作为选择性IFN－γ途径抑制剂的人抗IFN－γ中和性抗体的制作方法

专利名称：作为选择性IFN－γ途径抑制剂的人抗IFN－γ中和性抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及结合γ干扰素(IFN-γ)的人单克隆抗体。还涉及治疗由IFN-γ介导的疾病的组合物和方法。
背景干扰素(IFN)起初是由于它们干扰宿主细胞的病毒感染的能力而得以命名(Isaacs和Lindenman，1957，Proc.R.Soc.14728-267)。自从发现它们以来，多种干扰素家族的成员已被鉴定具有抗病毒防御之外的各种生物学作用，包括细胞生长和细胞免疫。干扰素类型IFN-α、IFN-β、IFN-ω和IFN-τ是I型干扰素并且结合I型干扰素抗体，而IFN-γ是II型干扰素并且结合II型干扰素抗体(Pfeffer等，1998，Cancer Res.582489-2499)。
IFN-γ发出信号依赖于至少5种不同的蛋白质IFNGR1和IFNGR2(IFN-γ受体的亚基)，Jak1、Jak2和转录因子STAT1(Schindler和Darnell，1995，Annu.Rev.Biochem.64621-651；Bach等，1997，Annu.Rev.Immunol.15563-591)。IFN-γ受体在大多数细胞类型中发现，除了成熟红细胞(Farrar和Schreiber，1993，Annu.Rev.Immunol.11571-611)。Jak1、Jak2和STAT1介绍IFN-γ发出信号。
IFN-γ调控多种生物学功能，如抗病毒反应、细胞生长、免疫反应和肿瘤抑制，并且IFN-γ可以介导多种人类疾病。因而，在本领域需要能够调节IFN-γ生物学活性的药剂。
发明概述本发明提供结合γ干扰素(IFN-γ)的单克隆抗体和编码它们的多核苷酸。这些抗体可以抑制或调节IFN-γ的至少一种生物学活性并且能对改善IFN-γ介导疾病的效应有用。本发明还提供产生本发明的单克隆抗体并将其分泌入细胞培养基中的杂交瘤。本发明的抗体能够对于治疗由IFN-γ介导的疾病有效。
在某些方面，本发明提供抗体、任选单克隆抗体和/或人抗体，它可以包含重链和轻链，其中重链包含如在SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列或其抗原结合或免疫学功能性免疫球蛋白片段。
在某些方面，本发明提供抗体，任选单克隆抗体和/或人抗体，它可以是包含重链和轻链的人抗体，其中重链包含IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区。在一些实施方案中，本发明的抗体包含如在SEQ ID NO2中所示IgG1重链恒定区的氨基酸序列或其抗原结合或免疫学功能性免疫球蛋白片段。
在某些方面，本发明的抗体包含重链和轻链，其中重链的可变区包含如在SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO14或SEQ ID NO30任何一个中所示的氨基酸序列，或其抗原结合或免疫学功能性免疫球蛋白片段。在其它的方面，轻链可变区包含SEQ ID NO8、SEQ IDNO12、SEQ ID NO16或SEQ ID NO31任何一个中所示的氨基酸序列，或其抗原结合或免疫学功能性免疫球蛋白片段。在其它的方面，重链包含如在SEQ ID NO17、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO21或SEQID NO32任何一个中所示的氨基酸序列，或其抗原结合或免疫学功能性免疫球蛋白片段。仍然在另外的方面，轻链包含如在SEQ ID NO18、SEQ ID NO 20、SEQ ID NO22或SEQ ID NO33任何一个中所示的氨基酸序列，或其抗原结合或免疫学功能性免疫球蛋白片段。
本发明还提供特异性结合到IFN-γ上的抗体，其中重链包含重链可变区，它包含如在SEQ ID NO6中所示的氨基酸序列，或其抗原结合或免疫学功能性免疫球蛋白片段，而轻链包含轻链可变区，它包含如在SEQ ID NO8中所示的氨基酸序列，或其抗原结合或免疫学功能性免疫球蛋白片段。
在某些方面，本发明还提供能够特异性结合到IFN-γ上和/或抑制或调节IFN-γ生物学活性的抗体或其免疫学功能性免疫球蛋白片段，其包含重链和轻链，其中重链包含重链可变区，其中重链可变区包含与如在SEQ ID NO6中所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大约99％同源性的序列，并且其中轻链包含轻链可变区，并且其中轻链可变区包含与如在SEQ IDNO8中所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大约99％同源性的序列，其中该抗体与IFN-γ相互作用。
