X3到X!4的范围内设置为无氨基酸缺 失。
在本发明多肽的优选实施方案中，Xs为丝氨酸，X9为甘氨酸，X10 为异亮氨酸，和/或Xu为异亮氨酸。在本发明多肽的优选实施方案中， Xs为丝氨酸，X9为甘氨酸，Xu)为异亮氨酸，X^为异亮氨酸。可以确
定的是，Xs为丝氨酸，Xg为甘氨酸，Xu)为异亮氨酸，X,3为异亮氨酸
的多肽具有非常优异的拮抗能力。
在本发明多肽的一个进一步优选实施方案中，Xs为丝氨酸，X9为甘
氨酸，Xu)为异亮氨酸，Xu为异亮氨酸，X!为氨基酸缺失，和/或X15 为氨基酸缺失。在本发明多肽的非常优选实施方案中，Xs为丝氨酸，X9 为甘氨酸，X1Q为异亮氨酸，X13为异亮氨酸，X！为氨基酸缺失，X15 为氨基酸缺失。这样设置的多肽同样具有非常优异的拮抗能力。
在本发明多肽的另一个优选实施方案中，Xs为丝氨酸，Xs为酪氨 酸，Xg为甘氨酸，X,。为异亮氨酸，Xu为异亮氨酸，X,为氨基酸缺失， 和/或X15为氨基酸缺失。在本发明多肽的非常优选的实施方案中，X5 为丝氨酸，Xs为酪氨酸，X9为甘氨酸，Xu)为异亮氨酸，Xn为异亮氨
酸，Xt为氨基酸缺失，Xi5为氨基酸缺失。
在本发明多肽的另一个优选的实施方案中，X3为丝氨酸，Xs为丝氨 酸，Xs为酪氨酸，X9为甘氨酸，Xu)为异亮氨酸，X!3为异亮氨酸，Xj 为氨基酸缺失，和/或X5为氨基酸缺失。在本发明多肽的非常优选的 实施方案中，X3为丝氨酸，X5为丝氨酸，Xs为酪氨酸，X9为甘氨酸， X^为异亮氨酸，Xu为异亮氨酸，X!为氨基酸缺失，X!5为氨基酸缺失。
在本发明多肽的另 一个优选实施方案中，X3为丝氨酸，X5为丝氨酸， Xs为脯氨酸，X9为甘氨酸，Xu)为异亮氨酸，Xn为异亮氨酸，Xi为氨 基酸缺失，X2为氨基酸缺失，和/或Xu为氨基酸缺失。在本发明多肽的 非常优选的实施方案中，X3为丝氨酸，X5为丝氨酸，Xs为脯氨酸，X9 为甘氨酸，X,。为异亮氨酸，Xu为异亮氨酸，X,为氨基酸缺失，X2为
氨基酸缺失，Xu为氨基酸缺失。
在本发明多肽的一个进一步优选的实施方案中。X3为丝氨酸，X5 为丝氨酸，Xg为酪氨酸，X9为甘氨酸，X,o为异亮氨酸，X,2为酪氨酸， Xt3为异亮氨酸，X!为氨基酸缺失，X2为氨基酸缺失，和/或X!5为氨基
酸缺失。在本发明多肽的非常优选的实施方案中，Xs为丝氨酸，Xs为丝
氨酸，Xs为酪氨酸，Xg为甘氨酸，X!o为异亮氨酸，X,2为酪氨酸，X13
为异亮氨酸，X,为氨基酸缺失，X2为氨基酸缺失，x^为氨基酸缺失。
在本发明多肽的进一步优选的实施方案中可以这样设置，本发明多
肽具有如下结构式(2)所示的SEQIDNO: 2的氨基酸序列的多肽 CKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRC (2) (SEQ ID NO: 2)
和/或相对于结构式(2)所示的SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，根据结 构式(2)的SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的多肽至少有一个或几个氨基酸 缺失、氨基酸替代和/或氨基酸插入。
氨基酸替代优选涉及的序列范围是选自结构式(2)的SEQ ID NO: 2 的氨基酸序列中的第9位至第20位的氨基酸，即从第9位的甘氨酸至 第20位的苏氨酸的序列范围。优选的是一个或几个选自包含甘氨酸、 半胱氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和/或丙氨酸的组的氨基酸被选自 包含丝氨酸、酪氨酸、异亮氨酸和/或甘氨酸的组的氨基酸所替代。这样 的氨基酸替代的一个优点是，可以增强多肽的稳定性和/或改善多肽的拮
抗效果。
这样的氨基酸替代优选自包括甘氨酸对应丝氨酸，非末端半胱氨酸 对应丝氨酸，脯氨酸对应酪氨酸，缬氨酸对应异亮氨酸，苯丙氨酸对应 酪氨酸，和/或丙氨酸对应甘氨酸的替代。这样的氨基酸替代相互之间可 以任意混合。
