标记的hsp90抑制剂的用途
【专利摘要】本发明涉及使用标记的HSP90抑制剂改善使用HSP90抑制剂治疗癌症患者的各种方法，包括用于确定肿瘤是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应的离体和体内方法。本发明还提供了一种用于确定肿瘤是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含以下步骤：（a）使所述肿瘤或含有来自所述肿瘤的细胞的样品与优先结合于HSP90的肿瘤特异性形式的可检测地标记的HSP90抑制剂接触；（b）测量结合于所述肿瘤或所述样品中所述肿瘤细胞的标记的HSP90抑制剂的量；以及（c）将步骤（b）中测量的结合于所述肿瘤或所述样品中所述肿瘤细胞的标记的HSP90抑制剂的量与结合于参考的标记的HSP90抑制剂的量比较。
【专利说明】标记的HSP90抑制剂的用途
[0001]相关申请案的交叉引用
[0002]根据35U.S.C.§ 119(e)，本申请案要求于2011年7月8日提出的美国临时申请案第61/506,010号的权益，所述临时申请案的所有内容以全文引用的方式并入本文中。
【背景技术】
[0003]为了维持稳态，细胞采用复杂的分子机器，这些分子机器由数以千计的被程序化以执行明确的功能的蛋白质构成。通过蛋白质错误表达或突变的这些通路调节异常会产生赋予恶性表型的生物优势。虽然在细胞水平下，所述调节异常可能是有益的(即有利于提高存活率)，但在分子水平下，此需要细胞投入能量来维持这些蛋白质的稳定性和功能。相信为了将这些蛋白质维持在假稳定状态，癌细胞指派分子伴随蛋白，包括HSP9032’33。
[0004]支持此假设，HSP90被公认为在维持转化的表型中起到重要的作用32’33。HSP90和其相关辅助伴随蛋白帮助统称为“客户蛋白”的细胞蛋白质进行正确的构象折叠，许多这些蛋白是控制细胞生长、分化、DNA破坏反应和细胞存活的信号转导通路的效应物。因此，肿瘤细胞对失调蛋白质的依赖(即通过突变、异常表达、不当的细胞移位等)可能变得决定性地依赖于HSP9033。
[0005]在各种形式的癌症中HSP90疗法的基本原理目前由包括在对标准疗法具有抗性的疾病内的临床前和临床研究很好地支持9卜97。举例来说，研究已经证明某些HER2+肿瘤对HSP90抑制剂的显著敏感性98’99。在这些肿瘤中，17-AAG (又称为坦螺旋霉素(Tanespimycin)) 和17-DMAG (阿螺旋霉素(Alvespimycin))甚至引起反应,并且特别是在曲妥珠单抗疗法(trastuzumab therapy)后的进行性疾病患者中98。例如PU-H71等其它HSP90抑制剂，在许多三阴性乳癌小鼠模型中进行临床前测试时，提供了至今在此难以治疗的癌症亚型中所报导的最有效的靶向单一药剂抗肿瘤作用1Q°。
[0006]虽然这些数据强烈地支持HSP90抑制剂用于癌症中，但此刻关于如何鉴别最可能受益于HSP90疗法的那些患者没有清晰的一致意见皿’1(12。此尤其成问题，众所周知对于靶向药剂的成功开发来说，最基本的是确定应接收药物的患者亚群(即，具有EGFR突变的肿瘤对它赛瓦(tarceva))。所述选择可以减少接收低效治疗的患者数目并且减少在晚期临床试验中无效的靶向肿瘤学药剂的交错数目。
[0007]此外，没有临床分析可以非侵入性地确定HSP90标靶抑制。虽然外周血淋巴细胞的药效监测已经在临床试验中提供了 HSP90抑制剂的体内生物活性的易得且可再现指标，但在正常组织中的药效并不预测肿瘤比活性97’1(11’1(12。明智地使用活组织检查来测量药效变化仍然是一种分析标靶调节的重要方式，但此种方法由于与侵入性分析有关的逻辑和伦理问题而仍然是受限制的。作为一种替代方案，目前使用锆89标记的抗体研究肿瘤HER2水平和VEGF水平的变化1(13’1(14，以及通过ELISA研究患者血清中可溶性HER2胞外域水平的变化1(15，但这些研究限于表达这些生物标记物的乳房肿瘤的子集。
[0008]因此，在HSP90靶向疗法中对生物标记物有强烈的需要:大部分癌症患者用新颖的实验性疗法治疗，在很多情况下几乎不了解特定药剂的作用机制、不同疾病子集的具体治疗的适合性并且几乎不知道不同恶性背景下治疗剂的最佳剂量和时程安排。最终结果是根据经验的临床研究，其中难治性恶性疾病患者在不知道哪一种治疗方法对不同的临床背景为最佳的情况下用一连串的新颖药剂治疗。
[0009]HSP90是一种在癌症中备受追捧的标靶，此是因为它在稳定和折叠与致癌性转化有关的蛋白质中起到关键作用。鉴于其可能降解许多不同的癌蛋白和影响多条信号传导通路，已经假设HSP90抑制剂(HSP90i)在多种癌症中是有效的。虽然早期临床试验已经证实此方法在肿瘤子集中的治疗可能性，但找到生物标记物来预测哪些癌症和患者群体将对所述治疗最敏感已经证明是挑战性的。所述对充足的患者群体的了解缺乏和选择已经导致大量新兴的HSP90癌症治疗剂进展缓慢或无法继续开发。因此迫切需要立即尝试针对HSP90疗法鉴别反应群体和开发伴随诊断性分析。
[0010]在HSP90疗法中对实现抗肿瘤功效所需要的适当剂量和时程的设计也缺乏了解。血浆药物动力学一般提供有益于治疗剂给药设计的数据，其中血浆曲线下面积(AUC)通常作为全身性药物暴露的量度。然而，对于HSP90抑制剂，肿瘤组织中而不是血液中药物滞留的浓度和持续时间决定它们的抗肿瘤作用1(16-1(19。确切地说，大部分HSP90抑制剂特征是从血浆和正常组织迅速清除，但在肿瘤内相对长时间药物滞留(即投药后12-48小时内)的非典型的药物动力学型态。因而，如果反应与注入剂量而不是肿瘤剂量相关，那么对HSP90疗法的肿瘤反应的临床了解严重地受到限制。血浆药物动力学有限的价值和肿瘤剂量对肿瘤反应的重要性表明需要临床开发一种对HSP90抑制剂的肿瘤药物动力学的分析。肿瘤HSP90的验证的临床上实践的非侵入性分析将能够将治疗剂给药集中于实现稳态的肿瘤药物浓度，而不是替代的稳态血浆浓度。所述分析可以指示在等于或低于最高许可剂量下，是否可以实现治疗有效肿瘤浓度。在相反情况下，患者可以实行一种替代治疗，使他们在无临床益处下无需暴露于可能的药物毒性。
[0011]为了克服与HSP90疗法有关的这些限制，这里设计和开发了一种所提出的非侵入性分析，它将推动HSP90抑制剂在癌症中的最佳临床实施、开发和使用。
【发明内容】
[0012]本发明提供了使用标记的HSP90抑制剂改善使用HSP90抑制剂治疗癌症患者的方法。
[0013]本发明证明了不仅仅是由HSP90表达决定的此具体“致癌HSP90”物质的丰度预测对HSP90抑制疗法的敏感性并且因此是HSP90疗法的生物标记物。本发明还证明了鉴别和测量肿瘤内此致癌HSP90物质的丰度预测对HSP90疗法的反应。“致癌HSP90”在本文中定义为代表伴随蛋白复合物的细胞应激特定形式的HSP90部分，其在肿瘤细胞环境下扩增并且组成性维持，并且可以执行维持恶性表型所需的功能。所述作用不仅调节过度表达(即HER2)、突变(即mB-Raf)或嵌合蛋白(即Bcr-Abl)的折叠，而且还促进与异常活化信号传导复合物(即STAT5、BCL6)相关的分子的架构和复合物形成。虽然肿瘤存活变得依赖于HSP90-癌蛋白的网络，但这些蛋白质在功能和稳定性上变得依赖于“致癌HSP90”。此共生性互相依赖表明肿瘤对HSP90癌蛋白的依赖等同于对“致癌HSP90”的依赖。测量后者的丰度是第一读数，因此，根据本发明，是HSP90疗法富集的生物标记物。
[0014]此外，展示HSP90在恶性细胞中形成生物化学不同的复合物。癌细胞HSP90的主要部分保留类似于正常细胞的“管家”伴侣功能，而癌细胞中富集或扩增的功能上不同的HSP90池(B卩，“致癌HSP90”)特异性地与维持肿瘤细胞存活、异常增生特征以及侵入和转移行为所需的癌蛋白相互作用。
[0015]为了以逐肿瘤的方式测量“致癌HSP90”的丰度，本发明还提供了化学工具。所述工具包括荧光标记和ANCA标记的HSP90抑制剂、生物素标记的HSP90抑制剂和放射性标记的抑制剂，它们特异性地鉴别此肿瘤“致癌HSP90”物质并且与其相互作用，这使得可以测量不同类型的肿瘤、肿瘤细胞、肿瘤支持细胞和肿瘤相关生物形式中(例如血液科恶性疾病、实体肿瘤和液体肿瘤中)“致癌HSP90”物质的丰度，并且因此测量和预测对HSP90抑制疗法的敏感性。这些可以呈但不限于实体或液体肿瘤中的癌细胞、癌症干细胞、循环肿瘤细胞、肿瘤支持免疫细胞、外来体和肿瘤支持祖细胞的形式。
[0016]在一个方面，本发明提供了一种用于确定肿瘤是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含以下步骤:
[0017](a)使所述肿瘤或含有来自所述肿瘤的细胞的样品与优先结合于肿瘤或肿瘤细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式的可检测地标记的HSP90抑制剂接触；
[0018](b)测量结合于所述肿瘤或所述样品中所述肿瘤细胞的标记的HSP90抑制剂的量；以及
[0019](c)将步骤(b)中测量的结合于所述肿瘤或所述样品中所述肿瘤细胞的标记的HSP90抑制剂的量与结合于参考的标记的HSP90抑制剂的量比较；
[0020]其中步骤(b)中测量的结合于所述肿瘤或所述肿瘤细胞的标记的HSP90抑制剂的量比参考量大表明所述肿瘤将可能对所述HSP90抑制剂起反应。
[0021]在一个实施例中，参考细胞来自患有肿瘤的相同患者的细胞。参考细胞可以是来自癌症患者的正常细胞。举例来说，正常细胞可以是来自患有血液肿瘤的患者的淋巴细胞、来自具有循环肿瘤细胞的患者或实体肿瘤周围的正常组织的白血球。在另一实施例中，参考细胞是肿瘤细胞或来自癌症患者的几乎不表达致癌HSP90的另一细胞。在另一实施例中，参考细胞来自与患有肿瘤的患者不同的患者的细胞。举例来说，参考细胞可以来自健康个体的细胞或来自除待测量的患有肿瘤的患者以外的癌症患者的几乎不表达致癌HSP90的细胞。
[0022]在一个方面，本发明提供了一种用于确定肿瘤是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含以下步骤:
[0023](a)使所述肿瘤或含有来自所述肿瘤的细胞的样品与优先结合于肿瘤或肿瘤细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式的第一可检测地标记的HSP90抑制剂和最低程度或不结合于所述HSP90的肿瘤特异性形式的第二可检测地标记的抑制剂接触；
[0024](b)测量结合于所述肿瘤或所述样品中所述肿瘤细胞的第一标记的抑制剂和第二标记的抑制剂的量；以及
[0025](C)将结合于所述肿瘤或所述肿瘤细胞的第一标记的抑制剂的量与结合于所述肿瘤或肿瘤细胞的第二标记的抑制剂的量比较，
[0026]其中结合于所述肿瘤或肿瘤细胞的第一标记的抑制剂的量比结合于所述肿瘤或肿瘤细胞的第二标记的抑制剂大表明所述肿瘤将可能对所述HSP90抑制剂起反应。
