病毒整合酶抑制剂和使用方法

专利名称：病毒整合酶抑制剂和使用方法
病毒整合酶抑制剂和使用方法
背景技术：
根据公开的统计数字，估计全球有超过4千万人被人类免疫缺乏病毒(HumanImmunodeficiency Virus, HIV)/ 获得性免疫缺乏综合症(Acquired ImmunodeficiencySyndrome, AIDS)感染并且约2千2百万人已死于AIDS (CDC，2000国际统计数字)。为了对抗此流行病，深入研究已集中于抑制此病毒的分子机制或治疗与其相关的症状。尽管AZT为首个针对此疾病开具的先锋药物，但近年来诸如蛋白酶抑制剂、其它核苷类似物转录酶抑制剂或非核苷逆转录酶抑制剂等众多药物已变得可用。由于其效用提高，所以此等药物标志着治疗HIV和AIDS方面的巨大进步。尽管此等药物已显示有希望控制病毒感染，但受感染细胞的储液囊会保留并且有可能产生抗性变异体。举例来说，许多这些药物不能有效跨越血液/脑屏障，这允许在脑中的整个下列细胞中进行不经检查的复制和传导毛细血管内皮细胞(capillary endothelial cell)、星形胶质细胞(astrocyte)、巨曬细胞(macrophage)(小胶质细胞(microglia))、少突胶质细胞(oligodendrocyte)、脉 络丛(choroid plexus)、神经节细胞(ganglion cell)、神经母细胞瘤细胞(neuroblastomacell)、胶质瘤细胞(glioma cell)和神经元(neuron)。CNS感染的后果包括神经和精神并发症，诸如痴呆、认知病症、重性抑郁症、精神病和多发性神经病。除以上提及的药物之外，许多研究已集中于抑制HIV整合酶(IN)，一种促进HIVDNA整合入基因组中的酶。然而，因为活体外反应发生在聚集而非可溶性系统中，所以已证明对IN进行研究相当成问题。推论在细胞内，IN执行(I)HIV DNA的3'端加工步骤，其中2个核苷酸从病毒DNA的3'端裂解和(2)链转移反应，其中病毒DNA的3'端连接于目标DNA。为了适当地起作用，认为IN必须与病毒DNA、宿主DNA、和其它病毒和宿主蛋白质因子一起装配成复合物。迄今为止，已发现IN的众多链转移抑制剂，其包括雷特格韦(raltegravir)(也称为艾生特(Isentress)或MK 0518) ;二酮类似物，诸如S-1360、L-870、810 和 GS-9137 ;和萘啶酮(naphthyridione) GSK 36473(菲利普科特(PhilippeCotelle),关于抗感染药物发现的新近专利(Recent Patents on Anti-Infective DrugDiscovery), I : 1_15 (2006))。然而，归因于IN突变，HIV可能变得对这些药物具有抗性，从而导致高失败率和无效治疗。尽管已鉴别出治疗HIV和AIDS的药物，但对会抑制HIV整合酶的新颖药物和允许快速筛选会相互作用并抑制或降低IN活性的肽或小分子的药物筛选方法存有需要。

发明内容
根据如本文中体现并广泛描述的本发明的目的，本发明涉及抑制HIV整合酶活性的组合物和方法。还描述鉴别可抑制HIV整合酶以用于治疗或预防HIV的药剂的方法。公开的组合物和方法的其它优点将部分阐述于随后描述中，并部分地将根据描述而了解，或可通过实践公开的组合物和方法来探悉。公开的组合物和方法的优点将借助于在随附权利要求书中特定指出的要素及组合来实现并获得。应了解，上文的概括性描述和下文的详细描述均为示范性和说明性的，并且对如所主张的本发明不具有限制性。


被并入并构成本说明书的一部分的

公开的方法及组合物的若干实施例并且连同描述一起用于说明公开的方法和组合物的原理。图I显示酵母双杂交体筛选，其中在腺嘌呤板上的生长表明可选择报告基因(reporter)的活化。图2显示环状目标DNA的半位点整合与协同整合两者的模型。图3显示在不脱去蛋白质的情况下对协同DNA整合的分析。图4显示在脱去蛋白质的情况下对协同DNA整合的分析。 图5显示本文所述的肽在添加DNA之前抑制IN。图6显示本文所述的肽可结合缺乏N端的IN并且也可结合缺乏C端的IN。
具体实施例方式公开的方法和组合物可通过参考对特定实施例和其中所包括实例的以下详细描述并参考图式和其先前及以下描述而得以更容易地了解。在公开并描述本发明化合物、组合物和/或方法之前，应了解，下述方面不限于特定化合物、合成法或用途，因为它们当然可能变化。也应了解，本文中使用的术语仅出于描述特定方面的目的并不希望具有限制性。公开的物质、组合物和组分可用于公开的组合物和方法、可连同公开的组合物和方法使用、可用于制备公开的组合物和方法或作为公开的组合物和方法的产品。本文中公开这些和其它物质，并且应了解，当公开这些物质的组合、子组、相互作用、群组等时，尽管可能未明确公开这些化合物的每一个各种个别和集合组合与排列的特定内容，但各自皆明确地涵盖并描述于本文中。举例来说，如果公开并论述一种肽并论述可对包括所述肽的许多分子做出的许多修饰，则除非相反地加以明确指示，否则明确涵盖肽和可能修饰的每一个组合与排列。因此，如果公开一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F，并公开组合分子A-D的一实例，则即使未个别地叙述每一个，每一个也个别地及共同地被涵盖。因此，在本实例中，组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F的每一个皆明确地被涵盖并且应视为根据A、B和C ;D、E和F ;和例示性组合A-D的公开内容而公开。同样，这些的任何子组或组合亦明确地被涵盖和公开。因此，举例来说，A-E、B-F和C-E的子群明确地被涵盖并且应视为根据A、B和C ;D、E和F ;和例示性组合A-D的公开内容而公开。这个概念适用于本申请案的所有方面，包括(但不限于)制备和使用公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果有可执行的多种其它步骤，则应了解，这些其它步骤的每一个皆可与公开的方法的任何特定实施例或实施例的组合一起执行，并且每一个所述组合皆明确地被涵盖并应视为被公开。浓度、量和其它数值数据在本文中可以范围格式表述或呈现。应了解，所述范围格式仅为方便和简洁起见而使用并因此应灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围的界限的数值，而且也包括涵盖在范围内的所有个别数值或子范围，就如同每一个数值和子范围被明确叙述一样。作为一说明，“约I至5”的数值范围应解释为不仅包括约I至约5的明确叙述值，而且也包括在指示范围内的个别值和子范围。因此，诸如2、3和4的个别值和诸如1-3、2-4和3-5等的子范围以及个别地I、2、3、4和5包括在此数值范围中。相同原则适用于仅叙述I个数值作为最小值或最大值的范围。此外，无论所述范围或特征值的宽度如何，所述解释也应适用。仅使用常规实验，所属领域的技术人员将认识到或能够确定本文所述的组合物和方法的特定实施例的许多等效物。希望所述等效物由随附权利要求书涵盖。应了解，公开的组合物和方法不限于所述特定方法、方案和试剂，因为它们可能变化。也应了解，本文中使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，并且不希望限制将仅受随附权利要求书限制的本发明的范围。如本文所用，多个项目、结构要素、组成要素和/或物质为方便起见可以通用列表呈现。然而，这些列表应解释为似乎列表的每一个成员皆个别地鉴别为单独及独特成员一样。因此，在不相反地加以指示的情况下，所述列表中的个别成员不应仅基于其在通用群组中的表现而解释为同一列表的任何其它成员的事实上等效物。除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语皆具有与公开的方法和组合物所属的领域中的技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文所述的方法和物质类似或等效的任何方法和物质皆可用于实践或测试本发明方法和组合物，但尤其适用的方法、装·置和物质如所描述。本文中引用的公开案和其所引用的材料据此以引用的方式明确并入本文中。不承认任何参考文献构成现有技术。参考文献的论述陈述其作者所主张的内容，并且申请人保留质疑所引用的文件的准确性和相关性的权利。必须注意的是，如本文和随附权利要求书中所用，除非上下文明确另外规定，否则单数形式“一个(种)”和“所述”包括多个参照物。因此，举例来说，提及“一种肽”包括多个所述肽，提及“所述肽”相当于提及一种或一种以上肽和所属领域的技术人员已知的其等
效物等等。范围在本文中可表述为从「约」一特定值和/或到「约」另一特定值。当表述所述范围时，另一实施例包括从一特定值和/或到另一特定值。类似地，当值通过使用先行词「约」表述为近似值时，应了解特定值形成另一实施例。应进一步了解每一个范围的终点相对于另一终点和独立于另一终点均有效。也应了解有许多值在本文中公开，并且除所述值本身之外，每一个值在本文中亦公开为“约”那个特定值。举例来说，如果公开值“10”，则亦公开「约10」。也应了解当公开一个值时，还公开“小于或等于所述值”、“大于或等于所述值”和介于值之间的可能范围，如所属领域的技术人员所适当了解。举例来说，如果公开值“10”，则还公开“小于或等于10”以及“大于或等于10”。也应了解在本申请案整篇中，数据以许多不同格式提供，并且这些数据表示终点和起点和数据点的任何组合的范围。举例来说，如果公开特定数据点“10”和特定数据点“15”，则应了解大于、大于或等于、小于、小于或等于和等于10和15以及介于10与15之间视为被公开。也应了解介于两个特定单位之间的每一个单位也被公开。举例来说，如果公开10和15，则还公开11、12、13和14，包括非整数值。在本申请案整篇中，参考各种公开案。这些公开案的公开内容据此以全文引用的方式并入本申请案中以更充分描述本发明所属的技术现状。公开的参考文献也关于其中所含的在依赖参考文献的语句中所论述的材料以引用的方式个别和明确地并入本文中。在本说明书中和在随后权利要求书中，将提及应定义为具有以下含义的许多术语。
“任选(optional) ”或“任选存在(optionally) ”意味随后描述的事件或事项可发生或可不发生，并且描述包括所述事件或事项发生的情况和其不发生的情况。举例来说，短语“任选存在的治疗剂”意味所述治疗剂可被包括或可不被包括。在本说明书的描述和权利要求书整篇中，措词“包含”和所述措词的变化形式意味“包括(但不限于)”并且不希望排除例如其它添加物、组分、整数或步骤。如本文所用，“个体”是指处于病毒(包括逆转录病毒，诸如HIV)风险中或已感染病毒并会受益于本文所述的方法和组合物的哺乳动物，包括人类。如本文所用，“病毒整合酶”是指由病毒(包括逆转录病毒，诸如HIV)产生的使病毒DNA能够整合或促进病毒DNA整合入被感染细胞或组织的目标DNA (包括基因组DNA)中的酶。