尤其优选的是，至少选自结构式(2)的SEQ ID NO: 2的氨基酸序列 的第11位非末端半胱氨酸被丝氨酸替代。这样的替代其优势在于，可 以改善多肽的溶解性，特别是在水中的溶解性。
尤其优选的是，选自结构式(2)的SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的多 肽，在其实施方案中，氨基酸替代优选自甘氨酸对应丝氨酸，半胱氨酸 对应丝氨酸，和/或脯氨酸对应酪氨酸的第9至第14位的氨基酸替代， 即结构式(2)的SEQ ID NO: 2的氨基Si序列中从甘氨酸到脯氨酸的序列 范围。在该序列范围中优选至少含有一个这样的替代，优选至少结构式 (2)的SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的第11位半胱氨酸被丝氨酸替换。此 外在进一步优选的实施方案中，脯氨酸被酪氨酸所替代，和/或甘氨酸被 丝氨酸所替代。在氨基酸序列的第11位上的半胱氨酸的替代可以和其 他任意的氨基酸替代组合，尤其可以同脯氨酸纟皮酪氨酸和/或甘氨酸;波丝 氨酸的替代组合。
同样优选的本发明的实施方案是，选自结构式(2)的SEQ ID NO: 2 的氨基酸序列的多肽，其氨基酸替代涉及第15至第20位上的氨基酸， 即从丙氨酸到苏氨酸。在该氨基酸范围内氨基酸替代优选自包含丙氨酸 对应甘氨酸、缬氨酸对应异亮氨酸和/或苯丙氨酸对应酪氨酸。特别优选 的是，丙氨酸被甘氨酸所替换。优选的是，至少选自结构式(2)的SEQID NO:2的氨基酸序列的第16位的缬氨酸被异亮氨酸所替换，特别优选为 至少两个缬氨酸被异亮氨酸所替换，其中优选将第16和第19位上的缬 氨酸替换为异亮氨酸。同样可以优选的是，每一个选自结构式(2)的SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的缬氨酸都被异亮氨酸所替换。在本发明进一步 的优选实施方案中，苯丙氨酸可被酪氨酸所替换。
在本发明进一步的实施方案中优选的是，选自结构式(2)的SEQ ID
NO: 2的氨基酸序列，其第15位上的丙氨酸被甘氨酸所替换，第16位 上的缬氨酸被异亮氨酸所替换，第19位上的缬氨酸被缬氨酸所替换。 可以确定的是，这样的氨基酸替换可以使得多肽的连接有着非常惊人的
稳定性。
氨基酸替换和/或氨基酸缺失可以相互间任意组合，特别是氨基酸替 换可以相互间任意组合。
此外本发明多肽还可以具有氨基酸缺失的实施方案。优选的氨基酸 缺失包括赖氨酸、谷氨酸和/或精氨酸。氨基酸缺失优选涉及结构式(2) 的SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的第2位上的赖氨酸、第3位上的谷氨酸、 和/或第21位上的精氨酸。氨基酸缺失可以相互间任意组合。优选缺失 一个氨基酸，同时也可以这样设置，既使第2位上的赖氨酸缺失，又使 第21位上的精氨酸缺失。在进一步的实施方案中，可以使第2位上的 赖氨酸、第3位上的谷氨酸、和第21位上的精氨酸缺失。
选自结构式(2)的SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，其第4至第20位的 氨基酸范围内优选设置为没有氨基酸缺失。在特别优选的实施方案中， 在第4至第8位的氨基酸范围内既没有氨基酸缺失也没有氨基酸替代。 选自结构式(2)的SEQ ID NO: 2的氨基酸序列在第9至第20位的氨基酸 范围内具有2个氨基酸替代，优选为3个氨基酸替代，进一步优选为4 个氨基酸替代，再进一步优选为5个氨基酸替代，通过研究可以确定， 这样的氨基酸序列具有优异的拮抗性能。
在这样的实施方案中，多肽的氨基酸数目为15至25个是有利的， 优选为18至23个氨基酸，特别优选为19至22个，进一步优选为20 至21个，尤其优选为22个氨基酸。
本发明多肽、其生理学可接受的盐、衍生物和/或偶联物，其非常适 合的一种实施方案是，具有如下述结构式(3)所示的SEQIDNO: 3的 氨基酸序列
CKEYFYTSGKSSNPGIVFITRC (3) (SEQ ID NO: 3).