[0027]在一个实施例中，标记的HSP90抑制剂是可渗透细胞并且选择性地结合于“致癌HSP90”的荧光标记或ANCA标记的抑制剂。举例来说，提供HSP90抑制剂PU-H71的不同的荧光标记和ANCA标记型式，其已经针对用于流式细胞术，以及用于分析在实体或液体肿瘤中发现或从中分离的癌细胞、癌症干细胞、循环肿瘤细胞、肿瘤支持免疫细胞、外来体和肿瘤支持祖细胞，以及用于通过例如活组织检查、手术和细针吸取等若干介入方法获得的样品的组织染色而最佳化。
[0028]在一种所述实施例中，展示例如TO-H71-FITC2 (部分5.2.1.1.)等荧光标记的抑制剂可以用于测量从例如活组织检查和手术样品等来源中获得的组织中“致癌HSP90”的丰度。在另一实施例中，展示例如TO-H71-FITC2等荧光标记的抑制剂可以用于测量建立的癌细胞系或原代癌细胞中“致癌HSP90”的丰度。在另一实施例中，展示荧光标记的抑制剂可以用于测量从例如来自肿瘤等癌症样品中分离的细胞中、癌症干细胞中、循环肿瘤细胞中和从细针吸取中获得的癌细胞中“致癌HSP90”的丰度。在其它实施例中，展示也适用于进行以上提及的测量的其它荧光标记、ANCA标记和生物素标记的HSP90抑制剂。
[0029]在另一实施例中，标记的HSP90抑制剂是选择性地结合于“致癌HSP90”的放射性标记的抑制剂。举例来说，放射性标记的PU-H71的不同型式已经针对PET成像而最佳化。在一特定实施例中，PU-H71的碘124放射性标记的型式用于实体和液体肿瘤的PET成像。放射性标记的抑制剂可用于使许多类型的原发性和转移性癌症成像，包括(但不限于)结肠直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、基底细胞癌、黑色素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌在内的肺癌、乳癌、成神经细胞瘤、包括胃肠道基质肿瘤在内的胃肠道癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、肛门癌、包括神经胶质瘤在内的脑肿瘤、包括滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤在内的淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、骨髓增生性赘生物以及包括卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌在内的妇科癌症。
[0030]本发明进一步提供了以逐肿瘤的方式测量例如(但不限于)上列的那些肿瘤等实体肿瘤中和例如(但不限于)与淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和骨髓增生性赘生物有关的液体肿瘤等液体肿瘤中“致癌HSP90”的丰度的方式。在一个实施例中，本发明展示通过使用特异性地与“致癌HSP90”相互作用的碘124标记的HSP90抑制剂，可使用非侵入性PET成像并且定量患者中、实体肿瘤和液体肿瘤中的“致癌HSP90”。
[0031]在一个方面，本发明提供了一种用于确定患有例如血液癌症(例如白血病)等血液科恶性疾病的患者是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含:使含有来自所述患者的癌细胞的样品和参考非癌细胞与优先结合于患者癌细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式的可渗透细胞的荧光标记的HSP90抑制剂接触，测量结合于所述样品中所述癌细胞和非癌症的荧光标记的HSP90抑制剂的量，并且将结合于所述癌细胞的所述荧光标记的HSP90抑制剂的量与结合于所述非癌细胞的所述荧光标记的HSP90抑制剂的量比较，其中结合于所述癌细胞的荧光标记的HSP90抑制剂的量大于所述非癌细胞表明所述肿瘤将可能对所述HSP90抑制剂起反应。
[0032]在一种所述实施例中，参考正常细胞是来自与癌细胞相同的患者的正常细胞(例如淋巴细胞)。在另一实施例中，参考非癌细胞是从与癌症患者不同的患者中获得。
[0033]在一个方面，本发明提供了一种用于确定患有实体肿瘤的患者是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含:使含有来自患者的癌细胞和非癌细胞(例如周围基质、良性细胞或样品中的其它类型正常细胞)的样品(例如从活组织检查、手术、细针吸取或其它介入程序中获得)与优先结合于所述患者的癌细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式的可渗透细胞的荧光标记的HSP90抑制剂接触，测量结合于所述样品中所述癌细胞和非癌细胞的荧光标记的HSP90抑制剂的量，并且将结合于所述癌细胞的所述荧光标记的HSP90抑制剂的量与结合于所述非癌细胞的所述荧光标记的HSP90抑制剂的量比较，其中结合于所述癌细胞的荧光标记的HSP90抑制剂的量大于所述非癌细胞表明所述肿瘤将可能对所述HSP90抑制剂起反应。
[0034]本发明还提供了一种用于确定患有实体肿瘤的患者是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含:使含有来自所述患者的循环癌细胞和非癌细胞(例如白血球)的样品与优先结合于所述患者的癌细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式的可渗透细胞的突光标记的HSP90抑制剂接触,测量结合于所述样品中所述癌细胞和非癌细胞的突光标记的HSP90抑制剂的量，并且将结合于所述癌细胞的所述荧光标记的HSP90抑制剂的量与结合于所述非癌细胞的所述荧光标记的HSP90抑制剂的量比较，其中结合于所述癌细胞的荧光标记的HSP90抑制剂的量大于所述非癌细胞表明所述肿瘤将可能对所述HSP90抑制剂起反应。
[0035]在一替代性实施例中，参考非癌细胞是从除患有肿瘤的患者以外的患者中获得。
[0036]在另一方面，本发明提供了使用放射性标记的HSP90抑制剂确定将对HSP90抑制疗法敏感的患者的方法。
[0037]在一个所述实施例中，本发明提供了用于确定患有可成像肿瘤的癌症患者是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含以下步骤:
[0038](a)向所述患者投予优先结合于所述肿瘤中或所述肿瘤的肿瘤细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式的放射性标记的HSP90抑制剂；
[0039](b)在步骤(a)中所述投予后一个或一个以上时间点测量所述患者的肿瘤对所述放射性标记的HSP90抑制剂的吸收；
[0040](c)在步骤(a)中所述投予后所述一个或一个以上时间点测量所述患者的预定健康组织或血液对所述放射性标记的HSP90抑制剂的吸收；
[0041](d)计算步骤(b)中在一个或多个时间点测量的吸收与步骤(C)中相同时间点测量的吸收的比率；以及
[0042](e)确定所述癌症患者将对使用所述HSP90抑制剂的疗法起反应的可能性，其中在一个或多个时间点步骤(d)中计算的比率超过2表明所述患者将可能起反应。
[0043]在另一实施例中，本发明提供了一种用于确定患有可成像肿瘤的癌症患者是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含以下步骤:
[0044](a)向所述患者投予优先结合于所述肿瘤中或所述肿瘤的肿瘤细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式的放射性标记的HSP90抑制剂；
[0045](b)在步骤(a)中所述投予后4小时以上的一个或一个以上时间点测量所述患者的肿瘤对所述放射性标记的HSP90抑制剂的吸收，
[0046]其中相对于所述肿瘤周围的健康组织中的吸收，在所述一个或一个以上时间点所述抑制剂的吸收表明所述患者将可能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应。
[0047]在又一个实施例中，本发明提供了一种用于确定可成像肿瘤是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含以下步骤:
[0048](a)向所述患者投予优先结合于所述肿瘤中或所述肿瘤的肿瘤细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式的放射性标记的HSP90抑制剂；
[0049](b)在步骤(a)中所述放射性标记的HSP90抑制剂投予后2个小时或2个小时以上的一个或一个以上时间点通过PET目视检查所述放射性标记的抑制剂在所述肿瘤中或在所述肿瘤的肿瘤细胞中的吸收，
[0050](c)将步骤(b)中获得的PET影像与在所述一个或一个以上时间点在所述肿瘤周围的健康组织中获得的PET影像比较；
[0051]其中在所述一个或一个以上时间点所述肿瘤中或所述肿瘤的肿瘤细胞中PET影像中的明亮区域的存在表明所述患者将可能对HSP90抑制疗法起反应。
[0052]在另一实施例中，本发明提供了一种用于确定患有表达致癌HSP90的肿瘤的特定癌症患者是否将可能对使用界定剂量的HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含以下步骤:
[0053](a)向所述患者投予优先结合于所述肿瘤中或所述肿瘤的肿瘤细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式的所述HSP90抑制剂的放射性标记形式；
[0054](b)在步骤(a)中所述投予后一个或一个以上时间点测量所述患者的肿瘤对所述HSP90抑制剂的所述放射性标记形式的吸收；
[0055](C)基于步骤(b)中在所述一个或一个以上时间点测量的吸收,针对所述HSP90抑制剂的界定剂量，计算在所述一个或一个以上时间点中的每一个在所述患者的肿瘤中存在的所述HSP90抑制剂的浓度；以及
[0056](d)将步骤(C)中计算的所述HSP90抑制剂的浓度与在所述一个或一个以上时间点在肿瘤中存在的使所述HSP90抑制剂有效治疗所述肿瘤所需的所述HSP90抑制剂的参考浓度比较，
[0057]其中如果步骤(C)中计算的所述HSP90抑制剂的浓度将等于或超过有效治疗所述肿瘤所需的所述HSP90抑制剂的浓度，那么所述患者将可能对使用所述界定剂量的HSP90抑制剂的疗法起反应。
[0058]在另一方面，展示放射性标记的HSP90抑制剂可以用于确定HSP90抑制剂的有效剂量和给药时程。
[0059]在一个所述实施例中，本发明提供了一种用于确定患有表达致癌HSP90的肿瘤的特定癌症患者是否将可能对使用界定剂量的HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含以下步骤:
[0060](a)向所述患者投予优先结合于所述肿瘤中或所述肿瘤的肿瘤细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式的所述HSP90抑制剂的放射性标记形式；
[0061](b)在步骤(a)中所述投予后一个或一个以上时间点测量所述患者的肿瘤对所述HSP90抑制剂的所述放射性标记形式的吸收；