如本文所用，“蛋白质结构域”是指蛋白质的一部分、蛋白质的多个部分或显示结构完整性的整个蛋白质；此确定可基于蛋白质的一部分、蛋白质的多个部分或整个蛋白质的氨基酸组成。举例来说，HIV整合酶可分成3个域，其包括N端部分、中心核和C端部分。如本文所用，术语“肽”可用于指代包含通过I个氨基酸的羧基与另一氨基酸的a氨基连接而进行连接的两个或两个以上氨基酸的天然或合成分子。肽不受长度限制；因此“肽”可包括多肽和蛋白质。如本文所用，术语“核酸”可用于指代包含单一核苷酸或通过磷酸酯基在I个核苷酸的3'位置处与另一核苷酸的5'端连接而进行连接的两个或两个以上核苷酸的天然或合成分子。核酸不受长度限制，因此核酸可包括脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。如本文所用，术语“变异体”是指具有保守氨基酸取代、非保守氨基酸取代(也就是简并变异体)、在每一个编码氨基酸的密码子(也就是DNA和RNA)的摆动位置内的取代、肽C端添加氨基酸的氨基酸或肽序列，或与如本文所述的SEQID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQID NO :3 或 SEQ ID NO :4 具有 60%、70%、80 %、90%或 95% 同源性的肽。如本文所用，术语“小分子”是指会抑制或降低病毒整合酶活性的小型有机化合物、无机化合物或其任何组合；本术语可包括单体或初级代谢物、次级代谢物、生物胺、类固醇或合成或天然非肽生物分子。如本文所用，“降低”是指相较于阳性对照，使与例如病毒整合酶相关的酶活性降低 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或 99%，包括介于之间的非整数值。如本文所用，“抑制”是指相较于阳性对照，使与例如病毒整合酶相关的酶活性降低80%、85%、90%、95%、99%或100%，包括介于之间的非整数值。如本文所用的术语“预防”不要求完全阻止病状或疾病，而是也可包括减少疾病或病状的发作或减轻其严重性。因此，如果疗法可治疗患有疾病症状的个体的疾病，则其也可预防终究将会罹患一些或所有症状的个体的那种疾病。如本文所用，“测量”是指测定酶关于使病毒DNA整合入目标DNA中的活性(也就是病毒整合酶或链转移复合物(STC)活性)(无论相对活性或绝对活性)的量或丰度的过程。如本文所用，“替代”是指破坏例如蛋白质结构域与肽、蛋白质结构域与化合物、蛋白质结构域与核酸序列之间的分子或化学相互作用，这是通过与所替代的肽、化合物或核酸相比对所述特定蛋白质结构域更具亲和力的化合物、肽或核酸来进行。A.组合物I.肽本文中公开结合且抑制HIV整合酶(IN)的纯化肽。在一些方面，肽包含氨基酸序列 SEQ ID NO 1 (LeuTyrGluThrI IeLeuI leLeuLeuPheLeuAspValAspThrGly) > SEQ ID NO:2(LeuTyrGluThrIIeLeuIleLeuLeuPheLeuAspValAspThrGlyLysLysArg)或 SEQ ID NO:3 (LeuTyrGluThrIIeLeuIleLeuLeuPheLeuAspValAspThrGly AspGluAsp)。在一些方面，妝包含氨基酸序列 SEQ ID NO 4(LeuTyrGluThrIIeLeuIleLeuLeuPheLeuAspValAspThrGlyXaaXaaXaa)，其中Xaa为任何氨基酸。在一些方面，Xaa为疏水性、亲水性氨基酸。在一些方面，肽包含与SEQ ID NO: I、SEQ ID NO :2 或 SEQ ID NO :3 为至少 65 %、70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 同 源的氨基酸序列。因此，在一些方面，肽包含氨基酸序列SEQ ID NO USEQ ID NO :2或SEQID NO :3的保守变异体。举例来说，保守变异体可包含在SEQ ID NO USEQ ID NO :2或SEQID NO :3中的一个或多个氨基酸残基处的保守氨基酸取代。因此，保守变异体可包含在SEQID NO U SEQ ID NO :2 或 SEQ ID NO :3 中的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 或16个氨基酸残基处的保守氨基酸取代。如本文关于指定氨基酸序列所用，“保守变异体”为第一氨基酸由至少一种生物化学性质与所述第一氨基酸的生物化学性质类似的另一氨基酸或氨基酸类似物替代的序列。此外，在本申请案整篇中，保守变异体和变异体可同义使用。为了进一步阐明，类似性质包括例如类似大小、电荷、亲水性、疏水性或氢键结能力。肽序列可出于许多原因，诸如增强溶解性、效能和延长化学半衰期而加以修饰。举例来说，SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3在其各自的C端分别具有碱性和酸性尾部，其包括每一种氨基酸序列的最终3个氨基酸(分别为LysLysArg和AspGluAsp)。这些尾部起增强溶解性的作用。在此方面，如由SEQ ID NO :4所反映，氨基酸的多种组合可用于增强稳定性或溶解性。举例来说，疏水性、亲水性、碱性、酸性、极性、非极性、芳香族和脂肪族氨基酸可易于组合及优化以增强肽稳定性。此外，可容易改变尾部长度以进一步优化肽稳定性。举例来说，氨基酸尾部长度的范围可为1-20个氨基酸、2-15个氨基酸、3-10个氨基酸或3-6个氨基酸。此外，这些组合可包括一系列极性氨基酸、一系列非极性氨基酸、一系列碱性氨基酸、一系列酸性氨基酸、一系列芳香族氨基酸、一系列脂肪族氨基酸。一方面，肽可被修饰以用于各种分析中。举例来说，肽可通过以下手段进行修饰放射标记法；添加荧光团；添加特定表位或标签，诸如谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签、myc标签、FLAG标签或6-His标签；与固体载体，诸如珠粒、微量滴定板的各孔或载片偶合；与允许比色检测的酶，诸如辣根过氧化酶(horseradish peroxidase)或碱性磷酸酶偶合,或用化学发光标签标记且用于各种分析，包括酶联结免疫吸附分析(ELISA)、荧光偏振(FP)分析、福斯特共振能量转移(F6rster resonance energy transfer, FRET)、生物发光共振能量转移(BRET)、表面增强的拉曼光谱(surface-enhanced Ramen spectroscopy, SERS)、电化学发光免疫分析和PCR增强的免疫分析中以进一步鉴别或探测特定分子相互作用(特普(Terpe K)，应用微生物生物技术(Applied Microbiol Biotechnol) 60 :523-533 (2003))；(阿马尔埃尔菲托里(Amal Elfaitouri)等人,临床和诊断实验室免疫学(Clinical andDiagnostic Laboratory Immunology) 12 :235-241 (2005));美国专利 5266498-使用表面增强的散射(SERS)信号对分析物进行配位体结合分析(Ligand binding assay for ananalyte using surface-enhanced scattering (SERS) signal);美国专利 5376556-表面增强的拉曼光谱免疫分析(Surface-enhanced Raman spectroscopy immunoassay),其以引用的方式并入本文中。所述分子相互作用包括(但不限于)蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-肽相互作用、蛋白质-肽-小分子相互作用或蛋白质-肽-核酸序列相互作用。此夕卜，以上提及的方法可用于在化学文库中筛选与病毒整合酶的至少一个域相互作用或与之结合的化合物或小分子。另一方面，这些方法可适合于高通量筛选。亦公开编码本文公开的氨基酸序列的核苷酸序列(也就是基因组DNA、cDNA、未经修饰的mRNA和转录后修饰的mRNA)。这将包括与特定氨基酸序列相关的所有保守和简并序列，也就是具有编码一种特定肽的序列的所有核苷酸序列以及编码氨基酸序列的公开的变 异体和衍生物的所有核苷酸，包括简并核苷酸。还公开包含编码本文公开的一种或一种以上肽的核酸的核酸载体，所述核酸可操作地连接于表达控制序列。还公开包含这些载体的细胞，其能够在培养时产生由所述核酸编码的蛋白质。2.内化序列公开的肽可进一步构成融合蛋白或另外具有其它N端、C端或中间氨基酸序列，例如连接子或标签。如本文所用的“连接子”为可用于连接或隔开2个不同多肽或多肽片段的氨基酸序列或插入物，其中连接子另外不有助于组合物的主要功能。本文提供的多肽可具有包含例如氨基酸GLS、ALS或LLA的氨基酸连接子。如本文所用的“标签”是指可用于检测或纯化所提供的多肽的不同氨基酸序列，其中标签另外不有助于组合物的主要功能。提供的多肽可另外已缺失不有助于多肽的主要活性的N端、C端或中间氨基酸。公开的组合物可与内化序列或蛋白质转导域连接以有效进入细胞中。新近研究已鉴别出可容易跨越质膜转运分子和小肽的数种细胞穿透肽，包括HIV病毒的TAT反式活化结构域(transactivation domain)、穿膜妝(antennapedia)和转运月太(transportan)(斯卡华(Schwarze)等人，1999;德罗斯(Derossi)等人，1996;袁(Yuan)等人,2002)。更近来，聚精氨酸已显示甚至更大的跨越质膜转运肽和蛋白质的效率，使其成为用于肽介导的转运的有吸引力的工具(富克斯(Fuchs)和雷尼斯(Raines)，2004)。九连精氨酸(Non-arginine, R9, SEQ ID NO :18)已描述为最有效聚精氨酸基蛋白质转导结构域之一,最大摄取显著大于TAT或穿膜肽。也已显示聚精氨酸基内化序列的肽介导的细胞毒性较小。R9介导的膜转运通过硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)蛋白聚糖结合和内吞包装加以促进。一旦内化，乙酰肝素即由乙酰肝素酶(heparanases)降解，从而释放漏入细胞质中的R9(德赛(Deshayes)等人，2005)。研究新近已显示聚精氨酸的衍生物可将全长p53蛋白传递至口腔癌细胞中，抑制其生长和转移，从而将聚精氨酸解释为一种强力细胞穿透肽(武信(Takenobu)等人,2002)。因此，提供的多肽可包含细胞内化转运体(transporter)或序列。细胞内化序列可为所属领域中已知或新近发现的任何内化序列或其保守变异体。细胞内化转运体和序列的非限制性实例包括聚精氨酸(例如R9)、穿膜肽序列、TAT、HIV-Tat,穿透肽(Penetratin)、Antp_3A(Antp 突变体)、抗菌肽 II (Buforin II)、转运肽、MAP (模式两性肽(model amphipathic peptide))、K_FGF、Ku70、|元病毒(Prion)、pVEC、Pep-l、SynBl、Pep_7、HN-1、BGSC (双-狐盐-亚精胺-胆固醇(Bis-Guanidinium-Spermidine-Cholesterol))和BGTC (双-狐盐-三氨乙基胺-胆固醇(Bis-Guanidinium-Tren-Cholesterol))。目前已知或以后鉴别出的任何其它内化序列皆可与本发明的肽组合。3.蛋白质变异体蛋白质变异体和衍生物为所属领域的技术人员充分了解且可涉及氨基酸序列修饰。举例来说，氨基酸序列修饰通常属于以下3类的一或多者取代、插入或缺失变异体。插入包括氨基和/或羧基端融合以及序列内插入单个或多个氨基酸残基。插入物通常将为比氨基或羧基端融合的插入物小的插入物，例如在I至4个残基的数量级上。免疫原性融合蛋白衍生物，诸如实例中描述的那些衍生物，是通过融合足够大以通过活体外交联或通过重组培养用编码融合物的DNA转型的细胞以赋予目标序列免疫原性的多肽来制备。缺失的特征在于从蛋白质序列去除一个或多个氨基酸残基。通常，至多约2至6个残基在蛋白质分子内的任一位点处缺失。这些变异体通常通过以下方式制备对编码蛋白质的DNA中的核苷酸进行位点特异性突变诱发，从而产生编码变异体的DNA，且此后在重组细胞培养物·中表达DNA。在具有已知序列的DNA中的预定位点处产生取代突变的技术为熟知的，所述技术为例如M13引物突变诱发和PCR突变诱发。氨基酸取代通常为单个残基取代，但可同时在许多不同位置处发生；插入通常将在约I至10个氨基酸残基的数量级上；且缺失的范围将为约I至30个残基。缺失或插入优选以邻近对形式进行，也就是缺失2个残基或插入2个残基。取代、缺失、插入或其任何组合可组合以获得最终构筑体。突变不能将序列置放在阅读框架外部且优选地将不会产生可产生二级mRNA结构的互补区。取代变异体为至少一个残基已经去除且不同残基插入在其位置中的那些变异体。功能或免疫系统特性的实质性变化是通过选择残基来产生，所述残基对维持以下的影响更显著不同(a)取代的区域中多肽骨架的结构，例如呈片构象或螺旋构象，(b)目标位点处分子的电荷或疏水性，或(C)侧链的体积。一般预期会使蛋白质性质产生最大变化的取代将为以下那些取代其中(a)例如丝氨酰基或苏氨酰基的亲水性残基被取代成例如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基的疏水性残基(或经所述残基取代)；(b)半胱氨酸或脯氨酸被取代成任何其它残基(或经所述残基取代)；(c)例如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基的具有正电性侧链的残基被取代成例如谷氨酰基或天冬氨酰基的负电性残基(或经所述残基取代)；或(d)例如苯丙氨酸的具有大体积侧链的残基被取代成不具有侧链的残基(或经所述残基取代)，在此情况下例如甘氨酸，(e)通过增加硫酸化和/或糖基化位点的数目。