本发明进一步提供能够抑制或调节IFN-γ的生物学活性的和/或特异性结合到IFN-γ上的抗体，其中重链包含含有如在SEQ ID NO10中所示氨基酸序列的重链可变区，或其抗原结合或免疫学功能性免疫球蛋白片段，轻链包含含有如在SEQ ID NO12中所示氨基酸序列的轻链可变区，或其抗原结合或免疫学功能性免疫球蛋白片段。
在某些方面，本发明提供能够抑制或调节IFN-γ的生物学活性的和/或特异性结合到IFN-γ上的抗体，其包含重链和轻链，其中重链包含重链可变区，其中重链可变区包含与如在SEQ ID NO10中所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大约99％同源性的序列，并且其中轻链包含轻链可变区，其中轻链可变区包含与如在SEQ ID NO12中所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大约99％同源性的序列，其中该抗体与IFN-γ相互作用。
本发明进一步提供能够抑制或调节IFN-γ的生物学活性的和/或特异性结合到IFN-γ上的抗体，其中重链包含含有如在SEQ ID NO30中所示氨基酸序列的重链可变区，或其抗原结合或免疫学功能性免疫球蛋白片段，轻链包含含有如在SEQ ID NO12中所示氨基酸序列的轻链可变区，或其抗原结合或免疫学功能性免疫球蛋白片段。
在某些方面，本发明提供能够抑制或调节IFN-γ的生物学活性的和/或特异性结合到IFN-γ上的抗体，其包含重链和轻链，其中重链包含重链可变区，其中重链可变区包含与如在SEQ ID NO30中所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大约99％同源性的序列，并且其中轻链包含轻链可变区，其中轻链可变区包含与如在SEQ ID NO12中所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大约99％同源性的序列，其中该抗体与IFN-γ相互作用。
本发明还提供能够抑制或调节IFN-γ的生物学活性的和/或特异性结合到IFN-γ上的抗体，其中重链包含含有如在SEQ ID NO14中所示氨基酸序列的重链可变区，或其抗原结合或免疫学功能性免疫球蛋白片段，轻链包含含有如在SEQ ID NO16中所示氨基酸序列的轻链可变区，或其抗原结合或免疫学功能性免疫球蛋白片段。
在某些方面，本发明提供能够抑制或调节IFN-γ的生物学活性的和/或特异性结合到IFN-γ上的抗体，其包含重链和轻链，其中重链包含重链可变区，其中重链可变区包含与如在SEQ ID NO14中所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大约99％同源性的序列，并且其中轻链包含轻链可变区，其中轻链可变区包含与如在SEQ ID NO16中所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大约99％同源性的序列，其中该抗体与IFN-γ相互作用。
本发明还提供能够抑制或调节IFN-γ的生物学活性的和/或特异性结合到IFN-γ上的抗体，其中重链包含含有如在SEQ ID NO14中所示氨基酸序列的重链可变区，或其抗原结合或免疫学功能性免疫球蛋白片段，轻链包含含有如在SEQ ID NO31中所示氨基酸序列的轻链可变区，或其抗原结合或免疫学功能性免疫球蛋白片段。
在某些方面，本发明提供能够抑制或调节IFN-γ的生物学活性的和/或特异性结合到IFN-γ上的抗体，其包含重链和轻链，其中重链包含重链可变区，其中重链可变区包含与如在SEQ ID NO14中所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大约99％同源性的序列，并且其中轻链包含轻链可变区，其中轻链可变区包含与如在SEQ ID NO31中所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大约99％同源性的序列，其中该抗体与IFN-γ相互作用。
本发明还提供能够抑制或调节IFN-γ的生物学活性的和/或特异性结合到IFN-γ上的抗体，其中重链包含如在SEQ ID NO17中所示氨基酸序列，或其抗原结合或免疫学功能性免疫球蛋白片段，轻链包含如在SEQ ID NO18中所示氨基酸序列，或其抗原结合或免疫学功能性免疫球蛋白片段。
在某些方面，本发明提供能够抑制或调节IFN-γ的生物学活性的和/或特异性结合到IFN-γ上的抗体，包含重链和轻链，其中重链包含重链可变区，其中重链可变区包含与如在SEQ ID NO17中所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大约99％同源性的序列，并且其中轻链包含轻链可变区，其中轻链可变区包含与如在SEQ ID NO18中所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大约99％同源性的序列，其中该抗体与IFN-γ相互作用。