通过研究可以确定的是，具有如结构式(3 )所示的SEQ ID NO: 3 的氨基酸序列的多肽有非常高的拮抗潜力。尤其可以确定的是，这样的
多肽有非常优异的拮抗效果。尤其可以确定的是，具有根据结构式(3)
的SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的多肽对于可导致单核细胞阻滞增强的 RANTES和PF4之间的相互作用有显著的以及可复现的抑制作用。
特别的优势在于，具有根据结构式(3 )所示的SEQ ID NO: 3的氨 基酸序列的多肽对RANTES和PF4的相互作用特别有效。因此具有趋 化因子功能的进一步干扰可以被减弱甚至被消除。这就有可能使得本发 明多肽对与单核细胞募集或其他白细胞种类如嗜曙红细胞的依赖 RANTES的募集相关的疾病，尤其是心血管疾病有针对性很强的应用。
本发明多肽、其生理学可接受的盐、衍生物和/或偶联物的另一个优 选的实施方案是，具有如下述结构式(4)所示的SEQIDNO: 4的氨基 酸序列
CEYFYTSGKSSNPGIVF1TC (4) (SEQ ID NO: 4).
本发明多肽、其生理学可接受的盐、衍生物和/或偶联物的另一个优 选的实施方案是，具有如下述结构式(5 )所示的SEQ ID NO: 5的氨基 酸序列
CEYFYTSGKSSNYG而TC (5) (SEQ ID NO: 5).
本发明多肽、其生理学可接受的盐、衍生物和/或偶联物的另一个优 选的实施方案是，具有如下述结构式(6)所示的SEQIDNO: 6的氨基 酸序列
CEYFYTSSKSSNYG簡TC (6) (SEQ ID NO: 6).
本发明多肽、其生理学可接受的盐、衍生物和/或偶联物的另一个优 选的实施方案是，具有如下述结构式(7)所示的SEQIDNO: 7的氨基 酸序列
CYFYTSSKSSNPGIVFITC (7) (SEQ ID NO: 7).
优选实施方案中的多肽的优点在于，这样的多肽优选具有增强了的 稳定性。这就有可能使得大量的多肽可以到达目标位置并与蛋白质或肽 结合物稳定地发生相互作用。多肽的高稳定性尤其有可能使得多肽在体 内和体外都可使用。优选实施方案中的多肽的另一个优点在于，多肽在 水中具有较高的溶解性。较高的溶解性尤其使得多肽简单方便地使用。
此外还可以如下设置每一个L-氨基酸都被D-赖氨酸所替换。这 样可以进一步提高多肽的稳定性。
本发明多肽根据通用的多肽的合成方法制备。
有利的是，本发明多肽作为拮抗剂适合于抑制血小板因子4和 RANTES的相互作用。本发明多肽尤其能抑制RANTES和血小板因子4 的相互作用。
本发明多肽、其生理学可接受的盐、衍生物和/或偶联物作为拮抗剂 适用于抑制RANTES和血小板因子4的相互作用。
基于本发明多肽的优良性质，其适合作为药物使用。
发明的另一个目标涉及本发明多肽的用途，即在生产药物中的用 途，尤其在优选的实施方案中。
本发明可以用通常的方式给药，优选非消化道给药，例如口服给药、 经皮给药、皮下给药和/或静脉给药。例如本发明多肽可以采用体外给药 的方式，如在血管搭桥移植之前，或者经由静脉内给药，例如在导管介 入或支架植入之前或之后。
对于这样的应用来说，在水中具有非常好的溶解性有很大的优势。
除了暂时性的或者急性的治疗之外，本发明多肽的优势还在于可以 在较长时间周期内给药。本发明多肽同样可以以延长释放或者推迟释放 形式之一给药。例如以长效注射或者渗透泵的形式给药。
本发明多肽同样可以以编码每个多肽的核酸的形式给药。在这里核 酸分子被包含在常用的遗传载体中。优选以编码每个多肽的DNA序列 的形式给药。同样可以安排为，以编码本发明多肽的RNA序列的形式 给药。
本发明的另一个主题是编码本发明多肽的核酸，其含有的核酸序列 优选包含编码具有根据结构式(l)的SEQIDNO: 1、根据结构式(2)的SEQ ID NO: 2、根据结构式(3)的SEQ ID NO: 3、根据结构式(4)的SEQ ID NO: 4、根据结构式(5)的SEQIDNO: 5、根据结构式(6)的SEQ ID NO: 6、根 据结构式(7)的SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的多肽的核酸序列。就本发 明所使用的核酸而言，其涉及到DNA和RNA。技术人员熟知为编码根
据上述结构式或序列的多肽的DNA序列。
编码具有根据结构式(3)的SEQ ID NO: 3氨基酸序列的多肽的核酸 分子的一个实例具有如下述结构式(8)所示的SEQ ID NO: 8的DNA 序列
5'-TGCAAGGAATATTTCTACACTTCCGGGAAATCCTCCAATCCTGGAATTG TGTTCATCACTAGATGT-3' (8) (SEQ ID NO: 8).