举例来说，用在生物方面和/或化学方面类似的一氨基酸残基替代另一氨基酸残基为所属领域的技术人员所知为一种保守取代。举例来说，保守取代将把一疏水性残基替代成另一疏水性残基，或一极性残基替代成另一极性残基。取代包括组合，诸如Gly、Ala ；Val、Ile、Leu ;Asp、Glu ;Asn、Gln ；Ser>Thr ；Lys>Arg ;和 Phe>Tyr0 每一个明确公开的序列的所述保守取代变化形式皆包括在本文提供的嵌合(mosaic)多肽内。可采用取代或缺失突变诱发来插入N-糖基化位点(Asn-X-Thr/Ser)或0_糖基化位点(Ser或Thr)。缺失半胱氨酸或其它不稳定残基亦可能合乎需要。缺失或取代潜在蛋白水解位点(例如Arg)是例如通过缺失I个碱性残基或用谷氨酰胺酰基或组氨酰基残基取代I个残基来实现。某些翻译后衍生是重组宿主细胞对表达的多肽的作用的结果。谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基常在翻译后脱去酰胺基成为相应谷氨酰基和天冬氨酰基残基。或者，这些残基在适度酸性条件下脱去酰胺基。其它翻译后修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化；丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基的磷酸化；赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的邻氨基的甲基化(克瑞顿(T. E. Creighton),蛋白质结构和分子性质(Proteins Structure andMolecular Properties),弗里曼公司(W. H Freeman & Co.),旧金山(San Francisco)第79-86页[1983]) ;N端胺的乙酰化和在一些情况下，C端羧基的酰胺化。
应了解一种定义本文中公开的蛋白质的变异体和衍生物的方式是通过利用与特定已知序列的同源性/一致性定义所述变异体和衍生物来实现。明确公开本文中公开的与所陈述序列具有至少70 %或75 %或80 %或85 %或90 %或95 %同源性的这些和其它蛋白质的变异体。所属领域的技术人员容易了解如何确定2个蛋白质的同源性。举例来说，可在比对2个序列之后计算同源性，以便同源性处于其最高水平。计算同源性的另一方式可用公开的算法进行。可用以下方法进行序列的最优比对以进行比较史密斯(Smith)和沃特曼(Waterman)高级应用数学(Adv. Appl. Math.) 2 :482(1981)的局部同源算法；尼德尔曼(Needleman)和文施(Wunsch),分子生物学杂志(J. MoL Biol.) 48 =443(1970)的同源比对算法；皮尔生(Pearson)和里皮曼(Lipman)，美国国家科学院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. )85 =2444(1988)的类似性搜索法；这些算法的计算机化实现(威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA，遗传学计算机组(Genetics Computer Group)，575 科学(Science)麦迪逊博士 (Dr. , Madison, WI));或通过检查。可用例如祖科(Zuker,M.)科学(Science) 244 :48-52,1989 ;雅格(Jaeger)等人美国国家科学院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 86 :7706-7710,1989 ;雅格(Jaeger)等人酶学方法(Methods Enzymol.) 183 :281-306,1989中公开的算法获得核酸的相同类型的同源性，该等文献至少关于与核酸比对相关的材料以引用的方式并入本文中。应了解保守突变和同源性的描述可以任何组合组合在一起，诸如与特定序列具有至少70%同源性的实施例，其中变异体为保守突变。当本说明书论述各种蛋白质和蛋白质序列时，应了解可编码那些蛋白质序列的核酸亦被公开。此将包括与特定蛋白质序列相关的所有简并序列，也就是具有编码一种特定蛋白质序列的序列的所有核酸以及编码蛋白质序列的公开的变异体和衍生物的所有核酸，包括简并核酸。因此，尽管每一个特定核酸序列可能为在本文中写出，但应了解每一个序列实际上皆通过公开的蛋白质序列而被公开和描述于本文中。应了解存在可并入公开的组合物中的众多氨基酸和肽类似物。举例来说，存在众多D氨基酸或具有不同功能取代基的氨基酸，所述氨基酸接着展示于表I和表2中。公开天然存在的肽的相对立体异构体以及肽类似物的立体异构体。这些氨基酸可容易通过以下手段并入多肽链中将所选氨基酸装入tRNA分子中并对利用例如琥珀密码子(ambercodon)的遗传构筑体进行工程改造来以位点特异性方式将类似氨基酸插入肽链中(托森(Thorson)等人，分子生物学方法(Methods in Molec. Biol.) 77 :43-73(1991);佐勒(Zoller),生物技术当前述评(Current Opinion in Biotechnology), 3 :348-354 (1992)；艾巴(Ibba),生物技术和遗传工程综述(Biotechnology & Genetic EnginerringReviews) 13 :197-216(1995);卡希尔(Cahill)等人，TIBS, 14(10) :400-403(1989);本勒(Benner)，TIB 技术(TIB Tech)，12 :158-163(1994);艾巴(Ibba)和亨莱克(Hennecke)，生物/技术(Bio/technology)，12 :678-682 (1994)，所有文献皆至少关于与氨基酸类似物相关的材料以引用的方式并入本文中)。可产生类似于肽但不通过天然肽键连接的分子。举例来说，氨基酸或氨基酸类似物的键联可包括CH2NH—、一CH2S—、一CH2—CH2—、一CH = CH—(顺式和反式)、--COCH2--、一CH (OH) CH2-和一CHH2S0—(这些和其它键联可见于以下中斯帕托拉(Spatola, A. F.),氨基酸、肽和蛋白质的化学和生物化学(Chemistry and Biochemistryof Amino Acids, Peptides, and Proteins),温斯坦(B. Weinstein)编，马克尔德科(Marcel Dekker),纽约(New York),第 267 页(1983);斯帕托拉(Spatola, A. F. ), VegaData(1983 年 3 月)，第 I 卷，第 3 期，妝骨架修饰(Peptide Backbone Modifications)(一般性综述(general review));莫里(Morley),制药科学趋势(Trends Pharm Sci)(1980)第463-468页；赫德森(Hudson，D.)等人，国际肽和蛋白质研究杂志(IN J Pept Prot Res) 14 :177-185 (1979) (-CH2NH-, CH2CH2-);斯帕托拉(Spatola)等人生命科学(Life Sci) 38 :1243-1249(1986) (-CH H2-S);汉(Hann)英国化学学会杂志柏尔金会报 I (J. Chem. Soc Perkin Trans. I) 307-314 (1982) (—CH—CH—，顺式和反式)；阿姆奎斯特(Almquist)等人医学化学杂志(J. Med. Chem.) 23 1392-1398 (1980) (-COCH2-)；詹宁斯_怀特(Jennings-White)等人四面体通讯(Tetrahedron Lett) 23 :2533 (1982)(—COCH2—);斯泽科(Szelke)等人欧洲申请案(European Appln), EP 45665CA(1982)97 :39405(1982) (-CH(OH) CH2-);霍兰迪(Holladay)等人四面体通讯(Tetrahedron.Lett) 24 :4401-4404(1983) (-C (OH) CH2-)；和胡比(Hruby)生命科学(Life Sci)31 189-199(1982) (--CH2--S--);每一篇皆以引用的方式并入本文中)。尤其优选的非肽键联为一ch2nh--。应了解肽类似物可在键结原子之间具有一个以上原子，所述肽类似物诸如b_丙氨酸、g_氨基丁酸等。氨基酸类似物和类似物和肽类似物常具有增强的或合乎需要的性质，诸如生产更经济、化学稳定性更大、药理学性质(半衰期、吸收、效能、功效等)增强、特异性改变(例如广谱生物活性)、抗原性降低和其它增强的或合乎需要的性质。D-氨基酸可用于产生更稳定的肽，因为D氨基酸不由肽酶等鉴别。用相同类型的D-氨基酸系统性取代共同序列的一个或多个氨基酸(例如D-赖氨酸替代L-赖氨酸)可用于产生更稳定的肽。半胱氨酸残基可用于将两种或两种以上肽环化或连接在一起。此可有益于将肽限制成特定构象。(里多(Rizo)和杰拉什(Gierasch)生物化学年评(Ann. Rev.Biochem.) 61 :387 (1992)，以引用的方式并入本文中)。B.使用方法I.抑制病毒整合酶本文中描述通过使病毒整合酶与本文公开的肽接触来降低或抑制病毒整合酶活性的方法。在一些方面，病毒整合酶为HIV整合酶。 不希望受理论束缚，在一些方面，肽可与诸如HIV IN的病毒整合酶结合，且抑制链转移复合物(STC)形成和随后病毒DNA整合。或者，肽允许STC形成但阻断随后病毒DNA整合。在一些方面，方法包含使HIV IN与本文公开的肽接触。举例来说，方法可包含使HIV IN 与包含 SEQ ID NO USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3 或 SEQ ID NO :4 的肽接触。在一些方面，肽为SEQ ID NO U SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3或SEQID NO :4的保守变异体。在一些方面，肽具有与 SEQ ID NO U SEQ ID NO :2 或 SEQ ID NO :3 或 SEQ ID NO :4 具有至少 65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%同源性的氨基酸序列。在一些方面，肽为包含靶向整合酶的第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的融合蛋 白。举例来说，第二氨基酸序列可包含内化序列或标签。肽可为内源性肽、分离的肽或合成产生的肽。举例来说，肽可直接化学合成。另一方面，编码肽的核酸序列可并入载体中并在例如细菌内表达且随后进行纯化。在一些方面，编码肽的核酸序列可易于修饰以产生将编码融合肽的核酸融合基因。此重组肽可包括抗原决定基或标签，诸如谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签、myc标签、FLAG标签或6-His标签以进一步有助于肽分离和纯化步骤。纯化或分离步骤可包括所属领域中已知的众多技术，诸如“盐析”肽；使用蔗糖梯度离心；或色谱分离步骤，包括尺寸排阻色谱、离子交换色谱、免疫亲和力色谱、HPLC或亲和力色谱以进一步分离肽。一方面，可在分离肽之后裂解或去除肽所具有的抗原决定基或标签。另一方面，在分离之后抗原决定基或标签不被裂解或去除。2.治疗 HIV还公开一种治疗或预防个体HIV的方法，其包含向所述个体投予本文公开的肽。举例来说，方法可包含向个体投予包含SEQ ID NO USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3或SEQ IDNO :4的肽。在一些方面，方法包含向个体投予SEQ ID NO USEQ ID NO :2、SEQ ID N0:3或SEQ ID NO :4的保守变异体。在一些方面，方法可包含向个体投予与SEQ ID NO USEQ IDNO :2 或 SEQ ID NO :3 或 SEQ ID NO :4 具有至少 65%、70%、71 %、72%、73%、74%、75%、76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 同源性的氨基酸序列。