[0062](C)基于步骤(b)中在所述一个或一个以上时间点测量的吸收,针对所述HSP90抑制剂的界定剂量，计算在所述一个或一个以上时间点中的每一个在所述患者的肿瘤中存在的所述HSP90抑制剂的浓度；以及
[0063]Cd)将步骤(C)中计算的所述肿瘤对所述HSP90抑制剂的暴露与在所述一个或一个以上时间点在所述肿瘤中存在的使所述HSP90抑制剂有效治疗所述肿瘤所需的对所述HSP90抑制剂的参考暴露比较，
[0064]其中如果步骤(C)中计算的所述肿瘤对所述HSP90抑制剂的暴露将等于或超过有效治疗所述肿瘤所需的所述肿瘤对所述HSP90抑制剂的暴露，那么所述患者将可能对使用所述界定剂量的HSP90抑制剂的疗法起反应。
[0065]额外的实施例包括一种用于确定使用HSP90抑制剂的疗法对于患有可成像肿瘤的特定癌症患者投予的有效剂量和频率的方法；一种用于确定癌症患者中可成像肿瘤中存在的HSP90抑制剂的浓度的方法；以及一种用于确定或监测癌症患者中肿瘤对使用HSP90抑制剂的疗法起反应的方法。
[0066]在又一个实施例中，本发明提供了一种用于确定使用HSP90抑制剂的疗法对于患有表达致癌HSP90的肿瘤的特定癌症患者投予的有效剂量和频率的方法，其包含以下步骤:
[0067](a)向所述患者投予优先结合于肿瘤或肿瘤细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式的所述HSP90抑制剂的放射性标记形式；
[0068](b)在步骤(a)中所述投予后一个或一个以上时间点测量所述患者的肿瘤对所述HSP90抑制剂的所述放射性标记形式的吸收；以及
[0069](C)基于步骤(b)中在所述一个或一个以上时间点测量的吸收，计算在所述一个或一个以上时间点中的每一个维持所述肿瘤中有效治疗所述肿瘤的所述HSP90抑制剂的浓度所需的投予剂量和频率，由此确定使用所述HSP90抑制剂的疗法对于所述癌症患者投予的有效剂量和频率。
[0070]在又一个实施例中，本发明提供了一种用于确定使用HSP90抑制剂的疗法对于患有表达致癌HSP90的肿瘤的特定癌症患者投予的有效剂量和频率的方法，其包含以下步骤:
[0071](a)向所述患者投予优先结合于肿瘤或肿瘤细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式的所述HSP90抑制剂的放射性标记形式；
[0072](b)在步骤(a)中所述投予后一个或一个以上时间点测量所述患者的肿瘤对所述HSP90抑制剂的所述放射性标记形式的吸收；以及
[0073](C)基于步骤(b)中在所述一个或一个以上时间点测量的吸收，计算在治疗时期内维持所述肿瘤中有效治疗所述肿瘤的所述HSP90抑制剂的平均肿瘤浓度所需的投予剂量和频率，由此确定使用所述HSP90抑制剂的疗法对于所述癌症患者投予的有效剂量和频率。
[0074]在又一方面，本发明提供了一种用于确定癌症患者中表达致癌HSP90的肿瘤中存在的HSP90抑制剂的浓度的方法，其包含以下步骤:
[0075](a)向所述患者共投予预定量的所述HSP90抑制剂和一定量的所述HSP90抑制剂的放射性标记形式，所述HSP90抑制剂优先结合于肿瘤或肿瘤细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式；
[0076](b)在步骤(a)中所述共投予后一个或一个以上时间点周期性地测量所述患者的肿瘤对所述放射性标记的HSP90抑制剂的吸收；以及
[0077](C)基于步骤(b)中所述放射性标记的HSP90抑制剂的吸收的测量，确定在任何所述时间点所述肿瘤中存在的所述HSP90抑制剂的浓度。
[0078]在另一方面，本发明提供了一种用于确定癌症患者中表达致癌HSP90的肿瘤对使用HSP90抑制剂的疗法的反应的方法，其包含以下步骤:
[0079](a)在所述患者接收所述HSP90抑制剂作为疗法的时期内一个或一个以上时间点向所述患者投予优先结合于肿瘤或肿瘤细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式的所述HSP90抑制剂的放射性标记形式；
[0080](b)在步骤(a)中所述投予后所述一个或一个以上时间点测量所述患者的肿瘤中所述放射性标记的HSP90抑制剂的浓度；以及
[0081](c)将步骤(b)中测量的所述放射性标记的HSP90抑制剂的浓度与有效治疗所述肿瘤所需的所述HSP90抑制剂的最小浓度比较，其中测量的浓度超过治疗所述肿瘤所需的最小值表明所述患者可能对使用所述HSP90抑制剂的疗法起反应。
[0082]在另一方面，本发明提供了一种用于确定罹患神经变性疾病的患者是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含以下步骤:
[0083](a)使脑与优先结合于所述患者的脑细胞中存在的HSP90的病原性形式的放射性标记的HSP90抑制剂接触；
[0084](b)测量结合于样品中脑细胞的标记的HSP90抑制剂的量；以及
[0085](c)将步骤(b)中测量的结合于样品中脑细胞的标记的HSP90抑制剂的量与参考量比较；
[0086]其中步骤(b)中测量的结合于脑细胞的标记的HSP90抑制剂的量比参考量大表明所述患者将可能对所述HSP90抑制剂起反应。
[0087]在另一方面，本发明提供了用HSP90抑制剂PU-H71治疗HSP90依赖性癌症的方法。在特定实施例中，提供治疗HSP90依赖性癌症的方法以实现PU-H71的特定肿瘤暴露。在其它实施例中，提供TO-H71的新颖给药方案。
[0088]在另一方面，本发明提供了一种用于确定患者中存在的人类癌症是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含:
[0089](a)获得含有来自患者癌症的细胞的样品，所述细胞仅仅表达HSP90蛋白质或除HSP70蛋白质外还表达HSP90蛋白质；
[0090](b)针对步骤(a)中获得的所述样品中存在的所述细胞，评估至少一个以下参数的存在:活化AKT通路、PTEN肿瘤抑制因子功能或表达的缺陷、活化STAT5通路或Bcl_xL蛋白质表达；以及
[0091](C)将步骤(b)中获得的所述评估与步骤(b)中评估的相同参数对于来自对使用所述HSP90抑制剂的疗法起反应的一个或一个以上癌症患者的人类癌细胞的预定参考评估比较，以便由此确定所述患者的癌症是否将可能对使用所述HSP90抑制剂的疗法起反应。
[0092]在一个实施例中，相当关注此特定方法的使用的人类癌症是乳癌、胰腺癌和急性骨髓白血病。
[0093]用于评估每一参数的方法在所属领域中众所周知并且容易获得。然而，先前尚未展示一个或一个以上这些特定参数与预测HSP90抑制剂功效的相关性。虽然理论上单个参数可足以能够使技术熟练的行业者预测任何既定HSP90抑制剂的功效，但更可能需要考虑至少2个、或许至少3个或3个以上或甚至所有这些参数来对功效作一个可靠的预测。
【专利附图】
【附图说明】
[0094]图1.PU-H71优先与在癌细胞中更丰富的HSP90的限定部分相互作用。(a)使用H9010 (一种抗-HSP90抗体)的连续免疫纯化步骤耗尽MDA-MB-468细胞提取物中的HSP90。溶解产物=对照细胞提取物。(b)来自MDA-MB-468提取物的HSP90通过连续的化学和免疫纯化步骤分离。每一池中HSP90的量都通过密度测定法定量并且值相对于内标归一化。
(c)在指示的细胞中用1311-PU-H71进行饱和度研究。对所有分离的细胞样品计数并且确定m1-PU-H71的特定吸收。这些数据相对于1311-PU-H71的浓度绘图以得到饱和结合曲线。呈现四个分开的重复研究的代表性数据(下图)。指示的细胞中HSP90的表达通过蛋白质印迹法分析(上图)。(d)原代AML和CML⑶34+脐带血细胞(CB)或K562细胞用指示剂量的PU-H71预处理24小时。处理后的细胞用I μ MPU-FITC处理。PU-FITC与细胞的结合通过流式细胞术评估并且表示为平均荧光强度(MFI)。TEG-FITC作为非特异性结合对照展示。使用⑶45对比SSC的门控将结合于胚细胞或淋巴细胞与原代样品区分。(e)在指示剂量的PU-H71下原代AML和CMIXD34+CB或K562细胞在处理后相对于未处理的对照的活力％。细胞活力通过在处理后96小时膜联蛋白V/7-AAD染色来评估。数据呈现为平均值+ SE (n=3)。
[0095]图2.PU-H71对与癌蛋白和辅助伴随蛋白呈复合物的HSP90具有选择性且分离其。(a)K562提取物中的HSP90复合物通过用H9010(—种非特异性IgG)沉淀或通过PU-H71-珠粒或对照珠粒分离。对照珠粒含有乙醇胺，一种HSP90惰性分子。下拉物(pull-down)中的蛋白质通过蛋白质印迹法分析。(b、c)如所指示的单一或连续的免疫和化学沉淀在K562提取物中使用H9010和PU-珠粒以指示的频率和所示顺序进行。下拉物中和剩余上清液中的蛋白质通过WB分析。NS=非特异性。(d)K562细胞用媒剂(-)或PU-H71 ( + )处理24小时，并且通过蛋白质印迹法分析蛋白质。(e)Hsp70敲减的细胞中蛋白质的表达通过蛋白质印迹法(左图)分析并且蛋白质水平的变化以相对发光单位(RLU)呈现(右图)。对照=零乱siRNA。(f )如所指示的单一或连续的化学沉淀在K562提取物中使用GM-珠粒、SNX-珠粒和NVP-珠粒以指示的频率和所示顺序进行。下拉物中和剩余上清液中的蛋白质通过蛋白质印迹法分析。(g)K562细胞中的HSP90以与异常Bcr-Abl和正常c-Abl蛋白质的复合物存在。ro-H71，而不是H9010，选择Bcr-Abl癌蛋白结合的HSP90群体。
[0096]图3.(a、b)来自乳癌和CML细胞提取物(120 μ g)的HSP90通过如所指示的连续的化学和免疫纯化步骤分离。分离上清液以分析留下的HSP90。每一部分中的HSP90通过蛋白质印迹法分析。溶解产物=内源蛋白内含物；PU-珠粒、GM-珠粒和对照珠粒指示在特定珠粒上分离的蛋白质。H9010和IgG指示通过特定Ab分离的蛋白质。对照珠粒含有一种HSP90惰性分子。数据与从多个重复实验(n ^ 2)中获得的数据一致。(c) PE结合抗体对比PU-H71-FITC的HSP90结合。在数据条上方指示每一细胞系通过ro_H71分离的总细胞HSP90百分比。(d)在外周血白血球(PBL)提取物(250 μ g)中进行连续的化学和免疫纯化步骤以分离TO-H71和H9010特异性HSP90物质。所有样品都通过蛋白质印迹法分析(上图)。PBL中HSP90的结合是通过流式细胞术使用HSP90-PE抗体和PU-H71-FITC评估。FITC-TEG=非特异性结合的对照(下图)。(e)—组14种白血病细胞系中PU-H71-FITC (ΙμΜ)与HSP90的结合对比用TO-H71处理后活力百分比的相关性:香住(Kasumi )_1、香住_4、KCL-22、REH、TF-1、KG-1、HL-60、0C1-AML3、K562、MOLM-13, TUR、THP-1、U937 和 MV4-11。这些细胞中总HSP90水平类似,如通过蛋白质印迹法显示(未图示)。