技术人员熟知另外一种编码具有根据结构式(3)的SEQ ID NO: 3氨 基酸序列的多肽的DNA序列。此外已知的是，核酸的序列的改变是允 许的，例如通过遗传密码的简并性。
编码具有根据结构式(2)的SEQ ID NO: 2氨基酸序列的多肽的核酸 分子的一个实例具有如下述结构式(9)所示的SEQ ID NO: 9的DNA 序列
5'-TGCAAGGAATATTTCTACACTTCCGGGAAATGTTCCAATCCTGCCGTGG TGTTCGTCACTAGATGT-3' (9) (SEQ ID NO: 9).
编码具有根据结构式(4)的SEQ ID NO: 4氨基酸序列的多肽的核酸 分子的一个实例具有如下述结构式(10)所示的SEQ ID NO: 10的DNA
序列 .， 、
TCATCACTTGT-3' (10) (SEQ ID NO: 10).
编码具有根据结构式(5)的SEQ ID NO: 5氨基酸序列的多肽的核酸 分子的一个实例具有如下述结构式(11 )所示的SEQ ID NO: 11的DNA 序列
5'-TGCGAATATTTCTACACTTCCGGGAAATCCTCCAATTACGGAATTGTGT TCATCACTTGT-3' (U) (SEQ ID NO: 11).
编码具有根据结构式(6)的SEQ ID NO: 6氨基酸序列的多肽的核酸 分子的一个实例具有如下述结构式(12)所示的SEQ ID NO: 12的DNA 序列
5'-丁GCGAATATTTCTACACTTCCTCTAAATCCTCCAATTACGGAATTG丁GTT CATCACTTGT-3' (12) (SEQ ID NO: 12).
编码具有根据结构式(7)的SEQ ID NO: 7氨基酸序列的多肽的核酸 分子的一个实例具有如下述结构式(13)所示的SEQ ID NO: 13的DNA 序列
CACTTGT-3' (13) (SEQ ID NO: 13),
技术人员熟知其他的编码具有根据结构式(l)的SEQ ID NO: 1、根据 结构式(2)的SEQ ID NO: 2、根据结构式(3)的SEQ ID NO: 3、才艮据结构 式(4)的SEQ ID NO: 4、根据结构式(5)的SEQ ID NO: 5、根据结构式(6) 的SEQ ID NO: 6、根据结构式(7)的SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的多肽 的DNA序列。同样，4支术人员熟知编码具有根据结构式(l)的SEQ ID NO: 1、根据结构式(2)的SEQIDNO:2、根据结构式(3)的SEQ ID NO: 3、根 据结构式(4)的SEQIDNO:4、根据结构式(5)的SEQ ID NO: 5、根据结 构式(6)的SEQ ID NO: 6、根据结构式(7)的SEQ ID NO: 7的氨基酸序列 的多肽的RNA序列。
优选的本发明多肽的个人给药剂量范围为10mg/天/75kg体重至 1000mg/天/75kg体重，非常优选为50mg/天/75kg体重至200mg/天/75kg 体重，尤其优选为150mg/天/75kg体重。
本发明多肽、其生理学可接受的盐、衍生物和/或偶联物和/或核酸 对于与单核细胞募集相关的疾病的治疗和/或预防处置、诊断和/或治疗 均适用。例如心血管疾病和/或炎症，尤其是动脉硬化、狭窄、高血压和 /或移植排斥反应，属于这类疾病。
本发明多肽和/或核酸适用于哺乳动物的治疗，尤其是人类。
本发明多肽会对单核细胞在内皮的粘附产生影响。令人惊奇的发 现，本发明多肽尤其优选的实施方案能够抑制由RANTES和PF4的异 嗜相互作用导致的单核细胞阻滞的增强。有利的是，尤其优选的实施方 案在实验中对由RANTES和PF4的异嗜相互作用导致的单核细胞阻滞 的增强显示出比迄今已知的蛋白质或肽结合物都更强的抑制作用。
本发明多肽的一个特殊的优点可以通过这样的方式实现，通过本发 明多肽的给药，可以减弱或消除动脉硬化的形成，手术后或用药后的再 狭窄，例如在气嚢扩张术，经皮腔内斑块旋切术或者分流术之后的再狭 窄。本发明多肽的特殊优点在于，本发明多肽可以减弱或消除在终末期 的，或者临床的疾病或者形态学上的动脉硬化的变化时单核细胞在内皮 上的进一步募集。
本发明多肽的特殊优点在于，本发明多肽尤其适用于预防治疗例如 有高血压威胁的病人。采用这样的预防治疗是非常有利的，其有可能使用。
本发明的另一主题相应地涉及本发明多肽、其生理学可接受的盐、 衍生物和/或偶联物的用途，即在生产治疗和/或预防选自以下的组中的
疾病的药物中的用途，该组包括
-同单核细胞募集相关的疾病，如心血管疾病和/或炎症，尤其是动 脉硬化、动脉粥样硬化、动脉粥样斑、狭窄、再狭窄、高血压、关节炎、 心肌炎、自身免疫疾病包括脑脊髓炎、肠炎、梗塞例如心肌梗塞或脑血 管梗塞后的再灌注、移植排斥和/或皮肤病，如牛皮癣,和/或
-与其他白细胞种类如嗜曙红细胞的依赖RANTES的募集相关的疾 病，尤其是过敏性疾病，如哮喘或肺炎。
尤其是在治疗人的动脉粥样硬化病变时，使用本发明多肽对病程有 很好的效果。本发明多肽尤其可以通过单核细胞阻滞来减弱动脉硬化病 变的恶化。本发明多肽的另一个优点是，可以减弱或者甚至消除器官和 /或组织移植后的排斥反应。