在一些方面，个体处于HIV感染的风险中。在一些方面,个体患有HIV。在一些方面，肽可被修饰以增强向个体、组织或细胞的投药。在此方面，肽可与聚合材料组合或复合以增强向个体、组织或细胞的投药。另一方面，肽可共价连接于或进行遗传工程改造以具有细胞内化序列或蛋白质转导结构域(包括HIV-1TAT、HSV VP22或Antp)来进一步增强向个体、组织或细胞的投药。这些组合物可以胶囊形式经口投予；静脉内、皮下或肌肉内进行疫苗投予；以静脉滴注投予；或以经皮、表面乳膏形式投予。肽、小分子或其任何组合可与之复合的聚合材料的实例包括两亲聚合物、亲水性聚合物、疏水性聚合物、纳米粒子、胶束(micelIe)、免疫结合物、树枝状聚合物(dendrimer)和脂质体。不希望受理论束缚，肽、小分子或其任何组合可使用在非湿润模板中进行的粒子模制(Particle Replication In Non-wettingTemplate, PRIN)与一种上文提及的聚合物结合或复合。PRIN允许阐明大小、形状、位点特异性表面化学、可调粒子基质组成和可调模数加以控制的有机粒子经历内吞的机制。由“校准质量”粒子获得对所用内吞路径的认识应产生不仅为增强特定细胞内化，而且也为对粒子的细胞内位置进行操作并使细胞毒性效应最小所需的关键信息。一旦确定内化机制，接着便有可能使用这些研究结果来更好工程改造特定物品(cargo)的细胞内释放。上述复合物可使用所属领域中已知的技术向个体投予。举例来说，可用复合物制备医药组合物。应了解在指定情况下，复合物的实际优选量将根据所用特定化合物、调配的特定组合物、用药模式和特定场所及所治疗的个体而变化。用于既定宿主的剂量可使用常规考虑因素，例如诸如借助于适当常规药理学方案通过惯用比较本发明化合物与已知药剂的差异性活性来确定。所属领域中熟练确定医药化合物的剂量的医师和配方设计师对于根据标准推荐(医师桌上手册(Physicians Desk Reference),巴哈特出版(BarnhartPublishing) (1999))确定剂量将不存在问题。本文所述的医药组合物可用生物系统或实体可耐受的任何赋形剂调配。所述赋形剂的实例包括(但不限于)水、盐水、林格氏溶液(Ringer' s solution)、右旋糖溶解、亨克氏溶液(Hank' s solution)和其它生理平衡盐水溶液。也可使用非水性媒剂，诸如不挥发油、植物油(诸如橄榄体和芝麻油)、三酸甘油酯、丙二醇、聚乙二醇和可注射有机酯，诸如油酸乙酯。其它适用调配物包括含有粘性增强剂，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇·(sorbitol)或葡聚糖(dextran)的悬浮液。赋形剂也可含有少量添加剂，诸如增强等张性和化学稳定性的物质。缓冲剂的实例包括磷酸盐缓冲剂、碳酸氢盐缓冲剂和Tris缓冲剂，而防腐剂的实例包括硫柳萊(thimerosol)、甲酹(cresol)、福马林(formalin)和苯甲醇。医药载剂为所属领域的技术人员所知。这些最通常将为用于向人类投予的标准载齐IJ，包括溶液，诸如无菌水、盐水和在生理PH值下的缓冲溶液。目的用于医药传递的分子可调配于医药组合物中。除所选分子之外，医药组合物也可包括载剂、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等。视需要局部或全身治疗、且视欲治疗的区域而定，医药组合物可以许多方式投予。投药可为表面(包括经眼和鼻内)投药，或投药可为静脉内或腹膜内投药。用于投药的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性载剂的实例包括水、醇性/水性溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。如果为附带使用公开的组合物和方法所需，则不经肠媒剂包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸盐林格氏液(lactated Ringer' s)或不挥发油；如果为附带使用公开的组合物和方法所需，则静脉内媒剂包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏右旋糖的那些补充齐IJ)等。也可存在防腐剂和其它添加剂，诸如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。用于表面投药的调配物可包括软膏剂、洗剂、乳膏、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和散剂。常规医药载剂、水性基质、粉末基质或油性基质、增稠剂等可为必需的或合乎需要的。一方面，可向处于HIV感染风险中的个体投予包括SEQ ID NO U SEQ ID NO :2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4、其任何变异体的肽、小分子或其任何组合。另一方面，可向患有HIV 的个体投予包括 SEQ ID NO USEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4、其任何变异体的肽、小分子或其任何组合。在向个体投药后，包括SEQ ID NO USEQ ID N0:2、SEQ IDNO 3, SEQ ID NO :4、其任何变异体的肽、小分子或其任何组合与HIV IN结合且降低、抑制或依序降低并接着抑制HIV IN活性和病毒DNA整合。公开的化合物和组合物可以任何适合方式投予。可基于例如需要局部或全身性治疗和欲治疗的区域来选择投药方式。举例来说，组合物可经口、不经肠(诸如静脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射)、通过吸入、离体、表面(包括经皮、经眼、经阴道、经直肠、鼻内)等投予。如本文所用，“表面鼻内投药”意味经过鼻和鼻孔区域的一或两者将组合物传递入鼻和鼻孔中，且可包含利用喷雾机制或小滴机制或通过使核酸或载体气雾化进行的传递。用吸入器投予组合物可通过利用喷雾或小滴机制进行传递而经过鼻或口。也可通过培育直接向呼吸系统的任何区域(例如肺)进行传递。如果使用不经肠投予组合物，则其通常以注射为特征。可注射剂可以常规形式制备成液体溶液或悬浮液、适于在注射之前将悬浮物溶解于液体中的固体形式或乳液。一种更近来修正的用于不经肠投药的方法涉及使用缓慢释放或持续释放系统以使恒定剂量得 以维持。参见例如美国专利第3，610，795号，其以引用的方式并入本文中。所需组合物的精确量可在个体之间变化，视个体的物种、年龄、重量和概况；所治疗的过敏性病症的严重性、所用的特定核酸或载体、其投药模式等而定。因此，不可能规定每一组合物的精确量。然而，鉴于本文中的教示，所属领域的技术人员仅使用常规实验即可确定适当量。因此，用于投予组合物的有效剂量和时程可凭经验确定，且作出所述确定在所属领域中的技能内。用于投予组合物的剂量范围为足够大以产生影响病症的症状的所要效果的那些剂量范围。剂量不应如此之大以至产生不良副作用，诸如不合需要的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量可随年龄、病状、性别和患者疾病程度、投药途径或方案中是否包括其它药物而变化，且可由所属领域的技术人员确定。剂量可变化，且可每天以一次或多次剂量投药，持续一或数天来投予。关于针对既定种类的医药产品的适当剂量的指导可见于文献中。给药视欲治疗病状的严重性和反应性而定，但通常将为每天一剂或多剂，疗程持续数天至数月或直至所属领域的技术人员决定应停止传递。一般技术人员可容易确定最佳剂量、给药方法和重复率。举例来说，单独使用的典型每天剂量可能在每天每千克体重I U g至多达IOOmg或IOOmg以上的范围内，视以上提及的因素而定。一方面，为了查明用于向细胞、组织或个体投予肽、小分子或其任何组合的最优浓度，可产生剂量-反应曲线且可测量半数最大抑制浓度(IC5tl)和半数致死剂量(LD5tl)。可基于这些测量结果进一步优化向细胞、组织或个体投予肽、小分子或其任何组合的浓度。在此方面,肽、小分子或其任何组合可包括的治疗浓度包括I ii M、2 ii M、3 ii M、4ii M、5 ii M、6 ii M、7 ii M、8 ii M、9 ii M、10 ii M、11 ii M、12 ii M、13 ii M、14 ii M、15 ii M、16 ii M、17 ii M、18 ii M、19 ii M、20iiM、21iiM、22iiM、23iiM、24iiM、25iiM、26iiM、27iiM、28iiM、29iiM、30iiM、31iiM、32iiM、33iiM、34iiM、35iiM、36iiM、37iiM、38iiM、39iiM、40iiM、41iiM、42iiM、43iiM、44 u M、45 u M、46 u M、47 u M、48 u M、49nM、50 u M>51 u M、52 u M>53 u M、54 u M>55 u M、56 u M、57iiM、58iiM、59iiM、60iiM、61iiM、62iiM、63iiM、64iiM、65iiM、66iiM、67iiM、68iiM、69 ii M、70 ii M、71 ii M、72 ii M、73 u M.74 u M、75 u M.76 u M、77 u M.78 u M、78 u M.79 u M、80iiM、81iiM、82iiM、83iiM、84iiM、85iiM、86iiM、87iiM、88iiM、89iiM、90iiM、91iiM、92iiM、93iiM、94iiM、95 iiM、96iiM、97iiM、98iiM、99iiM、and 100 y M。同样在此方面，治疗浓度的范围可为I至1000 ilM、50至800 i! M、100至600 ilM、200至400 i! M或其任何组合。另一方面，肽、小分子或其任何组合可包括在亚微摩尔范围内的治疗浓度，所述亚微摩尔范围包括 I 至 1000nM、50 至 900nM、100 至 850nM、150 至 800nM、200 至 750nM、250 至 700nM、300 至 650nM、350 至 600nM、400 至 550nM、450 至 500nM 或其任何组合。本文公开的抑制HIV IN的组合物可向处于HIV风险中或已新近诊断有HIV的患者或个体预防性投予。3.筛选病毒整合酶抑制剂本文还提供一种鉴别可降低HIV整合酶活性的药剂的方法。在一些方面，此方法包含鉴别抑制HIV IN的药剂。在一些方面，此方法可用于鉴别可用于治疗HIV的药剂。因此，本文还提供一种鉴别抑制HIV IN的药剂的方法，其包含在允许HIV IN与本 文公开的肽结合的条件下提供包含HIV IN的至少一个结构域的样品和所述肽，使所述样品与候选药剂接触，检测HIV IN/肽结合的水平，将所述结合水平与对照进行比较，从而相较于所述对照，HIV IN/肽结合的减小鉴别出可用于治疗患者的药剂。在一些方面，HIV IN的至少一个结构域包含N端或C端。在一些方面，HIV IN的至少一个结构域包含介于48-210个氨基酸之间的核心结构域。还公开一种鉴别抑制HIVIN的药剂的方法，其包含使HIV IN的至少一个结构域与候选药剂接触并测量整合酶活性。在一些方面，方法包含将HIV整合酶活性与阳性和阴性对照进行比较。还公开一种鉴别降低病毒整合酶活性的候选药剂的方法，其包含使整合酶的至少一个结构域与本文公开的肽在允许所述肽与所述整合酶结合的条件下接触，使所述整合酶与候选药剂接触，及确定所述候选药剂是否替代了所述肽。因此，还公开一种鉴别降低HIV整合酶活性的候选药剂的方法，其包含使HIV整合酶的至少一个结构域与与SEQ ID NO USEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4具有至少90%序列一致性的肽在允许所述肽与所述整合酶结合的条件下接触，使所述HIV整合酶与候选药剂接触，及确定所述候选药剂是否替代了所述肽，其中所述肽的替代指示所述候选药剂会降低HIV整合酶活性。在一些方面，方法进一步包含使包含整合酶的样品与替代肽的候选药剂接触及测量整合酶活性以证实所述候选药剂能够抑制所述整合酶。在一些方面，使用DNA整合分析、南方印迹(southern blotting)、西方印迹(western blotting)、高通量筛选分析或其任何组合测量整合酶活性。