本发明进一步提供能够抑制或调节IFN-γ的生物学活性的和/或特异性结合到IFN-γ上的抗体，其中重链包含如在SEQ ID NO19中所示氨基酸序列，或其抗原结合或免疫学功能性免疫球蛋白片段，轻链包含如在SEQ ID NO20中所示氨基酸序列，或其抗原结合或免疫学功能性免疫球蛋白片段。
在某些方面，本发明提供能够抑制或调节IFN-γ的生物学活性的和/或特异性结合到IFN-γ上的抗体，其包含重链和轻链，其中重链包含重链可变区，其中重链可变区包含与如在SEQ ID NO19中所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大约99％同源性的序列，并且其中轻链包含轻链可变区，其中轻链可变区包含与如在SEQ ID NO20中所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大约99％同源性的序列，其中该抗体与IFN-γ相互作用。
本发明还提供能够抑制或调节IFN-γ的生物学活性的和/或特异性结合到IFN-γ上的抗体，其中重链包含如在SEQ ID NO21中所示氨基酸序列，或其抗原结合或免疫学功能性免疫球蛋白片段，轻链包含如在SEQ ID NO22中所示氨基酸序列，或其抗原结合或免疫学功能性免疫球蛋白片段。
在某些方面，本发明提供能够抑制或调节IFN-γ的生物学活性的和/或特异性结合到IFN-γ上的抗体，其包含重链和轻链，其中重链包含重链可变区，其中重链可变区包含与如在SEQ ID NO21中所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大约99％同源性的序列，并且其中轻链包含轻链可变区，其中轻链可变区包含与如在SEQ ID NO22中所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大约99％同源性的序列，其中该抗体与IFN-γ相互作用。
本发明还提供能够抑制或调节IFN-γ的生物学活性的和/或特异性结合到IFN-γ上的抗体，其中重链包含如在SEQ ID NO32中所示氨基酸序列，或其抗原结合或免疫学功能性免疫球蛋白片段，轻链包含如在SEQ ID NO20中所示氨基酸序列，或其抗原结合或免疫学功能性免疫球蛋白片段。
在某些方面，本发明提供能够抑制或调节IFN-γ的生物学活性的和/或特异性结合到IFN-γ上的抗体，其包含重链和轻链，其中重链包含重链可变区，其中重链可变区包含与如在SEQ ID NO32中所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大约99％同源性的序列，并且其中轻链包含轻链可变区，其中轻链可变区包含与如在SEQ ID NO20中所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大约99％同源性的序列，其中该抗体与IFN-γ相互作用。
本发明还提供能够抑制或调节IFN-γ的生物学活性的和/或特异性结合到IFN-γ上的抗体，其中重链包含如在SEQ ID NO21中所示氨基酸序列，或其抗原结合或免疫学功能性免疫球蛋白片段，轻链包含如在SEQ ID NO33中所示氨基酸序列，或其抗原结合或免疫学功能性免疫球蛋白片段。
在某些方面，本发明提供能够抑制或调节IFN-γ的生物学活性的和/或特异性结合到IFN-γ上的抗体，其包含重链和轻链，其中重链包含重链可变区，其中重链可变区包含与如在SEQ ID NO21中所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大约99％同源性的序列，并且其中轻链包含轻链可变区，其中轻链可变区包含与如在SEQ ID NO33中所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大约99％同源性的序列，其中该抗体与IFN-γ相互作用。
本发明还提供单链抗体、单链Fv抗体、F(ab)抗体、F(ab)’抗体和F(ab’)2抗体。
在特定的方面，本发明提供一种含有如在SEQ ID NO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO31或SEQ ID NO33任何一个中所示氨基酸序列的轻链，或其抗原结合或免疫学功能性免疫球蛋白片段。
此外，本发明提供一种含有如在SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO14、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO30或SEQ ID NO32任何一个中所示氨基酸序列的重链，或其抗原结合或免疫学功能性免疫球蛋白片段。
本发明还涉及特异性结合IFN-γ的人抗体，其中该抗体包含(a)人重链框架区，一个人重链CDR1区，一个人重链CDR2区和一个人重链CDR3区，和(b)人轻链框架区，一个人轻链CDR1区，一个人轻链CDR2区和一个人轻链CDR3区。在某些方面，人重链CDR1区可以是如