[0097]图4.Ca)流式细胞术点图说明用于原代慢性骨髓白血病(CML)样品的门控策略以区分胚细胞(⑶45dim，红色圆圈)与非恶性淋巴细胞(蓝色圆圈)。(b)来自(a)中所示的原代CML患者样品的CML胚细胞相对于正常淋巴细胞中PU-H71-FITC与HSP90结合的比率。(c) Ca)中所示的原代CML样品在指示时间点和指示剂量的PU-H71处理后CML胚细胞(红色)或正常淋巴细胞(蓝色)相对于未经处理对照的活力百分比。(d)流式细胞术点图显示用于原代慢性期CML (cpCML)样品的门控策略以区分胚细胞(⑶45dim，红色圆圈)与非恶性淋巴细胞(蓝色圆圈)，并且分析胚细胞门(⑶45dim，红色圆圈)内⑶34+细胞(红色方块)的结合。基于7-AAD区分，⑶45对比SSC点图对活细胞进行预先门控。(e)慢性期CML (cpCML)CD34+细胞和正常淋巴细胞中PU-H71-FITC与HSP90结合的比率。(f)用ΙμΜ PU-H71-FITC或TEG-FITC处理48小时后cpCML CD34+细胞(红色)和正常淋巴细胞(蓝色)相对于未经处理对照的活力百分比。(g)来自正常脐带血、慢性期CML (cpCML)和胚细胞期(bpCML)细胞(n=5)的CD34+细胞和淋巴细胞中ro-H71_FITC与Hsp90结合的比率。(h)用PU-H71 (ΙμΜ)处理胚细胞和慢性CML⑶34+细胞以及正常⑶34+细胞(来自脐带血；CB)48小时后相对于未经处理对照的活力百分比。图c、f和h中的细胞活力通过膜联蛋白V/7-AAD染色评估。数据呈现为平均值土SE (n=3)。
[0098]图5.(a)在正常细胞内，HSP90使细胞蛋白折叠和移位到其适当细胞区室(“管家复合物”)中的进化守恒的管家功能需要HSP90的组成型表达。恶性转化时，细胞蛋白质通过突变、机能亢进、滞留不正确的细胞区室中或其它方式被扰乱。这些功能上改变的蛋白质的存在是起始和维持恶性表型所需的，并且正是这些癌蛋白被应激改变的HSP90的子集(“致癌复合物”)特异性地维持。PU-H71特异性地结合于伴随癌蛋白的HSP90部分(“致癌复合物”)。(b)使用PU-珠粒和对照珠粒以及H9010和IgG固定的抗体，在K562细胞提取物中分离HSP90和其相互作用的辅助伴随蛋白。对照珠粒含有一种HSP90惰性分子。(c)来自K562细胞提取物的HSP90通过三个连续的免疫纯化步骤利用H9010HSP90特异性抗体分离。分离剩余上清液以分析留下的蛋白质。每一部分中的蛋白质通过蛋白质印迹法分析。溶解产物=内源蛋白内含物。数据与从多个重复实验(n ^ 2)中获得的数据一致。
[0099]图6.GM和PU-H71对异常的蛋白质/HSP90物质具有选择性。(a)在实验中监测Bcr-Abl和Abl结合的HSP90物质，其中用指示量的K562细胞溶解产物探测恒定体积的PU-H71珠粒(80 μ L)(左图)，或者其中用指示体积的ro-H71珠粒探测恒定量的溶解产物(Img)(右图)。(b)(左图)PU-珠粒和GM-珠粒(80yL)识别SKMel28黑色素瘤细胞提取物(300 μ g)中的HSP90-突变体B-Raf复合物，但无法与在正常结肠成纤维细胞CCD18Co提取物(300 μ g)中发现的HSP90-WT B-Raf复合物相互作用。H9010HSP90Ab识别两种HSP90物质。(c )在MDA-MB-468细胞提取物(300 μ g )中，PU-珠粒和GM-珠粒(80 μ I)与HER3和Raf-1激酶相互作用，但不与非致癌性酪氨酸-蛋白激酶CSK(—种c-Src相关酪氨酸激酶)和P38相互作用。Cd)(右图)PU-珠粒(80yL)与v-Src/HSP90相互作用，但不与c-Src/HSP90物质相互作用。为了促进c-Src (丰度低于v-Src的一种蛋白质)检测，与v-Src转化的3T3细胞(250 μ g)相比，使用较高量的表达c-Src的3T3细胞溶解产物(I1OOOyg),此解释了在这些3T3细胞(溶解产物，3T3成纤维细胞对比v-Src3T3成纤维细胞)中检测到的较高HSP90水平。溶解产物=内源蛋白内含物；PU-珠粒、GM-珠粒和对照珠粒指示在特定珠粒上分离的蛋白质。HSP90Ab和IgG指示通过特定抗体分离的蛋白质。对照珠粒含有一种HSP90惰性分子。数据与从多个重复实验(n ^ 2)中获得的数据一致。
[0100]图7.单一化学沉淀是在表达Bcr-Abl的CML细胞系(a)中和原代CML细胞提取物(b)中用PU-珠粒和对照珠粒进行。下拉物中的蛋白质通过蛋白质印迹法分析。若干Bcr-Abl裂解产物在原代CML样品中如所报导注释9°。N/A=不可得。
[0101]图8.若干HSP90抑制剂的结构。
[0102]图9.合成的热休克蛋白90(HSP90)的荧光配体含有异硫氰酸荧光素(FITC)、4_硝基苯并[1，2，5]噁二唑(NBD)或红移染料磺酰罗丹明101 (得克萨斯红(Texas Red))结合于 PU-H71。
[0103]图10.所示反应方案的试剂和条件:(a) FITC、Et3N, DMF、室温、12小时、40% ； (b)得克萨斯红磺酰氯、DMF、0-10°C、12小时、61% ；(c) DMF、室温、20小时、47%。
[0104]图11.所示反应方案的试剂和条件:(a)FITC、Et3N' DMF、室温、5小时、72%; (b)NBD-CUEt3N, DMF、室温、12 小时、40%。
[0105]图12.所示反应方案的试剂和条件:(a)N-(3_溴丙基)_邻苯二甲酰亚胺、Cs2C03、DMF、室温、34% ； (b)水合肼、MeOHXH2Cl2、室温、64% ; (c)FITC、Et3N、DMF、室温、12 小时、74% ；
(d)NBD-Cl、Et3N、DMF、室温、12 小时、42%。
[0106]图13.(A)在37°C下将M0LM-13细胞用指示的ro_H71-荧光衍生物(I μ Μ)处理4小时，并且通过流式细胞术来测量与活细胞的结合(DAPI阴性)。结合程度显示为平均荧光强度(MFI)。(B)在37°C下将M0LM-13细胞用指示的ro_H71-荧光衍生物(I μ M)处理24小时。通过DAPI排除测定其活力。(C)将M0LM-13细胞用指示的PU-H71-荧光衍生物(I μ Μ)处理24小时。通过蛋白质印迹法分析HSP90客户蛋白mFLT3和Raf-1的稳态水平。β-肌动蛋白用以针对相等的蛋白负荷归一化。
[0107]图14.(A)用PU-H71-FITC2染色的白血病细胞的共焦荧光显微镜术展示显著的细胞内定位。(B)将原代急性骨髓白血病样品用指示剂量的TO-H71或媒剂(未经处理)预先处理24小时。将处理后细胞用ΙμΜ PU-H71-FITC2或TEG-FITC处理。PU-H71-FITC2和TEG-FITC与细胞的结合通过流式细胞术评估并且表示为平均荧光强度(MFI )。TEG-FITC作为非特异性结合对照展示。CD45对比SSC的门控用以区分结合于胚细胞(恶性细胞)或淋巴细胞(正常细胞)与原代样品。
[0108]图15.正常细胞(左图)和乳癌细胞(右图)中的I3U-ANCA的荧光发射光谱。乳癌细胞的光谱发射型态在约530nm波长下产生荧光发射峰，这是结合的PU-H71-ANCA的代表性荧光发射。
[0109] 图16.(a)来自健康供体(脐带血)和慢性和胚细胞期CML患者(分别是cpCML和bpCML)的脐带血和CML胚细胞相对于正常淋巴细胞中的PU-H71-FITC与Hsp90结合的比率。注意，对比与疾病进展有关的CML中的结合增加，未显著结合于来自健康患者的脐带血。(b)用PU-H71 (ΙμΜ)处理胚细胞和慢性CML⑶34+细胞以及正常⑶34+细胞(来自脐带血；CB) 48小时后相对于未经处理对照的活力百分比。细胞活力通过膜联蛋白V/7-AAD染色来评估。数据呈现为平均土SE (n=3)。(c)在一组19个原代AML患者样品中用500nMPU-H71处理48小时后PU-H71-FITC (I μ Μ)结合于HSP90与活力百分比的相关性。每一点表示原代AML样品。每一实验至少进行一式两份。这些细胞表达类似的总HSP90水平。
[0110]图17.异种移植分析表明体内高I3U-FITC结合的AML样品对PU-H71处理的敏感性。(a)体外PU-H71处理显示低和高PU-FITC吸收(b)的两个原代AML样品48小时的活力百分比。活力通过膜联蛋白/7AAD分析测定。(b)来自异种移植动物的骨髓细胞(对于图a中所示的AML样品)用人类特异性抗体染色以测定I3U-FITC结合。PU-FITC结合表示为人类(白血病)/鼠类(正常)的比率。(c) 一周用75mg/kg ro-H71处理3次，持续3周的动物中⑶34+肿瘤细胞百分比。
[0111]图18.使用标记的ro-H71检测和定量“致癌HSP90”并且预测肿瘤细胞对HSP90抑制剂的敏感性。(A)在一组胰腺癌和乳癌细胞系中用ΙμΜ PU-H71、SNX-2112或NVP-AUY922处理48小时后PU-H71-FITC (I μ Μ)结合于HSP90与活力百分比的相关性。结合测量为各别癌细胞中PU-FITC吸收与参考细胞HSP90抗性白血病细胞HL60中吸收(参见图D)的比率。(B)总肿瘤HSP90的表达通过蛋白质印迹法来测量并且相对于PU-FITC结合绘图。(C)在一组胰腺癌和乳癌细胞系中用I μ M PU-H71、SNX-2112或NVP-AUY922处理48小时后的活力百分比相对于总肿瘤HSP90的表达绘图。(D)在低结合和敏感性(HL-60)以及高结合和敏感性(MV4-11) AML细胞系中PE结合的抗体对比ro-H71_FITC的HSP90结合。数据呈现为平均值土 SE (n=3)。
[0112]图19.PU-H71-FITC2结合于肿瘤细胞和参考HL-60白血病细胞的比率。可以通过与非反应性细胞的结合于ro-H71-FITC2的比率为约1.23到约2.07或低于2.07相比，反应细胞的结合于ro-H71-FITC2的比率为约2.7到约5.87或超过5.87，来区分反应细胞050%活力减少)与非反应性细胞(〈50%活力减少)。
[0113]图20.EpCAM+循环肿瘤细胞中ro-H71_FITC2的累积:从全血分离的PBMC预先用I3U-FITC或对照(PU-FITC9、DMS0、1 μ M/2X 16个细胞/毫升、4小时)处理。接着细胞用⑶45、⑶14和EpCAM抗体染色。(A)对细胞门控以排除死细胞。接着对活细胞门控以对比⑶45+细胞测定EpCAM+。通过进一步以FSC，针对⑶14，对⑶45+细胞门控，将单核细胞从分析排除。(B)展示⑶45+⑶14-细胞(蓝色)和EpCAM+细胞(红色)的PU-FITC中值荧光强度(MFI)的直方图。EpCAM+细胞中药物的累积计算为减去DMSO和PU-FITC9对照(用作非特异性和背景结合对照)的值后MFIEpCAM+/MFI⑶45+⑶14-(循环肿瘤细胞/白血球)的比率。
[0114]图21.展示不同Lyl克隆对PU-H71-FITC2的吸收并且表示为中值荧光强度。这些细胞对HSP90抑制剂的敏感性与其对标记的ro-H71的吸收有关。这些肿瘤细胞中总肿瘤HSP90的表达通过蛋白质印迹法来测量(插图)。