可使用不干扰蛋白质结合的常规方法，诸如免疫检测方法来检测本文公开的肽与诸如HIV IN的整合酶的结合。方法可为基于细胞的分析或无细胞分析。各种适用免疫检测方法的步骤已描述于科学文献中，诸如马吉奥(Maggio)等人，酶免疫分析(Enzyme-Immunoassay), (1987)和中村(Nakamura)等人，酶免疫分析异质和均质系统(Enzyme Immunoassays Heterogeneous and Homogeneous Systems),实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)，第 I 卷免疫化学(Immunochemistry),27. 1-27. 20(1986)，每一篇皆以全文引用的方式并入本文中且明确针对其关于免疫检测方法的教示。免疫分析在其最直截了当意义上为涉及抗体与抗原之间结合的结合分析。免疫分析的许多类型和形式为已知的且所有皆适于检测公开的生物标记。免疫分析的实例为酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、放射免疫沉淀分析(RIPA)、免疫珠粒捕捉分析、西方印迹、斑点印迹(dot blotting)、凝胶迁移分析(gel_shift assay)、流式细胞术(Flow cytometry)、蛋白质阵列(protein array)、多路珠粒阵列(multiplexedbead array)、磁性捕捉、活体内成像、荧光共振能量传递(FRET)和光漂白后荧光恢复/定位(FRAP/FLAP)。在一些方面，可使用酵母双杂交系统或类似细胞基报告分析来鉴别候选药剂。在这些方面，酵母中的转录活化可指示肽正结合HIV整合酶。举例来说，一方面，HIV整合酶的至少一个结构域包括与DNA结合域融合的诱饵(bait)。所述结构域可包括HIV IN的N端、中心核或C端。举例来说，HIV IN的C端可与GAL4DNA结合域融合。在此方面，本文公开的结合HIV IN的肽可用作与活化域融合的猎物(prey)。举例 来说，肽可与GAL4活化域融合。在一些方面，包含氨基酸序列SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQID NO 4或其任何组合的肽可与GAL4活化域融合。在一些方面，如果诱饵与猎物相互作用，则可转录并随后翻译报告基因，诸如HIS3、URA3、ADE3、Zsgreen, GFP、^ -半乳糖苷酶(beta-galactosidase)或突光素酶(Iuciferase)。视报告基因表达而定,可进一步分析诱饵与猎物相互作用的强度。所属领域的技术人员可容易修改此分析以虑及包含肽与DNA结合域融合的诱饵且虑及包含HIV整合酶的至少一个域与活化域融合的猎物。所属领域的技术人员将容易了解其它构筑体、结合域、活化域，且包括绿色荧光蛋白的报告基因可容易被取代成以上所列的那些报告基因。在一些方面，候选药剂替代来自HIV IN的肽。因此，方法可包含检测肽与整合酶的结合。在一些方面，方法包含检测由整合酶被替代的肽。在此方面，当使用上述酵母双杂交筛选时，如果使用 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3 或 SEQ ID NO :4，则将观察到报告基因表达。为了筛选化学文库中的HIV IN抑制剂，可分析化合物与HIV IN的一部分或结构域的实际结合。一方面，来自化学文库的小分子可添加到以上提及的酵母双杂交系统中。不希望受理论束缚，如果化合物对病毒整合酶的亲和力等于或大于肽对病毒整合酶的亲和力，则肽将被替代。在被替代后，报告基因的表达将减小或完全被抑制。此结果将指示化合物与病毒整合酶结合，且其将提供化合物对病毒整合酶的结合亲和力的定性和定量量度。另一方面，此分析可变化以虑及竞争类型分析，其中以特定量同时或至少在紧密邻近的时间内添加化合物或小分子和猎物。视对猎物的亲和力而定，化合物/小分子或猎物将胜过另一物且化合物/小分子对病毒整合酶或病毒整合酶结构域的亲和力可以定性方式、定量方式或其任何组合加以测定。另一方面，这些酵母双杂交系统可适合于高通量筛选。举例来说，细胞可在96孔形式1530或高达16640孔形式中生长且用板充填器(plate filler)分配。使用此形式，每2 周可进行至少 5，000、10，000,20, 000,30, 000,40, 000,50, 000,60, 000,70, 000,80, 000、90，000或100，000个分析。一方面，使用酵母筛选自动操作机且实验室信息管理系统(LIMS)跟踪样品并处理数据。LIMS在oracle数据库的构架内合併条码(bar coding)、过程记录和质量控制。可如上所述测试一定范围的化合物和肽浓度。在此方面，将根据肽或小分子与HIV整合酶的相互作用和最优浓度来选择真阳性物。真阳性物可以约1%的比率回收且出现对酵母生长具有较大负面效应的频率较低(< 10%)。阳性物(定义为信号>平均信号以下2-3SD)可再筛选，且对于活性子组，可进行剂量/反应研究。可进一步在哺乳动物生物分析中评估阳性物，且可产生偏倚文库(biased library)以鉴别对HIV整合酶的效应更强、更具选择性的化合物或小分子。为了进一步分析病毒整合酶的酶促降低或抑制，可分析病毒DNA整合和STC形成及累积。一方面，DNA整合分析、南方印迹、西方印迹、经修改以测量整合酶活性的高通量筛选分析(约翰(John)等人.用于HIV-I整合酶活性的高通量筛选分析的建立和应用(Development and Application of a High-Throughput Screening Assayfor HIV-IIntegrase Enzyme Activities).生物分子筛选杂志(J. of BiomolecularScreening). (2005) 10(6) :606_614，据此以全文引用的方式并入本文中)或其任何组合可用于分析病毒整合酶活性的降低或抑制。这些分析可另外用于分析链转移复合物(STC)形成和可能的累积。举例来说，如科里杰(Craigie)等人加工病毒DNA端会引导HIV-I整合反应成为协同整合(Processing of viral DNA ends channels the HIV-Iintegrationreaction to concerted integration).生物化学杂志(J. Biol. Chem.) (2005) 280 (32) 29334-9和科里杰(Craigie)等人逆转录病毒DNA整合反应路径和关键中间物(Retroviral DNA integration reaction pathway and critical intermediates).欧洲分子生物学杂志(EMB0 J.) (2006)25(6) :1295-304 (所述参考文献据此以全文引用的方式并入本文中)内所述的DNA整合分析可用于确定肽、小分子或其任何组合是否会抑制病毒DNA 整合。另一方面，接触或投予包括 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ IDNO 4或其任何变异体的肽、小分子或其任何组合的细胞、组织或个体的病毒DNA整合可与阳性和阴性对照进行比较以提供病毒整合酶活性的降低或抑制的定性和定量量度。a. HIV整合酶突变体阻断HIV IN的酶促功能的药物可阻止病毒整合入基因组中。由默克(Merck)制造的雷特格韦，也称为艾生特或MK0518已由FDA核准用于对其它药物具有抗性的患者中。其它IN抑制剂包括二酮类似物(DKA)S-1360、L-870、810、埃替拉韦(Elvitegravir)(GS-9137)和萘啶酮GSK364735。尽管雷特格韦显示显著益处，但编码HIV IN的基因中的突变会产生对药物具有抗性的病毒突变体。在一些研究中，归因于对MK0518和GS-9137的抗性的失败率已分别达到25%和40%，针对抑制剂的整合酶突变包括Q148R、N155H、L74M、E92Q以及其它氨基酸。导致对IN抑制剂的抗性的一些氨基酸变化已显示直接与IN抑制剂5CITEP相互作用。因此，在公开的筛选方法的一些方面，HIV整合酶的至少一个结构域包含药物抗性突变。举例来说，药物抗性突变可为 T66I、T66A、T66K、E92Q、F121Y、E138A、E138K、G140A、G140S、Y143R、Y143C、Y143H、S147G、Q148H、Q148R、Q148K、S153Y、N155H、N155S、R263K、L74M、E92Q、T97A、V151I、E157Q、G163R、I203M、S230R、S230N、H51Y、Q95K、H114Y、P145S、Q146P、T125K、A128T、Q146K、N155S、K160D、V72I、A154I、V165I 和 V201I (http://hivdb. Stanford,edu/CRi-bin/INIResiNote. CRi)或其任何组合。因此，本文还公开一种鉴别除野生型HIV IN之外或替代野生型HIV IN,(也)抑制HIV IN突变体的候选药剂的方法。在一些方面，方法包含首先鉴别出结合突变HIV IN的肽。一种鉴别结合突变HIV IN的肽的方式在于制备并检查作为结合野生型HIV IN的肽SEQ ID NO USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4或其任何变异体的突变体的肽(在本文中称为“突变结合肽”)。举例来说，突变结合肽与SEQ ID NO=USEQ ID NO :3、SEQ IDNO 4 或其任何变异体具有至少 65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同源性。因此，可使用随机突变诱发、简并寡核苷酸、DNA改组(DNA shuffling)、定点突变诱发或所属领域中可用的适于产生含有在所要序列一致性内的肽的肽文库的任何其它方法来产生突变结合肽。因此，还公开一种鉴别降低病毒整合酶活性的候选药剂的方法，其包含使突变整合酶的至少一个结构域与本文公开的突变体结合肽在允许所述肽与所述突变整合酶结合的条件下接触，使所述突变整合酶与候选药剂接触，确定所述候选药剂是否替代了所述突变体结合肽。在一些方面，突变体结合肽可结合一种或一种以上突变HIV IN或野生型HIVIN。因此，方法也可包含测试任何药剂与突变IN结合以抑制野生型HIV IN和/或其它突变HIVIN的能力。已广泛使用等位基因特异性抑制作为鉴别和分析涉及RNA、DNA和蛋白质的物理相互作用的遗传工具(哈特曼(Hartman)和罗斯(Roth), 17 :1_105遗传学进展(Adv.Genetics) (1973);纳尔逊(Nelson)和绍尔(Sauer)，细胞(Cell) 42 :549-558 (1985);贝 茨(Betz)，分子生物学杂志(J. Mol. Biol.) 195 =495-504(1987);亚当斯(Adams)等人，遗传学(Genetics) 121 :675-683(1989);帕克(Parker)，酶学方法(Methods Enzymol). 180 510-517 (1989)；莫汀(Mortin)，美国国家科学院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 87 4864-4868 (1990);厄泰尔-布赫海特(Oertel-Buchheit)等人,分子生物学杂志(J Mol.Biol.)，255 =609-620 (1992);菲兹克(Phizicky)和菲尔兹(Fields)，微生物学评论(Microbiol. Rev.) 59 :94-123 (1995))。等位基因特异性抑制的发生机制广泛支持的观点借助于“锁定和钥匙(lock-and-key) ”模式，其中恢复原始接触。在RNA-RNA相互作用的情况下，相互作用可由会产生碱基配对代偿性变化的突变恢复。等位基因特异性抑制常视为蛋白质-蛋白质相互作用的证据；反之，非等位基因特异性抑制通常视为旁路抑制的证据。在本发明中应用等位基因特异性抑制的原理来检测整合酶相互作用。因此，还公开一种鉴别抑制突变HIV整合酶的活性的候选药剂的酵母遗传方法。如果突变整合酶使野生型 IN 结合肽(诸如肽 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 或其任何变异体)与所述突变整合酶的相互作用降低，则可选择会恢复突变整合酶的结合/抑制的突变体抑制肽。野生型整合酶可与DNA结合域连接且肽与活化域连接，或相反进行连接。当与可选择报告基因(例如LEU2、URA3、HIS3、ADE2)的操纵子结合的DB整合酶与连接于活化域的肽相互作用时，报告基因被活化，从而允许在缺乏由所述报告基因编码的氨基酸的培养基上生长。在HIS3的情况下，严格性可通过添加3-AT增强。为了选择天然突变，可通过在缺乏组氨酸的添加有3-AT(3-氨基三唑)的合成板上涂铺菌株来筛选数百万酵母。来自生长在选择培养基上的群落的质粒可加以分离并再转型入基础菌株中以检查质粒连接。通过质粒连接分析的无性系将被测序以鉴别编码肽的DNA区域中的使与突变整合酶的相互作用重现的突变。可用野生型整合酶以及其它突变整合酶等位基因测试肽突变体。所有不同种类的突变皆有可能，包括亲和力一般会增加的等位基因特异性突变或与整合酶的不同区域结合的突变体。或者，编码肽的区域也可使用简并寡聚物、引物或裂解连接(随机DNA寡聚物)来突变。一旦发现与突变整合酶结合的肽，其即可用于筛选会替代如上所述的肽的化合物。