本发明多肽的优点尤其在于，没有或者只产生很小的副作用。这就 有可能使得本发明多肽可以用于疾病预防。此外本发明多肽的优点尤其 在于，由于本发明多肽的特异性可以避免对进一步的新陈代谢过程产生 影响，以至于使得可以例如对有高血压危险的病人或预防动脉硬化病变 进行预防给药。
本发明的另 一主题涉及包含本发明多肽的药物，优选包含根据结构 式(l)的SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的多肽、其生理学可接受的盐、衍 生物和/或偶联物。本发明药物特别优选包含选自包含按照结构式(3)的 SEQ ID NO: 3、按照结构式(4)的SEQ ID NO: 4、按照结构式(5)的SEQ ID NO: 5、按照结构式(6)的SEQ ID NO: 6、按照结构式(7)的SEQ ID NO: 7 的氨基酸序列的多肽的组。本发明药物尤其优选包含按照结构式(3)的 SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的多肽。本发明药物优选具有按照上述结构
式或SEQ ID编号中的一个的多肽，本发明药物可以设置为具有按照几 种结构式或SEQ ID编号的多肽。
包含本发明多肽的药物尤其适用于例如人类的体内治疗。包含本发 明多肽的药物的一种优选用途是治疗和/或预防与单核细胞募集相关的 疾病，例如心血管疾病和/或炎症，尤其是动脉硬化、动脉粥样硬化、动 脉粥样斑、狭窄、再狭窄、高血压、关节炎、心肌炎、自身免疫疾病包 括脑脊髓炎、肠炎、梗塞例如心肌梗塞或脑血管梗塞后的再灌注、移植 排斥和/或皮肤病，如牛皮癣，和/或与其他白细胞种类如嗜曙红细胞的 依赖RANTES的募集相关的疾病，尤其是过敏性疾病，如哮喘或肺炎。
同时本发明的主题是包含编码本发明多肽的核酸的药物。在这里核 酸分子包含在常用的遗传载体中。
本发明的另 一主题涉及抑制单核细胞阻滞的药物，其包含本发明多 肽、其生理学可接受的盐、衍生物和/或偶联物，优选包含按照结构式(3) 的SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的多肽。
"抑制单核细胞阻滞的药物，，在本发明中的含义是该药物对与单核 细胞例如在内皮上固定的单核细胞阻滞相关的疾病有积极的影响。尤其 可以减弱或者甚至消除动脉硬化斑的形成。本发明多肽的应用可以优选 减弱和/或完全或几乎完全消除单核细胞募集和/或其在活性内皮上的固
定尤其是在动脉硬化斑或心内膜上的固定。 用于阐明本发明的实施例如下
材料和方法 细胞培养
来自人脐带的内皮细胞(HUVEC， human umbilical vein endothelial cells, promoCell,德国汉堡)在内皮细胞生长培养基(PromoCell,德国汉 堡)中培养，使用2至4代以后的细胞。
单核细胞Mono Mac 6-细胞(MM6， DSMZ)在RPM1 1640培养基 (PAA实验室，帕兴(Pasching),奥地利)中培养，该培养基中添加了 10%的胎牛血清，2mML谷氨酰胺(Biowhittaker)， ImM丙酮酸钠，50 ju g/ml庆大霉素和9 |a g/ml胰岛素(MM6培养基)。将浓度为2 x 105ml的细
胞接种于24孔板中的2ml MM6培养基中，并且在细胞用于实验之前于 37。C下在含5%的C02的潮湿气氛中培养3至4天。 多肽
按照结构式(3)的SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的多肽，按照结构式 (15)的SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的小鼠-直系同源物以及按照结构式 (14)的SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的调节肽通过基于t-Boc的多肽固相 化学合成法，在使用4-苯曱基羟胺树脂的情况下合成。多肽的分子量通 过电喷雾质语分析法确定(Dawson PE , Kent SB.(2000) Annu Rev Biochem. 69: 923-960， Hackeng TM, Gri伍n JH， Dawson PE.(1999) Proc Natl Acad Sci U S A., Vol 96， S.10068-10073)。
实施例1
等离振子共振研究可用于分析包含按照结构式(3)的SEQ ID NO: 3 的氨基酸序列的多肽对RANTES和PF4异相聚集形成的抑制效果。
等离振子共振研究可使用HBS-EP緩沖液(10mM HEPES， 150mM NaCl, 0.005% Tween 20， pH7.4)中进行。
CI芯片(Biacore AB， Uppsala,瑞典)的两个细月包流动腔通过注入50 ial乙基(二曱基氨丙基)碳二亚胺/N-羟基-琥珀酰亚胺(0.2M/0.05M， Pierce公司)活化，并且紧接着将20 m 1链霉抗生物素蛋白灌注于其表面。 接下来在细胞表面连续4次注射20ial乙二胺(1M, pH8, Sigma-Aldrich) 使其失活。