[0115]图22 (a-c).胰腺癌细胞中TO-H71结合和毒性的相关性。(A)活细胞中的结合；将胰腺癌细胞(I X 16个细胞)用PUFITC2 (I μ Μ)或对照[TEG-FITC (I μ Μ)或DMS0]处理6小时。将细胞用FACS缓冲液(PBS、0.05%FBS)洗涤两次，并且在分析前在室温下在FACS缓冲液中用1μ g/ml DAPI(英杰公司(Invitrogen))染色。通过流式细胞术(LSR-1I，碧迪生物科学公司(BD B1sciences))获得表示PU-H71-荧光衍生物结合的来自活细胞(DAPI阴性)的荧光强度，并且通过FlowJo软件(俄勒R州亚什兰的树星公司(Tree Star, Ashland, OR))分析。值表示减去DMSO和TEG-FITC对照的平均荧光强度。(B)毒性:将胰腺癌细胞(I X 16个细胞)用PU-FITC2 (ΙμΜ)处理48小时。将细胞用FACS缓冲液(PBS、0.05%FBS)洗涤两次，并且在室温下在FACS缓冲液中用I μ g/ml DAPI (英杰公司)染色并通过流式细胞术(LSR-1I，碧迪生物科学公司)获得。值表示相对于来自DMSO对照的值归一化的活细胞(DAPI阴性)％。(C)相关分析；从A和B中获得的MFI和毒性分别在x和y轴上绘图并且进行相关线性回归分析。
[0116]图23.(A) PUH71-FITC2 与白血病干细胞(LSC，CD34+CD38_CD45dim)的结合。将原代AML样品与I μ M PU-H71-FITC2在37°C下一起培育4小时。细胞用CD34、CD38、CD45和7-AAD染色，接着进行流式细胞术分析。PU-H71与LSC的结合显示为活细胞(7-AAD阴性)中的平均荧光强度(MFI)。(B)在用ΙμΜ PUH71处理48小时后LSC相对于来自三个原代AML样品的未经处理对照的活力百分比。细胞在膜联蛋白V和7-AAD染色前用⑶45、⑶34和⑶38染色。LSC活力通过流式细胞术来测量并且确定为⑶45dim⑶34+⑶38-门的膜联蛋白V-/7AAD-百分比。
[0117]图24.肿瘤的不同的[124I]-PU_H71吸收指示其“致癌HSP90”含量有差异，因此其对HSP90疗法的反应有差异。若干乳癌患者中[124I]-PU-H71注射后24小时的[124I]-PU-H7IPET影像测量为最大标准化吸收值(SUVmax)。BC=乳癌。TNBC-三阴性BC。
[0118]图25.如通过PET测定，在投予[124I]-PU_H71后，对HSP90抑制疗法起反应的选定数目的患者的肿瘤:肌肉SUV比率。这些患者中，肿瘤:肌肉SUV随时间推移而增加。呈现针对若干阳性和阴性肿瘤平均的值。
[0119]图26.患有套细胞淋巴瘤的患者的FDG/CT和[124I]-PU_H71PET/CT。患者展示在注射[124I]-PU-H71后30分钟清晰可见病变。在后期(3.5-24小时和24小时以上)在此肿瘤中未看见[124I]-PU-H71吸收。
[0120]图27.两个指示的淋巴结(LN)中复发性乳癌患者的[124I]-PU_H71PET/CT。对[124I]-PU-H71注射后若干时间(0.1,0.4,0.6,3.5和21.4小时)的PET定量，并且对于10mg/m2的PU-H71的投予剂量，将针对[124I]-PU-H71获得的SUVmax数据转变为HSP90i浓度。还计算在O到24小时的时间内两个肿瘤对ro-H71的暴露并且表示为曲线下面积(AUC)。CT (左)、PU-PET/CT (中间)和FDG-PET/CT联合(右)经轴影像显示在一个患病淋巴结而不是在另一个中的[124I]-PU-H71-亲合力，表明气管支气管左前角淋巴结(TAALN)中的病变对HSP90疗法起反应的可能性低于气管支气管左角LN (TALN)0
[0121]图28.用1241-PU_H71PET对三阴性乳癌患者成像。在注射后20分钟，吸收在肺肿块(左箭头)和骨头病变(右箭头)中显著(A)，但在24小时，仅在肺病变中看见吸收(B)。肺和骨头肿瘤都通过CT和FDG-扫描确认(C)。患者开始用HSP90抑制剂STA-9090处理。HSP90抑制剂处理后二十天，如通过CT和FDG-PET两者证明，肺而不是骨头病变的尺寸明显下降(D)。
[0122]图29.气管旁淋巴结中转移性HER2乳癌患者的[124I]-PU-H71PET/CT。[124I]-PU-H71后或[124I]-PU-H71与10mg/m2PU_H71共注射后的指示时间的PET影像测量为最大标准化吸收值(SUVmax)。对于10mg/m2的PU-H71的投予剂量，将针对[124I]-PU-H71获得的SUV数据转变为HSP90i浓度。还计算在O到48小时的时间内两个肿瘤对PU-H71的暴露并且表示为曲线下面积(AUC)。在共注射[124I]-PU-H71/PU-H71后如从[124I]-PU-H7IPET估计或如从[124I]-PU-H71PET测定的PU-H71的肿瘤浓度(以微摩尔值为单位)是相当的。
[0123]图30.[124I]-PU-H71PET是一种用于HSP90抑制剂的非侵入性分析。(a)PU_H71和[124I]-PU-H71的化学结构。(b) MDA-MB-468肿瘤负载小鼠中[124I]-PU-H71的代表性PET扫描。肿瘤的位置由红色箭头指示。(c)投予后指示时间的[124I]-PU-H71肿瘤对器官活性浓度比率。(d) MDA-MB-468肿瘤和血浆(n=5)中[mI]_PU_H71的生物学分布。肿瘤-S和肿瘤-L分别是小的和大的肿瘤。(插图)使用如在GraphPad Prism中实施的线性回归曲线拟合，分析PU-H71从肿瘤的24到140小时缓慢终末清除期。
[0124]图31.[124I]-PU_H71PET准确地预测肿瘤中治疗有效PU-H71浓度的递送。(a)预测的PU-H71肿瘤分布基于由[124I]-PU-H71PET产生的平均％ID/g (下图)。投予指示ro_H71剂量后指示时间的预测肿瘤浓度(上图)。(b)在投予75mg/kg药剂后的肿瘤TO-H71浓度(n=5)如通过[124I]-PU-H7IPET 预测，并且在共注射[124I]-PU-H71 和 PU-H71 后由 LC-MS/MS测定并由[124I]-PU-H71PET测定。(c、d)以指示剂量投予TO-H71并在投予后24小时分析的MDA-MB-468肿瘤(c )以及用指示浓度的ro-H71处理24小时的MDA-MB-468细胞(d)的代表性蛋白质印迹分析。印迹(n=3)由密度测定法定量并且蛋白质水平的变化相对于TO-H71的浓度绘图(右图)。(e、f)在示踪量的[124I]-PU-H71与指示剂量的PU-H71混合进行共投予后如通过[124I]-PU-H71PET预测的投予后24小时标靶占有率。
[0125]图32.[124I]-PU-H71PET预测HSP90疗法的有效剂量方案的设计。(a)当以一周3次(星期一-星期三-星期五，星期六/星期天中断)的时程以指示剂量投予2周时基于由[124I]-PU-H7IPET获得的平均肿瘤活性浓度(％ID/g)预测的PU-H71肿瘤分布。(插图)肿瘤中PU-H71的AUC使用GraphPad Prism计算。(b)用指示剂量的PU-H71处理48小时的MDA-MB-468细胞的活力通过溴化乙锭/吖啶橙染色分析(上图)。通过[124I]-PU-H71PET估计的诱发的肿瘤细胞凋亡预测指示的平均和最小PU-H71肿瘤浓度。(c)以一周3次的时程向MDA-MB-468肿瘤负载小鼠(n=5)腹膜内投予指示剂量的TO-H71。肿瘤体积和小鼠重量在指示的处理时间内监测。(d)以一周3次的时程向MDA-MB-468肿瘤负载小鼠(n=5)腹膜内投予指示剂量的PU-H71。肿瘤体积和小鼠重量在指示的处理时间内监测。(e)当以一周3次(星期一-星期三-星期五，星期六/星期天中断)的时程以指示剂量投予时，基于由[124I]-PU-H7IPET获得的平均肿瘤活性浓度(％ID/g)预测的PU-H71肿瘤分布。(f)在星期四，即上次剂量投予后24小时处死的经媒剂(对照)和TO-H71 (5mg/kg)处理的肿瘤的蛋白质印迹分析。针对每一肿瘤指示如由LC-MS/MS测定的PU-H71肿瘤浓度。(f)来自图(d)的数据分析(n=5)。
[0126]图33.[124I]-PU-H7IPET预测HSP90疗法的有效时程方案的设计。(a)当以指示的时程以75mg/kg投予时，基于由[124I] -PU-H7IPET获得的平均肿瘤活性浓度(％ID/g)的预测的PU-H71肿瘤分布。(b)如从体外分析预测，通过指示的平均和最小PU-H71肿瘤浓度估计的诱发的肿瘤细胞凋亡。(c)以指示的时程向MDA-MB-468肿瘤负载小鼠(n=5)腹膜内投予PU-H71 (75mg/kg)。肿瘤体积和小鼠重量在指示的处理时间内监测。以一周I次的时程，在星期四给药，在上次剂量投予后24小时处死，以及在星期四给药，在上次剂量投予后96小时处死得到的经PU-H71 (75mg/kg)处理的肿瘤的蛋白质印迹(d)和LC-MS/MS分析(e)。对照；仅媒剂处理的小鼠。
[0127]图34.针对患有转移到肺的疾病的胰腺患者和指示的淋巴结，如通过I3U-PET预测的肿瘤对PU-H71的暴露。肿瘤浓度是基于20mg/m2的投予剂量计算。血浆暴露也以红色展示。时间O到192小时的计算的AUC ( μ M-h)列表在右侧。
[0128]图35.肺中患有复发性疾病的胰腺癌患者的[124I]-PU_H71PET/CT。对[124I]-PU-H71注射后指示时间(48和196小时，左图)的PET影像定量，并且对于ro_H71的指示投予剂量，将针对[124I]-PU-H71获得的SUV数据转变为肿瘤中的PU-H71浓度。还计算以一周两次(星期二和星期五)的时程和20、60和80mg/m2的投予剂量(右上图和下图)处理两周的两个肿瘤(一个在左肺并且另一个在右肺门LN)在O到336小时的时间内对PU-H71的暴露，并且表示为曲线下面积(AUC)并且为平均肿瘤浓度。
[0129]图36.图A展示如从PU-PET中获得的在乳癌患者的肿瘤中O到72小时内的1241-PU-H71的生物学分布。数据用以模拟当在周末中断下一周两次持续两周，在周末中断下一周三次持续两周，在周末中断下一周一次持续两周，以及在周末中断下一周五次持续两周给予时肿瘤对10mg/m2的投予剂量的暴露。
[0130]图37.[124I]-PU-H7IPET预测对HSP90疗法的反应程度。(a)当以指示剂量和指示时程投予时ro-H71对肿瘤HSP90位点的预期平均占有率。(b、c)在GraphPad Prism中分析肿瘤HSP90位点占有率与观测到的抗肿瘤作用的相关性。
[0131]图38.1241-PU-H71PET分析在HSP90抑制剂的临床开发中的用途:(a)测定实现有效肿瘤浓度所需的HSP90抑制剂的剂量、选择适于HSP90疗法的患者和设计有效的剂量和时程方案；(b)分析递送到肿瘤的药物的实际浓度并且预测HSP90疗法的临床结果；以及
(c)测定“最大肿瘤剂量”。CR=完全反应，PR=部分反应，NR=无反应。