可使用酵母遗传方法鉴别对肽SEQ ID NO USEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、SEQ IDNO :4或其任何变异体具有抗性的整合酶突变体。为了筛选整合酶中导致与肽SEQ ID NO:USEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4或其任何变异体的结合损失的突变体，可将含有DNA结合(DB)肽和驱动URA3报告基因的活化域(AC)-整合酶的菌株涂铺于5-氟辛烷酸(5-F0A)板上。在生长培养基中存在5-氟辛烷酸(5-F0A)的情况下，表达乳清酸核苷(orotidine)5-磷酸脱羧酶的细胞将由于5-F0A转化成5-氟尿嘧啶(一种有毒化合物)而死亡。(博克(Boeke JD)等人，酶学方法(Methods Enzymol.) 154 :164-75 (1987))。5-F0A为一种极其适用于在Ura+细胞群体中选择Ura-细胞的试剂。在需要丧失URA3+的转型和重组研究中，所述选择为有效的。其它方面包括通过使用阻断肽与整合酶之间相互作用的药物对以上公开的主题施加变化。酵母中的整合酶活性分析在真核细胞中表达为单一逆转录病毒蛋白的HIV-IIN足以催化含有2个病毒LTR的DNA完全整合入核基因组中。b.其它逆转录病毒·存在跨越进化物种的蛋白质结合的众多实例。酵母与脊椎动物丝束蛋白(fimbrin)在一级结构与生化活性两者方面均类似。人类T和L丝束蛋白可弥补酵母酿酒酵母(S. cerevisiae)中的sac6空白缺陷(null defect)(亚当斯(Adams)等人，分子和细胞生物学(Molecular and Cellular Biology) 15 (I) :69-75 (1995))。中心区域(位于残基50与212之间)含有3个不变酸性残基(Asp64、Aspll6和Glul52)的三合体，通常称为D，D-35-E结构域，其在逆转录病毒IN蛋白以及各种真核和原核转座酶中为进化高度保守的(库科斯基(Kulkosky)等人,分子细胞生物学(Molecular Cell Biology) 12 2331-2338(1992);道克(Doak)等人，美国国家科学院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci.) 91 942-946(1994);赖斯(Rice)和水内(Mizuuchi)，细胞(Cell) 82 :209-220 (1995))。逆转录病毒为在宿主细胞中通过逆转录酶复制以由其RNA基因组产生DNA的RNA病毒。DNA接着通过整合酶并入宿主基因组中。此后，病毒作为宿主细胞DNA的一部分进行复制。逆转录病毒为属于逆转录病毒科(Retroviridae)的包膜病毒。病毒分类为第VI组。2个属亚科包括正逆转录病毒亚科(Orthoretrovirinae)和Supumaretrovirinae。亚科包括a逆转录病毒(Alpharetrovirus)(禽类肉瘤白血病病毒(Avian SarcomaLeukosis Virus)、劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))、P 逆转录病毒(Betaretovirus)(小鼠乳腺瘤病毒(Mouse mammary tumor virus))、y 逆转录病毒(Gammaretrovirus)(鼠类白血病病毒(Murine leukemia virus)、艾贝尔森鼠白血病病毒(Abelson murineleukemia virus)、猫白血病病毒(Feline leukemia virus)、异嗜性鼠类白血病病毒相关病毒(Xenotropic murine leukemia virus-related virus)) > 6 逆转录病毒(Deltaretrovirus)(人类嗜 T-淋巴细胞病毒(Human T-Iymphotropic virus) (HTLV-1、HTLV-2)牛白血病病毒)、e逆转录病毒(Epsilonretrovirus)(大眼梭鲈表皮增生病毒(Walleye epidermal hyperplasia virus))和慢病毒(Lentivirus)(人类免疫缺乏病毒(Human immunodeficiency virus)、猴免疫缺乏病毒(Simian immunodeficiencyvirus)、猫白血病病毒、美洲狮慢病毒(Puma lentivirus)、EIA、牛免疫缺乏病毒(Bovineimmunodeficiency virus)、山羊关节炎脑炎病毒(Caprine arthritis encephalitisvirus)、维斯纳梅迪病毒(Visna/maedi virus)) 第二亚科包括泡沫逆转录病毒亚科(Spumaretrovirinae)(猴泡沫病毒(Simian foamy virus)和 HFV)。因此，本发明的其它实施例包括使用肽SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO :4或其任何变异体作为选择其它逆转录病毒整合酶的抑制剂的探针。举例来说，由任何这些逆转录病毒编码的病毒整合酶可克隆入双杂交系统中且测试与肽SEQ IDNO USEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4或其任何变异体的相互作用。当检测相互作用时，可直接选择与如上所述的其它逆转录病毒整合酶结合的药剂。可如所描述用突变HIV整合酶来突变肽以选择与其它逆转录病毒整合酶的相互作用。三维结构信息也可用来设计与其它进化保守整合酶结合的肽。c.候诜药剂 一般而言，可根据所属领域中已知的方法从天然产物或合成(或半合成)提取物的较大文库或化学文库鉴别候选药剂。药物发现和开发领域的技术人员应了解测试提取物或化合物的精确来源对于本发明的筛选程序并不至关重要。因此，可使用本文所述的例示性方法筛选实际上任何数目的化学提取物或化合物。所述提取物或化合物的实例包括(但不限于)植物基、真菌基、原核生物基或动物基提取物、发酵液和合成化合物、以及现有化合物的改性形式。众多方法也可用于随机或定向合成(例如半合成或全合成)任何数目的化合物，包括(但不限于)糖基、脂质基、肽基、多肽基和核酸基化合物。合成化合物文库可例如从布兰登联合公司(Brandon Associates)(新罕布什尔州梅里马克(Merrimack,NH))和阿尔德里奇化学品公司(Aldrich Chemical)(威斯康星州密尔沃基(Milwaukee,WI))购得。或者，呈细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物的文库可从许多来源，包括百奥替克斯(Biotics)(英国苏赛克斯(Sussex, UK))、新诺瓦(Xenova)(英国斯劳(Slough,UK))、哈博布郎克海洋研究所(Harbor Branch Oceangraphics Institute)(佛罗里达州匹尔斯堡(Ft. Pierce, Fla.))和美国马尔制药公司(PharmaMar，U. S. A.)(马萨诸塞州剑桥(Cambridge,Mass.))购得。此外，如果需要，根据所属领域中已知的方法，例如利用标准提取和分级(fractionation)方法来产生天然和合成产生的文库。此外，如果需要，容易使用标准化学、物理或生物化学方法对任何文库或化合物进行改性。此外，药物发现和开发领域的技术人员容易了解只要有可能就应采用去重复化法(例如分类去重复、生物去重复和化学去重复或其任何组合)或消除已知对HIV IN的活性有影响的物质的重复物(replicate/repeat)的方法。当发现粗提取物具有所要活性时，阳性先导提取物的进一步分级为分离负责观察到的效应的化学组分所必需。因此，提取、分级和纯化过程的目的为仔细表征和鉴别粗提取物内具有刺激或抑制HIV IN的活性的化学实体。本文所述的用于检测化合物的混合物中的活性的相同分析可用于纯化活性组分和测试其衍生物。所述异质提取物的分级和纯化的方法在所属领域中为已知的。如果需要，根据所属领域中已知的方法对被证明为适用于治疗的药剂的化合物进行化学改性。鉴别为具有治疗价值的化合物可随后使用疾病或病状(诸如本文公开的那些疾病或病状)的动物模型进行分析。候选药剂包括众多化学种类，但最常为有机分子，例如分子量大于100且小于约2，500道尔顿(dalton)的小型有机化合物。候选药剂包含与蛋白质进行结构相互作用，特定言之氢键结所必需的官能团，且通常包括至少胺、羰基、羟基或羧基，例如至少2个官能化学基团。候选药剂常包含经一个或多个上述官能团取代的环状碳或杂环结构和/或芳香族或芳香族聚合物结构。候选药剂也见于生物分子，包括肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶，其衍生物、结构类似物或组合中。在另一实施例中，候选药剂为肽。在一些实施例中，候选药剂为蛋白质。在一些方面，候选药剂为天然存在的蛋白质或天然存在的蛋白质的片段。因此，举例来说，可使用含有蛋白质的细胞提取物或蛋白细胞提取物的随机或定向消化物。以此方式，可制备原核和真核蛋白的文库以使用本文方法进行筛选。文库可为细菌、真菌、病毒和脊椎动物蛋白质和人类蛋白质。C.制备组合物的方法除非另外明确指示，否则可使用所属领域的技术人员已知的用于特定试剂或化合物的任何方法来制备本文公开的组合物和为执行公开的方法所必需的组合物。 I.核酸合成举例来说，诸如欲用作引物的寡核苷酸的核酸可使用标准化学合成法加以制备或可使用酶促法或任何其它已知方法加以产生。所述方法可在以下范围内标准酶促消化，随后为核苷酸片段分离(参见例如山姆布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆实验室手册(Molecular Cloning A Laboratory Manual),第2版(纽约州冷泉港冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.),1989)第 5、6 章)至仅有合成法，例如通过使用密立根或贝克曼系统I加强型(Milligen or Beckman SystemlPlus)DNA合成仪(例如密立根-百思勤(Milligen-Biosearch) 8700型自动合成仪,马萨诸塞州伯林顿(Burlington,MA)或ABI 380B型)的氰乙基亚磷酰胺法。适用于制备寡核苷酸的合成法也由生田(Ikuta)等人,生物化学年评(Ann. Rev. Biochem). 53 :323-356 (1984)(磷酸三酯和亚磷酸三酯法)和那然(Narang)等人，酶学方法(Methods EnzymoL), 65 610-620(1980)(磷酸三酯法)描述。可使用已知方法，诸如由尼耳森(Nielsen)等人，生物共轭化学(Bioconjug. Chem). 5 :3-7(1994)描述的那些方法来制备蛋白质核酸分子。2.肽合成一种产生公开的蛋白质，诸如SEQ ID NO :1至4的方法为利用蛋白质化学技术将两个或两个以上肽或多肽连接在一起。