图12中所示的单克隆抗体(mAb)1119、1118、1118*或1121的重链CDR1区和SEQID NO34，人轻链CDR1区可以是如图13中所示的mAbs 1119、1118、1121*或1121的轻链CDR1区和SEQ ID NO38、SEQ ID NO39或SEQ IDNO40。在其它的方面，人重链CDR2区可以是如图12中所示的mAb1119、1118、1118*或1121的重链CDR2区和SEQ ID NO35，人轻链CDR2区可以是如图13中所示的mAb 1119、1118、1121*或1121的轻链CDR2区和SEQ ID NO41或SEQ ID NO42。仍然在其它方面，人重链CDR3区为如图12中所示的mAb 1119、1118、1118*或1121的重链CDR3区和SEQ ID NO36或SEQ ID NO37，人轻链CDR3区为如图13中所示的mAb1119、1118、1121*或1121的轻链CDR3区和SEQ ID NO43或SEQ IDNO44。
此外，本发明提供治疗与IFN-γ增强的生产或与IFN-γ的敏感性相关联的疾病和/或由IFN-γ介导的疾病的方法，包括向需要的个体给药药学上有效量的一种或多种本发明的单克隆抗体或其抗原结合或免疫学功能性免疫球蛋白片段的步骤。
本发明还提供在生物学样品中检测IFN-γ的水平的方法，包括将样品与本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段相接触的步骤。
本发明还提供一种分离的抗体，它能够特异性结合到IFN-γ上和/或抑制或调节IFN-γ的生物学活性并包含重链CDR3，所述重链CDR3具有以下氨基酸序列(a)一种由SEQ ID NO36的至少7个氨基酸以与它们出现在SEQ ID NO36中的相同顺序和间隔所组成的氨基酸序列；或(b)一种含有SEQ ID NO37的氨基酸序列。该抗体能够进一步包含轻链CDR，所述轻链CDR3具有以下氨基酸序列(a)一种由SEQ ID NO43的至少8个氨基酸以与它们在SEQ ID NO43中的相同顺序和间隔所组成的氨基酸序列；或(b)一种由SEQ ID NO44的至少9个氨基酸以与它们在SEQ ID NO44中的相同顺序和间隔所组成的氨基酸序列。该抗体能够进一步包含一种或多种选自SEQ ID NO34、SEQ ID NO35、SEQ IDNO38、SEQ ID NO39、SEQ ID NO40、SEQ ID NO41和SEQ ID NO42的CDR。重链CDR3可以至少由SEQ ID NO36的氨基酸所组成而轻链CDR3可以至少由SEQ ID NO43的氨基酸所组成。
此外，本发明提供一种能够特异性结合到IFN-γ上和/或抑制或调节IFN-γ生物学活性的分离的抗体，它包含轻链CDR3，所述轻链CDR3具有以下氨基酸序列(a)一种由SEQ ID NO43的至少8个氨基酸以与它们在SEQ ID NO43中的相同顺序和间隔所组成的氨基酸序列；或(b)一种由SEQ ID NO44的至少9个氨基酸以与它们在SEQ ID NO44中的相同顺序和间隔所组成的氨基酸序列。该抗体能够进一步包含具有SEQ ID NO35、SEQ ID NO38、SEQ ID NO39、SEQ ID NO40、SEQ ID NO41或SEQ ID NO42的氨基酸序列的CDR。
一种能够特异性结合到IFN-γ上和/或抑制或调节IFN-γ生物学活性的分离的抗体，能够包含六种CDR，所述CDR至少具有以下氨基酸序列(a)SEQ ID NO34；(b)SEQ ID NO35；(c)SEQ ID NO36或SEQ IDNO37；(d)SEQ ID NO38、SEQ ID NO39或SEQ ID NO40；(e)SEQ IDNO41或SEQ ID NO42；和(f)SEQ ID NO43或SEQ ID NO44。
本发明的能够特异性结合到IFN-γ上和/或抑制或调节IFN-γ生物学活性的分离的抗体，能够含有与SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQID NO14或SEQ ID NO30至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大约99％相同的氨基酸序列，其中该氨基酸序列与SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO14或SEQ ID NO30的比对跨越至少50个氨基酸，和/或与SEQ ID NO8、SEQ ID NO12、SEQ IDNO16或SEQ ID NO31至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大约99％相同的氨基酸序列，其中该氨基酸序列与SEQ ID NO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO16或SEQ ID NO31的比对跨越至少50个氨基酸。