[0132]图39.MDA-MB-468 异种移植 TNBC 小鼠中[124I]-PU-DZ13 和[124I]-PU-H71 的体内PET成像。在R4或FOCuS120专用小动物PET扫描器(田纳西州诺克斯维尔的康科德微系统公司(Concord Microsystems, Inc., Knoxville, TN))上进行 PET 成像；在专用小动物 CT 扫描器(田纳西州橡树岭的爱姆替科公司(ImTek, Inc.，Oak Ridge, TN))上,使用专用立体定向约束装置进行分开的解剖成像。CT和PET影像数据集的最大强度投影(MIP)在解剖学上记录，并且使用PET和CT数据的阿尔法透明掺合产生重叠影像。
[0133]图40.BC的情况展示对TO-H71的剂量依赖性反应。当肿瘤对TO-H71高度敏感时H&E染色的载片显示含有核浓缩细胞(指示早期细胞凋亡)与核破裂细胞(表示晚期细胞凋亡)的细胞凋亡显著区域。(A)对用指示浓度的PU-H71处理48小时的TNBC样品中细胞凋亡/细胞死亡定量并且相对于PU-H71的浓度绘图。细胞凋亡与坏死性/晚期细胞凋亡细胞都进行计数并且添加到如y轴上描绘的细胞凋亡％。注意，在三个敏感性群组中的一连串情况(最陡峭的上部曲线，最敏感，LNl5和LN16 ；中间曲线，敏感，PT12、PT17、PT25、PT28和LNlO ;以及下部曲线，不太敏感、PT10、PT15、PT16和PT30)。有趣地，淋巴结转移展示在同等剂量下比原发性肿瘤敏感性高。PT=原发性肿瘤，LN=淋巴结。对TO-H71最敏感的肿瘤也针对P-Akt高度染色。(B)与(A)相同，使用来自用PU-H71处理24或48小时的HER2+、TNBC和ER+BC患者的样品。
[0134]图41.对HSP90抑制的细胞凋亡敏感性与细胞存活对AKT-和STAT-通路而不是MEK-通路的依赖性有关。(A)、(B)代表性AML细胞与指示浓度的HSP90、AKT、JAK和MEK抑制剂一起培育指示的时间，并且使用吖啶橙/溴化乙锭方法评估细胞凋亡。数据与从多个重复实验(η >3)中获得的数据一致。点，平均值；棒，标准偏差。(C)来自仅仅用AKT1、MEKi和JAKi处理72小时的细胞的细胞凋亡％值相对于在HSP90抑制剂处理后获得的值绘图，并且如Prism4.0中实施，进行线性回归分析。
[0135]图42.具有最高水平P-STAT5的AML原代细胞也对ro_H71最敏感。(A)胚细胞中磷酸化STAT5水平(⑶45dim门控)表示为三个不同原代AML样品的平均荧光强度(MFI )。Stat5的磷酸化水平通过流式细胞术评估。(B)在用I μ M PUH71处理48小时后AML胚细胞相对于来自三种原代AML样品的未经处理对照的活力百分比。细胞在膜联蛋白V和7-AAD染色前用CD45染色。AML胚细胞的活力通过流式细胞术来测量并且确定为针对AML胚细胞的⑶45dim对比SSC门的膜联蛋白V-/7AAD-百分比。
[0136]图43.向8-10月龄的3xTg小鼠投予(A)75mg/kg或(B)指示剂量的HSP90抑制剂PU-HZ151并且在投予后24小时，在海马区(在此AD模型中受折磨的脑部区)中测量H)标记物HSP70。当HSP90被抑制时诱发HSP70，并且其诱发指示治疗水平的HSP90抑制剂递送到相关的脑部区域。(C)在投予50mg/kg PU-HZ151后通过LC-MS/MS测定指示的脑部区域和血浆中HSP90抑制剂的水平。在单次腹膜内注射后不同时间的Hsp90抑制剂水平以微摩尔单位展示。脑暴露也测量为曲线下面积(AUC)。
[0137]图44.PU-H71对HSP90具有选择性。(A)若干HSP90抑制剂珠粒下拉物的考马斯染色凝胶(Coomassie stained gel)。将K562溶解产物(60 μ g)与25 μ L指示珠粒一起培育。用指示的缓冲液洗涤后，下拉物中的蛋白质施加于SDS-PAGE凝胶。(B)PU-H71( 10 μ Μ)在scanMAX筛(阿姆比特公司(Ambit))中针对359种激酶测试。呈现ro_H71的TREEspot?相互作用图。仅SNARK (NUAK家族SNFl-样激酶2)(激酶树上的红点)表现为靶向小分子的潜在低亲和力激酶。
【具体实施方式】
[0138]5.1.作为肿瘤特异性生物标记物的致癌HSP90
[0139]本发明证明了不仅仅是由HSP90表达决定的此具体“致癌HSP90”物质的丰度预测对HSP90抑制疗法的敏感性并且因此是HSP90疗法的生物标记物。本发明还证明了鉴别和测量肿瘤内此致癌HSP90物质的丰度预测对HSP90疗法的反应。
[0140]在以下部分中，展示HSP90抑制剂PU-H71靶向肿瘤富集的HSP90复合物和以亲和力捕获HSP90依赖性致癌客户蛋白。化合物TO-H71在以引用的方式并入本文中的美国专利第7，834，181号中公开。TO-H71具有以下化学结构:
[0141]
【权利要求】
1.一种用于确定肿瘤是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含以下步骤: (a)使所述肿瘤或含有来自所述肿瘤的细胞的样品与优先结合于肿瘤或肿瘤细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式的放射性标记的HSP90抑制剂接触； (b)测量结合于所述肿瘤或所述样品中所述肿瘤细胞的放射性标记的HSP90抑制剂的量；以及 (C)将步骤(b)中测量的结合于所述肿瘤或所述样品中所述肿瘤细胞的放射性标记的HSP90抑制剂的量与结合于参考的放射性标记的HSP90抑制剂的量比较； 其中步骤(b)中测量的结合于所述肿瘤或所述肿瘤细胞的放射性标记的HSP90抑制剂的量比所述参考量大表明所述肿瘤将可能对所述HSP90抑制剂起反应。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)中测量的结合于所述肿瘤或所述肿瘤细胞的放射性标记的HSP90抑制剂的量与所述参考量相比的比率越大，对所述HSP90抑制剂疗法的所述可能反应的程度越大。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中测量的结合于所述肿瘤或所述肿瘤细胞的放射性标记的HSP90抑制剂的量越大，对所述HSP90抑制剂疗法的所述可能反应的程度越大。
4.根据权利要求1所述的方法，其中结合于正常细胞的所述放射性标记的HSP90抑制剂的所述参考量是结合于含有来自所述肿瘤的细胞的所述样品中的正常细胞的所述放射性标记的HSP90抑制剂的量。
5.根据权利要求1所述的方法，其中结合于正常细胞的所述放射性标记的HSP90抑制剂的所述参考量是结合于参考样品中的正常细胞的所述标记的HSP90抑制剂的预定量。
6.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中所述放射性标记的HSP90抑制剂经124I或131I标记。
7.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的方法，其中所述肿瘤与选自由以下组成的群组的癌症有关:结肠直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、多发性骨髓瘤、基底细胞癌、黑色素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌在内的肺癌、乳癌、成神经细胞瘤、脊髓增生性病症、包括胃肠道基质肿瘤在内的胃肠道癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、肛门癌、包括神经胶质瘤在内的脑肿瘤、包括滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤在内的淋巴瘤以及包括卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌在内的妇科癌症。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述癌症是乳癌。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述癌症是肺癌。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述癌症是淋巴瘤。
11.根据权利要求7所述的方法，其中所述癌症是胃癌。
12.根据权利要求7所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤细胞是肿瘤干细胞。
14.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中所述肿瘤进行接触并且存在于个体中。
15.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中所述含有肿瘤细胞的样品进行接触并且是组织样品。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述放射性标记的HSP90抑制剂是待作为疗法投予的所述HSP90抑制剂的标记形式。
17.根据权利要求1到16中任一权利要求所述的方法，其中待作为疗法投予的所述HSP90抑制剂是ro-H71或PU-H71的类似物、同系物或衍生物。
18.根据权利要求1到17中任一权利要求所述的方法，其中所述放射性标记的HSP90抑制剂是TO-H71或PU-H71的类似物、同系物或衍生物的形式。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述放射性标记的HSP90抑制剂是PU-H71的形式。
20.根据权利要求1到19中任一权利要求所述的方法，其中所述放射性标记的HSP90抑制剂是[124I]-PU-H71。
21.一种用于确定实体或液体肿瘤是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含以下步骤: (a)向所述患者投予优先结合于所述肿瘤中或所述肿瘤的肿瘤细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式的放射性标记的HSP90抑制剂； (b)在步骤(a)中所述投予后一个或一个以上时间点测量所述患者的肿瘤对所述放射性标记的HSP90抑制剂的吸收； (c)在步骤(a)中所述投 予后所述一个或一个以上时间点测量所述患者的预定健康组织对所述放射性标记的HSP90抑制剂的吸收； (d)计算步骤(b)中在多个时间点测量的所述吸收与步骤(C)中在相同时间点测量的所述吸收的比率；以及 (e)确定所述肿瘤将对使用所述HSP90抑制剂的疗法起反应的所述可能性， 其中在一个或多个时间点步骤(d)中计算的比率超过2指示所述肿瘤将可能起反应。
22.根据权利要求21所述的方法，其中在一个或多个时间点步骤(d)中计算的比率超过2.5指示所述肿瘤将可能起反应。
23.根据权利要求22所述的方法，其中在一个或多个时间点步骤(d)中计算的比率超过3指示所述肿瘤将可能起反应。