举例来说，可使用当前可用的实验室设备，利用Fmoc (9-芴基甲氧基羰基)或Boc (叔丁氧基羰基)化学来化学合成肽或多肽。(加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司(Applied Biosystems, Inc. , Foster City, CA))。所属领域的技术人员可容易了解对应于公开的蛋白质的肽或多肽例如可通过标准化学反应加以合成。举例来说，肽或多肽可被合成且不从其合成树脂分解，而肽或蛋白质的其它片段可被合成且随后从树脂分解，从而暴露在另一片段上功能被阻断的端基。通过肽缩合反应，这2个片段可通过肽键分别在其羧基和氨基端处共价连接以形成抗体或其片段。(格兰特(Grant GA) (1992)合成妝用户指南(Synthetic Peptides A User Guide).纽约州弗里曼公司(ff. H. Freeman and Co. , N. Y. ), (1992);波登斯基(Bodansky Μ)和托斯特(Trost B.)编(1993)肽合成原理(Principles of Peptide Synthesis).纽约州施普林格公司(Springer-Verlag Inc. , NY),其至少关于与肽合成相关的材料以引用的方式并入本文中)。或者，如本文所述在活体内独立合成肽或多肽。一旦分离，这些独立肽或多肽即可通过类似肽缩合反应连接以形成肽或其片段。举例来说，酶促连接克隆或合成肽区段允许连接相对较短的肽片段以产生较大肽片段、多肽或整个蛋白质结构域(亚伯拉罕森(Abrahmsen L)等人，生物化学(Biochemistry) ,30 :4151 (1991))。或者,合成肽的天然化学连接可用于由较短肽片段合成构筑较大肽或多肽。此方法由两步化学反应组成(道森(Dawson)等人通过天然化学连接合成蛋白质(Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation).科学(Science),266 :776-779(1994))。第一步为未经保护的合成肽一硫酯与另一未经保护的含有氨基端Cys残基的肽区段进行化学选择性反应以产生连接有硫酯的中间物作为初始共价产物。在不改变反应条件的情况下，此中间物经历自发快速分子内反应以在连接位点处形成天然肽键(巴吉奥尼(Baggiolini M)等人(1992)欧洲生化学会联合会通讯(FEBS Lett.) 307 97-101 ;克拉克-路易斯(Clark-Lewis I)等人，生物化学杂志(J. Biol. Chem.), 269 16075 (1994);克拉克 _ 路易斯(Clark-Lewis I)等人，生物化学(Biochemistry),30 3128 (1991);雷伽萨姆(Rajarathnam K)等人，生物化学(Biochemistry)33 6623-30(1994))。或者，化学连接未经保护的肽区段，其中由于化学连接而在肽区段之间形成的键为非天然(非肽)键(斯克洛泽(Schnolzer，Μ)等人科学(Science)，256 :221 (1992))。此技术已用于合成蛋白质结构域的类似物以及大量相对纯净的具有全部生物活性的蛋白质(德里斯米尔顿(deLisle Milton RC)等人，蛋白质化学中的技术IV(Techniques inProtein Chemistry IV).纽约学术出版社(Academic Press, New York),第 257-267 页(1992))。D.试剂盒上述物质以及其它物质可以任何适合组合以适用于执行或有助于执行公开的方法的试剂盒形式包装在一起。如果既定试剂盒中的试剂盒组分经设计且适合于在公开的方法中一起使用，则所述试剂盒为适用的。例如公开用于筛选HIV整合酶抑制剂的试剂盒，所述试剂盒包含本文公开的ー种或ー种以上肽和HIV整合酶的至少ー个结构域。试剂盒也可含有ー种或ー种以上酵母双杂交分析试剂。还公开ー种包含本文公开的ー种或ー种以上肽作为潜在整合酶抑制剂的文库的试剂盒。E.实例提出以下实例以便对所属领域的技术人员提供如何制备和评估本文主张的化合物、组合物、物品、装置和/或方法的完全公开内容和描述，并仅希望为例示性的且不希望限制公开内容。已作出努力来确保关于数值(例如量、温度等)的准确性，但应说明ー些误差和偏差。除非另外指示，否则份数为重量份，温度以で计或在环境温度下，且压カ为大气压或接近大气压。实例I :鉴别与HIV IN相互作用的肽构筑用于鉴别IN抑制剂的基于酵母的筛选平台。在此平台中，从作为模板的基于PNL4-3的前病毒(provirus) (R9)扩增HIV IN，且克隆入2个表达载体中，从而使IN C端分别与GAL4DNA结合域(GALDB)和GAL4活化域(GALAD)融合。通过西方印迹分析来检测GALAD-IN(未显示)；然而，GALDB-IN勉强可侦测。携带与活化域和结合域融合的IN的酵母使双杂交报告基因活化，表明存在足量IN来检测先前证明的自身缔合。对照载体或HIVgag加GALDB-IN或GALAD-IN的其它组合未能活化报告基因，表明病毒整合酶不为自身活化齐 。
为了鉴别IN结合肽，使产生HIV整合酶的酵母与携带与VP16活化域融合的随机肽文库(长度为15个氨基酸；2700万种多样性)的酵母配对。二倍体涂铺在选择培养基上以鉴别携带对病毒目标具有亲和カ的肽的无性系。通过质粒连接分析来确认结合物(图I)。由筛选产生与病毒目标而非错误诱饵(HPVE6和HPVE7)相互作用的单一妝 LeuTyrGluThrIIeLeuIleLeuLeuPheLeuAspValAspThrGly(SEQ ID N0:1)。图 I通过双杂交显示肽与HIV IN的相互作用。肽以与VP16-ZSgreen的C端融合物形式进行克隆，且在 AH109Mat a, trpl-901, leu2_3，112，ura3-52, his3_200，gal4A , gal80 Δ ,LYS2: :GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, GAL2UASGAL2TATA-ADE2，URA3 =MELffAS-MELlTATA-IacZ 中测试所述肽与GALDB或GALDB-IN融合物的相互作用。在腺嘌呤板上的生长指示可选择报告基因的活化。添加亲水性氨基酸至C端可产生可溶性肽。合成具有序列LeuTyrGluThrlleLeuIleLeuLeuPheLeuAspValAspThrGlyLysLysArg(SEQ ID NO 2)的妝并进一步加以研究。SEQ ID NO :2具有增加肽溶解性的碱性尾部(LysLysArg)。同样，合成具有序列LeuTyrGluThrIIeLeuI leLeuLeuPheLeuAspValAspThrGly AspGluAsp (SEQ ID NO :3)的妝并进一步加以研究。SEQ ID NO :3具有增加肽溶解性的酸性尾部(AspGluAsp)。
实例2:确认IN抑制为了确认由SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3对IN的抑制，协同整合分析测试用于测量通过模拟逆转录病毒的构筑体进行DNA整合的水平。通常，IN催化转酯反应；病毒DNA端的3'羟基攻击目标DNA中的一对磷酸ニ酯键。在半位点整合反应中，病毒整合酶使I个病毒DNA端与环状DNA目标的I条链连接；在协同整合中，2个病毒DNA端与环状目标连接，从而使目标DNA线性化。图2显示环状目标DNA的半位点整合与协同整合两者。參见科里杰(Craigie)等人生物化学杂志(J. Biol. Chem.) (2005)280(32) :29334-9 和科里杰(Craigie)等人逆转录病毒 DNA 整合反应路径和关键中间物(Retroviral DNA integration reaction pathway and criticalintermediates).欧洲分子生物学杂志(EMBO J) · (2006)25(6) : 1295-304，且所述文献据此关于有关此分析的其它细节以全文引用的方式并入本文中。先前使用此分析显示利用病毒整合酶进行处理会将反应路径导向协同整合且远离半位点反应路径。据认为利用病毒整合酶处理逆转录病毒DNA会促进有能力进行协同整合的突触复合物(也就是病毒整合酶、逆转录病毒DNA、基因组DNA和各种其它内源性蛋白质)形成。在这些实验中，肽B05751 (SEQ ID NO 2)或肽 B05759 (SEQ ID NO 3)首先与 HIVIN混合。分别地，B05751 (SEQ ID NO 2)具有添加到肽端以增加溶解性的带正电荷的氨基酸，且B05759(SEQ ID NO 3)具有添加到肽端以増加溶解性的带负电荷的氨基酸。当任一种肽与IN—起预培育吋，肽在约5μΜ范围内抑制活体外协同整合活性。肽似乎阻断病毒整合酶与病毒DNA端之间的稳定复合物的装配。此不同于使用诸如ΜΚ0518的链转移抑制剂所见(使用诸如ΜΚ0518的抑制剂，链转移复合物(STC)累积；然而，使用本文所述的肽，并未见到此现象)。图3显示在不脱去蛋白质的情况下对协同DNA整合的分析。STC以浓度依赖性方式受B05751 (SEQ ID NO :2)与Β05759 (SEQ ID NO :3)两者的影响。图4显示在脱去蛋白质的情况下对协同DNA整合的分析。协同病毒DNA整合以浓度依赖性方式随B05751 (SEQ ID NO 2)和Β05759 (SEQ ID NO :3)浓度增加而降低。这些结果确认SEQ IDNO USEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3会通过与HIV IN相互作用来抑制病毒DNA整合入目标DNA 中。眼下，抑制机制尚未完全阐明。肽可使多聚形式的病毒整合酶稳定或阻断ニ聚体形成。此外，当在添加DNA之前而非在添加DNA之后添加到病毒整合酶时，肽会产生抑制(图5)。因为肽在病毒整合酶与DNA相互作用之前起作用，可能仅有短暂医药窗(pharmaceutical window)来供理论同义药物起作用。实例3 :筛选IN的化学抑制剂使用上述酵母双杂交系统以及肽-IN相互作用，可在高通量条件下筛选化学文库中会破坏酵母中肽-HIV IN相互作用的化合物。干扰肽与目标之间的相互作用的化合物将利用其降低报告基因转录的能力加以鉴别。所利用的高多祥性化学文库含有来自天然文库的化合物(也就是从海洋有机体分离的化合物)和具有已知药物样性质的具有实质性纯度的化合物。这些化合物将在10-100 μ M的浓度下个别地或在小池(pool)(每池< 10个化 合物)中加以筛选。作为筛选的每ー个化合物或池的阴性对照，这些酵母细胞将相对于表达其形成会活化报告基因的无关复合物的酵母细胞加以筛选。为了选择最佳候选物用于筛选，将在协同整合分析中测试选择性匹配物(hit)(也就是使目标-肽菌株而非对照菌株的信号降低的那些化合物)抑制病毒整合酶活性的能力。如下进行酵母LacZ分析。通过在30°C下在振荡下进行过夜培育使酵母菌株在50ml色氨酸和亮氨酸营养缺陷型选择性培养基(补充有2%右旋糖)中生长至饱和。酵母培养物接着稀释于选择性培养基(补充有2%右旋糖)中至最终0D600吸光度值O. 05。60微升此细胞悬浮液等分入384孔微板(临检用酶标板(CliniPlate)第11310-888号，芬兰雷勃实验室系统公司(Thermolabsystems,Fi))的姆一个孔中。600nl IOmM的化合物(或在对照情况下，纯DMS0)接着添加于384孔微板的每ー个孔中的酵母上。含有酵母加化合物的384孔微板在无菌培养(Sterile Cult)培育箱中生长18小吋。除含有目标-肽菌株加化合物的320孔之外，每ー个384孔板也将含有如下64个对照孔16个孔含有阳性对照菌株加600nl DMSO ；阴性对照菌株含有600nl DMSO ;且32个孔含有目标-肽酵母加600nlDMS0。在于培育箱中培育之后，细胞再悬浮且使用萨菲尔II型(Saphire II)微板读取器(分子装置公司(Molecular Devices))测量并记录姆一个孔的0D600吸光度值。姆孔9微升细胞接着转移入黒色384孔微板(梅崔科(Matrical)小量MP101-1-PS，华盛顿州斯波坎(Spokane WA))中。3微升YPER(皮尔斯化学品公司(Pierce Chemicals))添加到姆ー个孔(含有酵母)中。在室温下培育板30分钟以使酵母溶解。接着向每ー个孔中添加22·5μ1含ImM CUG ( β -半乳糖苷酶底物，分子探针公司(Molecular Probes))的Z缓冲液(60mMNa2HP04 · 7H20、40mM NaH2PO4 · H2OUOmM KCl、50mM MgSO4 · 7Η20、50πιΜβ -巯基こ醇)。溶液在室温下培育30分钟，此后添加2. 5 μ I IM Na2CO3来终止反应。接着测量并记录每一个孔的荧光值，使用萨菲尔II型(Saphire II)读取器(帝肯公司(Tecan))，在390nm下激发并用455nm截止滤波器在460nm下记录发射。0D600吸光度值与荧光值两者减去背景且将通过用(相应孔的)0D600吸光度值除(任何既定孔的)荧光值来获得正规化荧光值。其它IacZ底物可用于检测报告基因的转录活性，例如P-Glo(Beta-Glo)(普洛麦格公司(promega)),其为ー步添加，随后在向细胞添加之后I小时进行读取。