N-末端生物素化的人血小板因子4 (bPF4)通过基于t-Boc的多肽固 相化学合成法和PF4的自然化学连接法来合成(Dawson PE ， Kent SB.(2000) Annu Rev Biochem. 69: 923-960, Hackeng TM， Griffin JH， Dawson PE,(1999) Proc Natl Acad Sci U S A" Vol 96, S.10068-10073)。该 bPF4在CI传感芯片的葡聚糖表面上固定，其中将HBS-EP緩冲液中的 200 iu g/ml的bPF4注射于流动腔表面，核磁单位(RU)采用240。不用bPF4 处理的第二个流动腔作为对照。
RANTES (0.5|aM，重组人RANTES ， Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA )，或者0 ja M、 10 |a M、 50 |a M以及100 |a M不同浓度的RANTES(0.5
yM)及包含按照结构式(3)的SEQ ID NO: 3氨基酸序列的多肽在 HBS-EP緩冲液中室温下预畔育一夜，在bPF4的流动腔上各注射15 n 1 肽/RANTES混合物，并观察RANTES的结合180秒。结合的过程和测 试都通过Biacore2000设备(Biacore AB)以5 ju 1/min的流速进行。RANTES 结合的传感图通过BIAevaluation 3.0软件(Biacore AB)对非特异性的背 景信号进行校正，对每一次注射确定平衡核磁单位(RU)。
结果表明，按照结构式(3)的SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的多肽对 RANTES和PF4的相互作用有依赖于浓度的抑制作用，其中在固定化的 PF4上的RANTES的结合物在按照结构式(3)的SEQ ID NO: 3的氨基酸 序列的多肽的存在下浓度下降了 100 mM。
实施例2
等离振子共振研究可用于分析具有按照结构式(3)的SEQ ID NO: 3 的氨基酸序列、按照结构式(2)的SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的多肽以 及调节肽对RANTES和PF4异相聚集形成的抑制效果。
在进一步的实验中，在实施例1所述的条件下，将RANTES(0,5ju m)的结合或者含有0juM、 IOijM、 50 |a M以及100 |a M不同浓度的包 含按照结构式(3)的SEQ ID NO: 3、按照结构式(2)的SEQ ID NO: 2的氨 基酸序列的多肽的RANTES(0.5 u M)的结合、或者按照如下所示结构式 (14)的SEQ ID NO: 14的氨基S臾序列的调节肽预先孵育，用于研究 KEYFYTSGK (14) (SEQ ID NO: 14)
研究发现，在该实验中，在多肽浓度为10mM、 50juM和100yM 时，具有按照结构式(3)的SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的多肽比具有按 照结构式(2)的SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽对RANTES和PF4的 相互作用有更明显有效的抑制作用。具有按照结构式(14)的SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的调节肽在浓度为100 u M时未表现出可证明的抑制作 用。
实施例3
对活性内皮上单核细胞阻滞的抑制作用。
研究了单核细胞Mono Mac 6-细胞在活性内皮细胞上的相互作用。
将含有被IL曙1 (3(白介素1 (3， Peprotech,10ng/ml，12小时)活化的汇 合HUVEC-细胞层的培养皿置于流动腔中。Mono Mac 6细胞(0.5 x 106 细胞/ml)在含有0.5。/o牛血清白蛋白(Serva)的pH 7.3标准Hank溶液(含 有10mMHepes的HBSS溶液)中再悬浮，并且保持在冰上。在实验5分 钟之前，向MM6单核细胞中添加Ca"和Mg2、及最终浓度分别为lmM 和60nM的趋化因子RANTES(Peprotech， Rockey Hill, NJ， USA)和 PF4(ChromaTec, Greifswald)和6 |u M的具有按照结构式(3)的SEQ ID NO: 3、按照结构式(2)的SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽、具有按照结构 式(14)的SEQIDNO: 14的序列的调节肽，并且升温至37°C。然后将经 过这样预处理的细胞在1.5dyn/cm2的剪切力下借助于Olympus公司的IX 50型显微镜灌注于内皮上。通过同内皮细胞相互作用粘附的单核细胞的 数目将通过使用视频摄像机(3CCD， JVC)和记录仪在多视角下确定。得 到的数据取平均值(n巧)±标准差(p0.02),对控制效果进行评估。