24.根据权利要求21到23中任一权利要求所述的方法，其中所述肿瘤与选自由以下组成的群组的癌症有关:结肠直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、基底细胞癌、黑色素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌在内的肺癌、乳癌、成神经细胞瘤、包括胃肠道基质肿瘤在内的胃肠道癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、肛门癌、包括神经胶质瘤在内的脑肿瘤、包括滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤在内的淋巴瘤以及包括卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌在内的妇科癌症。
25.根据权利要求21到24中任一权利要求所述的方法，其中所述癌症是乳癌、淋巴瘤、成神经细胞瘤、胃癌或胰腺癌。
26.根据权利要求21到25中任一权利要求所述的方法，其中所述放射性标记的HSP90抑制剂是待作为疗法投予的所述HSP90抑制剂的放射性标记形式。
27.根据权利要求21到26中任一权利要求所述的方法，其中待作为疗法投予的所述HSP90抑制剂是PU-H71或PU-H71的类似物、同系物或衍生物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述放射性标记的HSP90抑制剂是ro_H71的放射性标记形式。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述PU-H71的放射性标记形式是[124I]-PU-H71。
30.一种用于确定可成像肿瘤是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含以下步骤: (a)向所述患者投予优先结合于所述肿瘤中或所述肿瘤的肿瘤细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式的放射性标记的HSP90抑制剂； (b)在步骤(a)中所述投予后4小时以上的一个或一个以上时间点测量所述患者的肿瘤对所述放射性标记的HSP90抑制剂的吸收， 其中相对于所述肿瘤周围的健康组织中的吸收，在所述一个或一个以上时间点所述抑制剂的吸收表明所述肿瘤将可能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应。
31.根据权利要求30所述的方法，其中在步骤(a)中投予后8小时或8小时以上的一个或一个以上时间点测量放射性标记的HSP90抑制剂的所述吸收。
32.根据权利要求30或权利要求31所述的方法，其中所述放射性标记的HSP90抑制剂是待作为疗法投予的所述HSP90抑制剂的放射性标记形式。
33.根据权利要求30到32中任一权利要求所述的方法，其中待作为疗法投予的所述HSP90抑制剂是ro-H71或PU-H71的类似物、同系物或衍生物。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述放射性标记的HSP90抑制剂是TO-H71的放射性标记形式。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述PU-H71的放射性标记形式是[124I]-PU-H71。
36.根据权利要求30到35中任一权利要求所述的方法，其中所述肿瘤与选自由以下组成的群组的癌症有关:结肠直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、基底细胞癌、黑色素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌在内的肺癌、乳癌、成神经细胞瘤、包括胃肠道基质肿瘤在内的胃肠道癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、肛门癌、包括神经胶质瘤在内的脑肿瘤、包括滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤在内的淋巴瘤以及包括卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌在内的妇科癌症。
37.根据权利要求30到36中任一权利要求所述的方法，其中所述癌症是乳癌、淋巴瘤、成神经细胞瘤、胃癌或胰腺癌。
38.一种用于确定可成像肿瘤是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含以下步骤: (a)向所述患者投予优先结合于所述肿瘤中或所述肿瘤的肿瘤细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式的放射性标记的HSP90抑制剂； (b)在步骤(a)中所述放射性标记的HSP90抑制剂投予后2个小时或2个小时以上的一个或一个以上时间点通过PET目视检查所述放射性标记的抑制剂在所述肿瘤中或在所述肿瘤的肿瘤细胞中的吸收， (c)在一个或一个以上时间点将步骤(b)中获得的PET影像与在所述肿瘤周围的健康组织中获得的PET影像比较； 其中在所述一个或一个以上时间点所述肿瘤中或所述肿瘤的肿瘤细胞中所述PET影像中的明亮区域的存在表明所述患者将可能对HSP90抑制疗法起反应。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述PET影像在步骤(a)投予所述放射性标记的HSP90抑制剂后4小时或4小时以上的一个或一个以上时间点取得。
40.根据权利要求38或权利要求39所述的方法，其中所述放射性标记的HSP90抑制剂是待作为疗法投予的所述HSP90抑制剂的放射性标记形式。
41.根据权利要求38到40中任一权利要求所述的方法，其中待作为疗法投予的所述HSP90抑制剂是ro-H71或PU-H71的类似物、同系物或衍生物。
42.根据权利要 求41所述的方法，其中所述放射性标记的HSP90抑制剂是TO-H71的放射性标记形式。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述PU-H71的放射性标记形式是[124I]-PU-H71。
44.根据权利要求38到43中任一权利要求所述的方法，其中所述肿瘤与选自由以下组成的群组的癌症有关:结肠直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、基底细胞癌、黑色素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌在内的肺癌、乳癌、成神经细胞瘤、包括胃肠道基质肿瘤在内的胃肠道癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、肛门癌、包括神经胶质瘤在内的脑肿瘤、包括滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤在内的淋巴瘤以及包括卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌在内的妇科癌症。
45.根据权利要求38到44中任一权利要求所述的方法，其中所述癌症是乳癌、淋巴瘤、成神经细胞瘤、胃癌或胰腺癌。
46.一种用于确定表达致癌HSP90的特定肿瘤是否将可能对使用界定剂量的HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含以下步骤: (a)向患有所述肿瘤的患者投予优先结合于所述肿瘤中或所述肿瘤的肿瘤细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式的所述HSP90抑制剂的放射性标记形式； (b)在步骤(a)中所述投予后一个或一个以上时间点测量所述患者的肿瘤对所述HSP90抑制剂的所述放射性标记形式的吸收； (c)基于步骤(b)中在所述一个或一个以上时间点测量的所述吸收,针对所述HSP90抑制剂的所述界定剂量，计算在所述一个或一个以上时间点中的每一个在所述患者的肿瘤中存在的所述HSP90抑制剂的浓度；以及 (d)将步骤(c)中计算的所述肿瘤对所述HSP90抑制剂的暴露与在所述一个或一个以上时间点所述肿瘤中存在的使所述HSP90抑制剂有效治疗所述肿瘤所需的对所述HSP90抑制剂的参考暴露比较， 其中如果步骤(c)中计算的所述肿瘤对所述HSP90抑制剂的暴露将等于或超过所述参考暴露，那么所述肿瘤将可能对使用所述界定剂量的所述HSP90抑制剂的疗法起反应。
47.一种用于确定可成像肿瘤是否将可能对使用界定剂量的HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含以下步骤: (a)向所述患者投予优先结合于所述肿瘤中或所述肿瘤的肿瘤细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式的所述HSP90抑制剂的放射性标记形式； (b)在步骤(a)中所述投予后一个或一个以上时间点测量所述患者的肿瘤对所述HSP90抑制剂的所述放射性标记形式的吸收；(C)基于步骤(b)中在所述一个或一个以上时间点测量的所述吸收,针对所述HSP90抑制剂的所述界定剂量，计算在所述一个或一个以上时间点中的每一个在所述患者的肿瘤中存在的所述HSP90抑制剂的浓度；以及 (d)将步骤(c)中计算的所述HSP90抑制剂的浓度与在所述一个或一个以上时间点在所述肿瘤中存在的使所述HSP90抑制剂有效治疗所述肿瘤所需的所述HSP90抑制剂的参考浓度比较， 其中如果步骤(c)中计算的所述HSP90抑制剂的浓度将等于或超过所述参考浓度，那么所述肿瘤将可能对使用所述界定剂量的所述HSP90抑制剂的疗法起反应。
48.根据权利要求46或权利要求47所述的方法，其中所述PU-H71的放射性标记形式是[124I]-PU-H71。
49.根据权利要求46到48中任一权利要求所述的方法，其中所述肿瘤与选自由以下组成的群组的癌症有关:结肠直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、基底细胞癌、黑色素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌在内的肺癌、乳癌、成神经细胞瘤、包括胃肠道基质肿瘤在内的胃肠道癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、肛门癌、包括神经胶质瘤在内的脑肿瘤、包括滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤在内的淋巴瘤以及包括卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌在内的妇科癌症。