将测试一定范围的浓度，初始集中在10与100 μ M之间的区域。将选择最终筛选浓度以使真阳性物以约1%的比率回收，且出现对酵母生长具有较大负面效应的频率可较低(< 10% )。化合物将以足以产生50 μ M的最終分析浓度的浓度从母板稀释入工作储备溶液中。阳性物将定义为信号RFU/0D 600)低于DMSO对照菌株40%且相对于对照生长 75%。阳性物将接着利用以上提及的协同整合分析进ー步筛选。如果这些化合物抑制协同病毒DNA整合，则这些化合物将视为HIV IN的可行抑制剂。实例4 :肽结合HIV整合酶的N端和C端的缺失物为了进ー步获得对肽抑制机制的理解，对肽的结合位点的位置加以确定。阐明肽的结合位点可允许在与整合酶的共晶体研究、活体内替代分析和在酵母中的化学筛选中使用整合酶的片段而非全长整合酶。举例来说，如果肽与整合酶上的2个区域結合，则可能更难以分离会阻断肽与整合酶相互作用的化合物。为了确定HIV IN中本发明 肽的相互作用区域，测试IN的6个N端缺失突变体(pLBal3 (18-288)、pBal4 (19-288)、pBal8 (31-288)、pBal5 (40-288)、pLBal2 (43-288)、pBal3 (48-288))和 4 个 C 端缺失突变体(pCdeltal (1-203)、pBalC26 (1-210)、pCdelta2 (1-220)、pCdelta3 (1-215))。使整合酶片段与GAL4的AC结构域融合且测试双杂交系统中与融合于GAL4DNA结合域的肽的相互作用。pLBal3> pBal4> pBal8> pBal5> pLBal2> pBal3> pBalC26 的构筑描述于卡帕拉(Kalpana)和高夫(Goff)，遗传学(Genetics)90 :10593-10597(1993)中，所述文献据此以引用的方式并入本文中。对C端缺失物测序显示归因于終止密码子在DNA质粒中的位置，在蛋白质C端之前有几个额外非IN氨基酸。质粒转型于基础菌株TSY 20IMATa ura3_52，his3_200，ade2_201, lys2_801，trpl-901, PDR5delta, SNQ2delta, leu2_3，112，gal4_542, gal80_538LYS2: :GAL2uas_GAL1taTA-HIS3, URA3: :GAL417IK# (X3)_CyClTATA-lacZ中。肽与整合酶的相互作用将使IacZ报告基因的表达活化并导致β_半乳糖苷酶在酵母中累积；相互作用将也活化HIS3报告基因，从而允许在缺乏组氨酸的合成板上生长。为了确定IN的缺失物维持与肽相互作用的程度，使携带质粒的菌株在缺乏亮氨酸和色氨酸的合成培养基中生长至对数中期。添加普洛麦格公司(Promega)的β-Glo底物以测量酵母中β _半乳糖苷酶活性的水平。β-Glo (Beta-Glo )分析系统由经组合以形成β-Glo (Beta-Glo )试剂的2种组分组成。此单ー试剂提供利用荧光素-半乳糖苷底物(6-0-β-吡喃半乳糖基-荧光素)的偶合酶反应系统。此底物由半乳糖苷酶分解形成荧光素和半乳糖。荧光素接着用于荧火虫荧光素酶反应中，产生光。因为单ー试剂会溶解细胞并含有为产生与半乳糖苷酶量成正比的发光信号所需的所有组分，可快速并有效处理许多板。N端缺失物和野生型显示可測量到B-Gal活性増加，表明在GAL4系统中，IN与肽结合(图6)。此外，所有C端缺失物皆在DNA结合域中与肽相互作用(图6)。pCdeltal、pBalC26、pCdelta3与肽的相互作用甚至强于全长IN(图6)。由融合蛋白造成的几何约束亦可由于对融合蛋白的GAL4部分或IN部分的正常功能的影响而造成活性差异。应了解上述组合物和用药模式仅说明本发明的优选实施例。众多修改和替代性配置可由所属领域的技术人员在不脱离本发明的精神和范围的情况下作出，并且随附权利要求书希望涵盖所述修改和配置。因此，尽管以上已连同目前视为最实用和优选的本发明实施例特定并详细描述本发明，但所属领域的技术人员应显而易知众多修改，包括(但不限于)大小、物质、形状、形式、功能和操作方式、装配和使用的变化可在不脱离本文阐述的原则和概念的情况下作出。F.序列I. SEQ ID NO 1LeuTyrGluThrIIeLeuIleLeuLeuPheLeuAspValAspThrGly2. SEQ ID NO: 2LeuTyrGluThrIIeLeuIleLeuLeuPheLeuAspValAspThrGlyLysLysArg3. SEQ ID NO 3 LeuTyrGluThrIIeLeuIleLeuLeuPheLeuAspValAspThrGlyAspGluAsp4. SEQ ID NO 4LeuTyrGluThrIIeLeuIleLeuLeuPheLeuAspValAspThrGlyXaaXaaXaa
权利要求
1.ー种病毒整合酶抑制肽，其包含与SEQ ID NO USEQ ID NO :2、SEQ IDNO :3、SEQ IDNO 4和其变异体具有至少65%序列同源性的氨基酸序列。
2.根据权利要求I 所述的肽，其与 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ IDNO :3、SEQ IDNO 4和其变异体具有至少90%氨基酸序列同源性。
3.根据权利要求2所述的肽，其包含所述氨基酸序列SEQID N0U SEQ IDNO :2、SEQID NO :3、SEQ ID NO 4 和其变异体。
4.根据权利要求I和3中任ー权利要求所述的肽，其中氨基酸独立地选自D-氨基酸和L-氨基酸。
5.根据权利要求I和3中任ー权利要求所述的肽，其中氨基端、羧基端或所述氨基端与羧基端两者经修饰。
6.根据权利要求5所述的肽，其中修饰为こ酰化或酰胺化。
7.ー种经分离聚核苷酸，其包含编码与SEQ ID NO USEQ ID NO :2、SEQ IDNO :3或SEQID NO 4具有至少65%序列同源性的氨基酸序列的核苷酸序列。
8.ー种经分离聚核苷酸，其包含编码与SEQ ID NO USEQ ID NO :2、SEQ IDNO :3或SEQID NO 4具有至少90%序列同源性的氨基酸序列的核酸序列。
9.ー种抑制整合酶活性的方法，其包含使整合酶与根据权利要求I和6中任一权利要求所述的肽接触。
10.一种治疗或预防个体HIV的方法，其包含向所述个体投予根据权利要求I和6中任ー权利要求所述的肽。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述肽包含内化序列。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述个体处于HIV感染的风险中。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述个体患有HIV。
14.ー种鉴别结合逆转录病毒整合酶的候选药剂的方法，其包含 (a)使逆转录病毒整合酶的至少ー个域与根据权利要求I和6中任ー权利要求所述的肽在允许所述肽与所述整合酶结合的条件下接触； (b)使所述整合酶与候选药剂接触；和 (c)确定所述候选药剂是否替代了所述肽， 其中替代所述肽指示所述候选药剂与所述整合酶结合。
15.根据权利要求14所述的方法，其中使用酵母双杂交筛选系统鉴别所述候选药剂，其中酵母中的转录活化指示所述肽正结合所述整合酶。
16.根据权利要求14所述的方法，其中使用酵母双杂交筛选法鉴别所述候选药剂，其中报告基因在酵母中表达的变化指示所述候选药剂正破坏所述肽与所述整合酶的结合。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述整合酶的所述至少ー个域包含药物抗性突变。
18.根据权利要求14所述的方法，其中使所述肽突变以针对与野生型或药物抗性整合酶的结合进行筛选。
19.根据权利要求9、14和18中任ー权利要求所述的方法，其中所述逆转录病毒整合酶选自由以下组成的群组正逆转录病毒亚科(Orthoretrovirinae)、Supumaretrovirinae、α 逆转录)丙# (Alpnaretrovirus)、β 逆转欢)丙#(Betaretovirus)、Y 逆转录病毒(Gammaretrovirus)、δ 逆转录病毒(Deltaretrovirus)、ε逆转录病毒(Epsi lonretrovirus)、慢病毒(Lentivirus)和泡沫逆转录病毒亚科(^pumaretrovirinae)。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述逆转录病毒整合酶选自由以下組成的群组禽类肉瘤白血病病毒(Avian Sarcoma Leukosis Virus)、劳氏肉瘤病毒(Rous sarcomavirus)、小鼠乳腺瘤病毒(Mouse mammary tumor virus)、鼠类白血病病毒(Murineleukemia virus)、艾贝尔森鼠白血病病毒(Abelson murine leukemia virus)、猫白血病病毒(Feline leukemia virus)、异嗜性鼠类白血病病毒相关病毒(Xenotropic murineleukemia virus-related virus)、人类嗜 T-淋巴细胞病毒(Human T-Iymphotropicvirus) (HTLV-1、HTLV-2)、牛白血病病毒、大眼梭S卢表皮增生病毒(Walleye epidermalhyperplasia virus)、人类免投:缺之病毒(Human immunodeficiency virusノ、猴免投缺乏病毒(Simian immunodeficiency virus)、猫白血病病韋、美洲獅慢病韋(Pumalentivirus)、马传染性贫血(EIA)、牛免疫缺乏病毒(Bovine immunodeficiency virus)、山羊关节炎脑炎病毒(Caprine arthritis encephalitis virus)、维斯纳梅迪病毒(Visna/maedi virus)、猴泡沐抦毒(Simian foamy virus)和人泡沐抦毒(Human foamyvirus, HFV)。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述整合酶为HIV整合酶。
22.根据权利要求18所述的方法，其中所述药物抗性突变选自由以下組成的群組T66I、T66A、T66K、E92Q、F121Y、E138A、E138K、G140A、G140S、Y143R、Y143C、Y143H、S147G、Q148H、Q148R、Q148K、S153Y、N155H、N155S、R263K、L74M、E92Q、T97A、V151I、E157Q、G163R、I203M、S230R、S230N、H51Y、Q95K、H114Y、P145S、Q146P、T125K、A128T、Q146K、N155S、K160D、V72I、A154I、V165I、V201I 和其任何组合。
全文摘要
本文描述抑制HIV整合酶活性的组合物和方法。还描述鉴别可抑制HIV整合酶以用于治疗或预防HIV的药剂的方法。还公开鉴别可抑制对整合酶抑制剂具有抗性的HIV病毒突变体的药剂的方法。
文档编号C07H21/04GK102695715SQ201080012573
公开日2012年9月26日 申请日期2010年3月18日 优先权日2009年3月19日
发明者R·佳治, T·仙德洛 申请人:因特葛莱泰克蛋白质组学有限责任公司, 美国卫生和公共服务部