可以确定的是，具有结构式(3)的SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的多 肽对RANTES和PF4的异嗜性相互作用的增强有明显的抑制作用，例 如可以达到80%，而具有结构式(2)的SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的多 肽的抑制作用较弱。结构式(14)的SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的调节 肽相比而言无明显的抑制作用。
实施例4
对动脉硬化小鼠模型的体内研究
使用9至12周大的雌性ApoE-A同窝出生的小鼠(The Jackson Lab, Bar Harbor, Maine, USA)作为动脉硬化的模型。在12周内这些小鼠以高 脂肪喂养(21Q/。Fett; Altromin C1061)。在这段时间内对两组小鼠每周三 次腹膜内注射50 Mg的盐溶液中的按照如下所示结构式(15)的SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的多肽，
CKEYFYTSSKSSNLAVVFVTRC (15) (SEQ ID NO: 15)
(n=12只小鼠)或者按照如下所示结构式(14)的SEQ ID NO: 14的氨 基酸序列的调节肽
KEYFYTSGK (14) (SEQ ID NO: 14)(n=7只小鼠)。 一组未被处理的小鼠(11=12)作为对照。
将小鼠杀死用于组织学研究。在实验期间小鼠都健康并未表现出患 病迹象。从实验开始至实验结束都抽取血样。白细胞数通过血细胞计数 法确定，并收集血清，胆固醇水平通过Infinity 胆固醇设备(Thermo Electron, Melbourne,澳大利亚)来确定。
在主动脉根部和胸腹部主动脉处确定动脉硬化的程度，其中脂类沉 积物通过油红-0-染并+染色(Veillard NR, Kwak B， Pelli G， Mulhaupt F， James RW， Proudfoot AE, Mach F. Antagonism of RANTES receptors reduces atherosclerotic plaque formation in mice. Circ Res. 2004;94:253-61 ) 并借助于计算机图像分析(Dikus软件，Hilgers， Aachen)来量化。在通过心 脏和主动脉的5|am的横断切片中确认动脉粥样硬化病变区域。对每个 主动脉根，借助彼此相距50|am的6个切片的脂类染色区域来确定动脉 粥样硬化病变区域。动脉粥样硬化病变区域分布在各个切面的染色表面 上。沿着腹部中位线打开胸腹部主动脉，在正面解剖下用油红-O-染料染 色病变区域。计算脂类沉积物的量，其中染色区域的面积通过均分胸腹 部主动脉染色的总面积来评估。
可以确定的是，用结构式(15)的SEQ ID NO: 15氨基酸序列的多肽 和结构式(3)的SEQ ID NO: 3氨基酸序列的多肽的小鼠-直系同源物处理 过的小鼠，与用调节肽处理过的小鼠相比，动脉粥样硬化病变的进展明 显减弱。此外可以确定的是，表现出动脉硬化斑的主动脉根部区域，相 对于处理过的小鼠中的总的瓣膜表面同样有明显的减弱效果。同样可以 确定的是，动脉粥样硬化病变中的巨噬细胞也明显减少。
因此可以表明，按照结构式(3)的SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的多 肽的小鼠-直系同源物可以减緩体内动脉粥样硬化的进展，因此本发明多 肽可以用于临床治疗。
权利要求
1.一种多肽、其药理学上可接受的盐、衍生物和/或偶联物，其特征在于，该多肽具有如下述结构式(1)所示的SEQ ID NO1的氨基酸序列C-X1-X2-YFYTS-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-C(1)(SEQ ID NO1)其中X1选自包含赖氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、组氨酸和/或天冬酰胺的组，或氨基酸缺失；X2选自包含谷氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酰胺的组，或氨基酸缺失；X3选自包含甘氨酸、丝氨酸和/或丙氨酸的组；X4选自包含赖氨酸、亮氨酸和/或精氨酸的组；X5选自包含丝氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和/或苏氨酸的组；X6选自包含丝氨酸、甘氨酸和/或苏氨酸的组；X7选自包含天冬酰胺和/或谷氨酰胺的组；X8选自包含脯氨酸、酪氨酸和/或甘氨酸的组；X9选自包含甘氨酸、丙氨酸和/或丝氨酸的组；X10选自包含异亮氨酸、缬氨酸和/或天冬酰胺的组；X11选自包含缬氨酸、异亮氨酸和/或天冬酰胺的组；X12选自包含苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸和/或甲硫氨酸的组；X13选自包含异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和/或苯丙氨酸的组；X14选自包含苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和/或酪氨酸的组；X15选自包含精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和/或天冬酰胺的组，或具有一种氨基酸缺失。