50.一种用于确定使用HSP90抑制剂的疗法对可成像肿瘤投予的有效剂量和频率的方法，其包含以下步骤: (a)向所述患者投予优先结合于肿瘤或肿瘤细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式的所述HSP90抑制剂的放射性 标记形式； (b)在步骤(a)中所述投予后一个或一个以上时间点测量所述患者的肿瘤对所述HSP90抑制剂的所述放射性标记形式的吸收；以及 (c)基于步骤(b)中在所述一个或一个以上时间点测量的所述吸收，计算在所述一个或一个以上时间点中的每一个维持所述肿瘤中有效治疗所述肿瘤的所述HSP90抑制剂的浓度所需的投予剂量和频率，由此确定使用所述HSP90抑制剂的疗 法对于癌症患者投予的有效剂量和频率。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述肿瘤与选自由以下组成的群组的癌症有关:结肠直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、基底细胞癌、黑色素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌在内的肺癌、乳癌、成神经细胞瘤、包括胃肠道基质肿瘤在内的胃肠道癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、肛门癌、包括神经胶质瘤在内的脑肿瘤、包括滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤在内的淋巴瘤以及包括卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌在内的妇科癌症。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述癌症是乳癌、淋巴瘤、成神经细胞瘤、胃癌或胰腺癌。
53.根据权利要求50到52中任一权利要求所述的方法，其中所述放射性标记的HSP90抑制剂是待作为疗法投予的所述HSP90抑制剂的放射性标记形式。
54.根据权利要求53所述的方法，其中待作为疗法投予的所述HSP90抑制剂是ro_H71或PU-H71的类似物、同系物或衍生物。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述放射性标记的HSP90抑制剂是TO-H71的放射性标记形式。
56.根据权利要求50到55中任一权利要求所述的方法,其中所述PU-H71的放射性标记形式是[124I]-PU-H71。
57.一种用于确定癌症患者中可成像肿瘤中存在的HSP90抑制剂的浓度的方法，其包含以下步骤: (a)向所述患者共投予预定量的所述HSP90抑制剂和预定量的所述HSP90抑制剂的放射性标记形式，所述HSP90抑制剂优先结合于肿瘤或肿瘤细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式； (b)在步骤(a)中所述共投予后一个或一个以上预定时间点周期性地测量所述患者的肿瘤对所述放射性标记的HSP90抑制剂的吸收；以及 (c)基于步骤(b)中所述放射性标记的HSP90抑制剂的所述吸收的测量，确定在任何所述时间点所述肿瘤中存在的所述HSP90抑制剂的浓度。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述肿瘤与选自由以下组成的群组的癌症有关:结肠直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、基底细胞癌、黑色素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌在内的肺癌、乳癌、成神经细胞瘤、包括胃肠道基质肿瘤在内的胃肠道癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、肛门癌、包括神经胶质瘤在内的脑肿瘤、包括滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤在内的淋巴瘤以及包括卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌在内的妇科癌症。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述癌症是乳癌、淋巴瘤、成神经细胞瘤、胃癌或胰腺癌。
60.根据权利要求57到59中任一权利要求所述的方法，其中所述放射性标记的HSP90抑制剂是待作为疗法投予的所述HSP90抑制剂的放射性标记形式。
61.根据权利要求60所述的方法，其中待作为疗法投予的所述HSP90抑制剂是ro-H71或PU-H71的类似物、同系物或衍生物。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述放射性标记的HSP90抑制剂是ro_H71的放射性标记形式。
63.根据权利要求57到62中任一权利要求所述的方法，其中所述TO-H71的放射性标记形式是[124I]-PU-H71。
64.一种用于确定癌症患者中可成像肿瘤对使用HSP90抑制剂的疗法的反应的方法，其包含以下步骤: (a)在所述患者接收所述HSP90抑制剂作为疗法的时期内一个或一个以上时间点向所述患者投予优先结合于肿瘤或肿瘤细胞中存在的HSP90的肿瘤特异性形式的所述HSP90抑制剂的放射性标记形式；以及 (b)在步骤(a)中所述投予后所述一个或一个以上时间点测量所述患者的肿瘤中所述放射性标记的HSP90抑制剂的浓度；以及 (c)将步骤(b)中测量的所述放射性标记的HSP90抑制剂的浓度与有效治疗所述肿瘤所需的所述HSP90抑制剂的最小浓度比较，其中测量的浓度超过治疗所述肿瘤所需的最小值表明所述患者可能对使用所述HSP90抑制剂的疗法起反应。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述肿瘤与选自由以下组成的群组的癌症有关:结肠直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、基底细胞癌、黑色素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌在内的肺癌、乳癌、成神经细胞瘤、包括胃肠道基质肿瘤在内的胃肠道癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、肛门癌、包括神经胶质瘤在内的脑肿瘤、包括滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤在内的淋巴瘤以及包括卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌在内的妇科癌症。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述癌症是乳癌、淋巴瘤、成神经细胞瘤、胃癌或胰腺癌。
67.根据权利要求64到66中任一权利要求所述的方法，其中所述放射性标记的HSP90抑制剂是待作为疗法投予的所述HSP90抑制剂的放射性标记形式。
68.根据权利要求64到67中任一权利要求所述的方法，其中待作为疗法投予的所述HSP90抑制剂是ro-H71或PU-H71的类似物、同系物或衍生物。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述放射性标记的HSP90抑制剂是ro_H71的放射性标记形式。
70.根据权利要求64到69中任一权利要求所述的方法，其中所述ro-H71的放射性标记形式是[124I]-PU-H71。
71.一种用于确定患者中存在的人类癌症是否将可能对使用HSP90抑制剂的疗法起反应的方法，其包含: (a)获得含有来自所述患者的癌症的细胞的样品，所述细胞仅仅表达HSP90蛋白质或除HSP70蛋白质外还表达HSP 90蛋白质； (b)针对步骤(a)中获得的所述样品中存在的所述细胞，评估至少一个以下参数的存在:活化AKT通路、PTEN肿瘤抑制因子功能或表达的缺陷、活化STAT5通路或Bcl_xL蛋白质表达；以及 (c)将步骤(b)中获得的所述评估与步骤(b)中评估的相同参数对于来自对使用所述HSP90抑制剂的疗法起反应的一个或一个以上癌症患者的人类癌细胞的预定参考评估比较，以便由此确定所述患者的癌症是否将可能对使用所述HSP90抑制剂的疗法起反应。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述人类癌症是乳癌。
73.根据权利要求71所述的方法，其中所述癌细胞与急性骨髓白血病有关。
74.一种具有以下化学式的化合物，
或其医药学上可接受的盐。
75.一种具有以下化学式的化合物，
或其医药学上可接受的盐。
76.一种具有以下化学式的化合物，
或其医药学上可接受的盐。
77.一种具有以下化学式的化合物，
或其医药学上可接受的盐。
78.—种具有以下化学式的化合物，
或其医药学上可接受的盐。
79.一种医药组合物，其包含根据权利要求74到78中任一权利要求所述的化合物。
80.一种治疗患有HSP90依赖性肿瘤的人类患者的方法，其包含向所述患者投予足够量的具有下式的化合物:
或其医药学上可接受的盐，以提供在所述化合物投予后约16小时到约24小时之间的至少一个时间点所述患者的肿瘤中所述致癌HSP90至少15%的占有率。
81.根据权利要求80所述的方法，其包含投予在10小时与24小时之间的整个范围内，足以提供所述患者的肿瘤中所述致癌HSP90至少15%的占有率的量到实现所述患者的肿瘤中所述致癌HSP90100%占有率的最小剂量的所述化合物。
82.—种治疗患有HSP90依赖性肿瘤的患者的方法，其包含向所述患者投予足够量的具有下式的化合物:
或其医药学上可接受的盐，以在投予后约24小时提供在约0.3 μ M到约7.5 μ M范围内的肿瘤浓度。
83.一种治疗患有HSP90依赖性肿瘤的患者的方法，其包含向所述患者投予足够量的具有下式的化合物:
或其医药学上可接受的盐，以在投予后约48小时提供在约0.05 μ M到约3.5 μ M范围内的肿瘤浓度。
84.—种治疗患有HSP90依赖性肿瘤的患者的方法,其包含向所述患者投予足够量的具有下式的化合物:
或其医药学上可接受的盐，以在新的治疗周期开始后提供约150到约4，000 μ M-h的AUC0_33ai。
85.一种治疗患有HSP90依赖性肿瘤的患者的方法，其包含向所述患者投予足够量的具有下式的化合物:
或其医药学上可接受的盐，以在新的治疗周期开始后提供约75到约2，000 μ M-h的AUC0_16ffil。
86.一种治疗患有HSP90依赖性肿瘤的患者的方法，其包含向所述患者投予足够量的具有下式的化合物:
或其医药学上可接受的盐，以在O与336小时之间提供约0.5μΜ到约7.5μΜ的[PU-H71]avg。
87.一种治疗患有HSP90依赖性肿瘤的患者的方法，其包含根据选自一周一次、一周两次以及一周两次接着中断一周的给药时程，以约5mg/m2到约250mg/m2范围内的剂量向所述患者静脉内投予足够量的具有下式的化合物:
或其医药学上可接受的盐。
【文档编号】G01N33/50GK104081203SQ201280040632
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2012年7月6日 优先权日:2011年7月8日
【发明者】加布里拉·奇奥斯, 那加瓦拉基肖尔·佩拉塞提, 詹森·S·路易斯, 史蒂文·M·拉尔森, 托尼·塔尔多内, 玛丽·L·阿尔波, 艾瑞卡·M·戈梅斯-达伽马 申请人:斯隆-凯特林癌症研究所