2. 按照权利要求1的多肽，其特征在于，该多肽的氨基酸数目为 19-22个。
3. 按照权利要求1或2的多肽，其特征在于，X！为赖氨酸或缺失。
4. 按照前述权利要求中任一项的多肽，其特征在于，X2为谷氨酸或缺失。
5. 按照前述权利要求中任一项的多肽，其特征在于，X3为选自包含甘氨酸和/或丝氨酸的组。
6. 按照前述权利要求中任一项的多肽，其特征在于，Xs为丝氨酸。
7. 按照前述权利要求中任一项的多肽，其特征在于，Xs为选自包含 脯氨酸和/或酪氨酸的组。
8. 按照前述权利要求中任一项的多肽，其特征在于，X9为甘氨酸。
9. 按照前述权利要求中任一项的多肽，其特征在于，Xu)为异亮氨酸。
10. 按照前述权利要求中任一项的多肽，其特征在于，X,2为选自包含苯丙氨酸和/或酪氨酸的组。
11. 按照前述权利要求中任一项的多肽，其特征在于，Xu为异亮氨酸。
12. 按照前述权利要求中任一项的多肽，其特征在于，Xu为选自包 含精氨酸或缺失。
13. 按照前述权利要求中任一项的多肽，其特征在于，该多肽具有 如下述结构式(2)所示的SEQIDNO:2的氨基酸序列CKEYFYTSGKCSNPAVWVTRC (2) (SEQ ID NO: 2) 和/或相对于按照结构式(2)的SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，按照结构式(2)的SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的多肽至少有一个或几个氨基酸缺失、氨基酸替代和/或氨基酸插入。
14. 按照前述权利要求中任一项的多肽、其药理学上可接受的盐、 衍生物和/或偶联物，其特征在于，该多肽具有如下述结构式(3)所示的SEQ ID NO: 3的氨基酸序列CKEYFYTSGKSSNPGIVFITRC (3) (SEQ iD NO: 3).。
15. 按照前述权利要求中任一项的多肽、其药理学上可接受的盐、 衍生物和/或偶联物，其特征在于，该多肽具有如下述结构式(4)所示 的SEQ ID NO: 4的氨基酸序列CEYFYTSGKSSNPG1VFITC (4) (SEQ ID NO: 4).
16. 按照前述权利要求中任一项的多肽、其药理学上可接受的盐、衍生物和/或偶联物，其特征在于，该多肽具有如下述结构式(5)所示的SEQ ID NO: 5的氨基酸序列CEYFYTSGKSSNYGIVFITC (5) (SEQ ID NO: 5).。
17. 按照前述权利要求中任一项的多肽、其药理学上可接受的盐、衍生物和/或偶联物，其特征在于，该多肽具有如下述结构式(6)所示的SEQ ID NO: 6的氨基SH序列CEYFYTSSKSSNYGIVFITC (6) (SEQ ID NO: 6).。
18. 按照前述权利要求中任一项的多肽、其药理学上可接受的盐、 衍生物和/或偶联物，其特征在于，该多肽具有如下述结构式(7)所示 的SEQ ID NO: 7的氨基酸序列CYFYTSSKSSNPGIVFITC (7) (SEQ ID NO: 7).。
19. 按照前述权利要求中任一项的多肽、其药理学上可接受的盐、 衍生物和/或偶联物作为拮抗剂抑制RANTES和血小板因子4的相互作 用的用途。
20. 按照前述权利要求中任一项的多肽、其药理学上可接受的盐、 衍生物和/或偶联物在生产药物中的用途。
21. 按照前述权利要求中任一项的多肽、其药理学上可接受的盐、 衍生物和/或偶联物在生产治疗和/或预防选自以下的组中的疾病的药物 中的用途，该组包括-同单核细胞募集相关的疾病，如心血管疾病和/或炎症，尤其是动 脉硬化、动脉粥样硬化、动脉粥样斑、狭窄、再狭窄、高血压、关节炎、 心肌炎、自身免疫疾病包括脑脊髓炎、肠炎、梗塞后的再灌注、移植排 斥和/或皮肤病，和/或-与其他的白细胞种类如嗜曙红细胞的依赖RANTES的募集相关的 疾病，尤其是过敏性疾病，如哮喘或肺炎。
22. —种药物，其包含按照前述权利要求中任一项的多肽、其药理 学上可接受的盐、衍生物和/或偶联物。
23. 抑制单核细胞阻滞的药物，其包含按照前述权利要求中任一项 的多肽、其药理学上可接受的盐、衍生物和/或偶联物。
24. —种核酸，其包含编码按照前述权利要求中任一项的多肽的核酸序列。
25. —种药物，其包含编码按照前述权利要求中任一项的多肽的核酉炱。
全文摘要
本发明涉及按照结构式(1)的SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽，及其在制备用于治疗与单核细胞募集有关的疾病的药物中的用途。
文档编号C07K14/52GK101356190SQ200680044626
公开日2009年1月28日 申请日期2006年10月11日 优先权日2005年10月14日
发明者C·韦伯, P·冯·洪德尔斯豪森, R·克嫩 申请人:卡罗勒斯治疗公司