在另一个方面，本发明的能够特异性结合到IFN-γ上和/或抑制或调节IFN-γ生物学活性的分离的抗体，能够含有与SEQ ID NO17、SEQID NO19、SEQ ID NO21或SEQ ID NO32至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大约99％相同的氨基酸序列，其中该氨基酸序列与SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21或SEQ ID NO32的比对跨越至少50个氨基酸，和/或与SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22或SEQ ID NO33至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大约99％相同的氨基酸序列，其中该氨基酸序列与SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22或SEQ ID NO33的比对跨越至少50个氨基酸。在这些抗体之内的一种氨基酸序列能够含有至少5个SEQ ID NO36或SEQ ID NO37中的氨基酸，与它们在SEQ ID NO36或SEQ ID NO37中出现的顺序和间隔相同，和/或在这些抗体之内的一种氨基酸序列能够包含与它们在SEQ IDNO43或SEQ ID NO44中的相同顺序和间隔的至少6个氨基酸。
在一个方面，本发明提供一种可以是分离的完整人抗体的抗体，其中该抗体能够抑制或调节人IFN-γ的生物学活性。在另一个方面，本发明的可以是分离的完整人抗体的抗体，不能够抑制或调节食蟹猴(cynomolgus monkey)和鼠IFN-γ的生物学活性。仍然在另一个方面，本发明的完整人抗体能够抑制或调节人和黑猩猩IFN-γ的生物学活性，但不能抑制或调节食蟹猴和鼠IFN-γ的生物学活性。仍然在另一个方面，以天冬氨酸取代人IFN-γ的残基19和/或以脯氨酸取代残基20阻止或对抗了由抗体对IFN-γ生物学活性的抑制。另外，该抗体能够抑制在残基19、20和65处分别以组氨酸、丝氨酸和丝氨酸进行取代的食蟹猴IFN-γ的突变型的生物学活性。
仍然在进一步的方面，本发明的能够特异性结合到IFN-γ上和/或抑制或调节IFN-γ生物学活性的分离的抗体，能够含有与SEQ IDNO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21或SEQ ID NO32至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大约99％相同的氨基酸序列，其中该氨基酸序列与SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ IDNO21或SEQ ID NO32的比对跨越至少50个氨基酸，和/或与SEQ IDNO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22或SEQ ID NO33至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大约99％相同的氨基酸序列，其中该氨基酸序列与SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ IDNO22或SEQ ID NO33的比对跨越至少50个氨基酸。
在一个进一步的实施方案中，本发明包括一种能够特异性结合到IFN-γ上的分离的抗体，它包含(a)含有SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO14或SEQ ID NO30的氨基酸序列，或这些序列其中之一的片段，和(b)含有SEQ ID NO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO16或SEQ ID NO31的氨基酸序列，或这些序列其中之一的片段。该抗体可包含重链和轻链。该抗体可以包含(a)SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO14或SEQ ID NO30，和(b)SEQ ID NO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO16或SEQ ID NO31。
另外，本发明的任何抗体可以是人源化的抗体或完整的人抗体。
本发明还提供多核苷酸，包含分离的多核苷酸，它编码如本文所述的本发明的任何抗体或其部分，包括CDR区、重链可变区、轻链可变区、单链抗体、单链Fv抗体、F(ab)抗体、F(ab)’抗体和F(ab’)2抗体。本发明进一步提供含有这种多核苷酸的载体以及含有这种多核苷酸和/或载体的宿主细胞，任选哺乳类宿主细胞。本发明的抗体能够通过培养这些宿主细胞进行生产。
本发明的具体实施方案由下面某些优选实施方案和权利要求的更为详细的介绍将变得显而易见。
附图简介图1A-1B描述了编码1118、1118*、1119、1121和1121*抗IFN-γ抗体的重链恒定区的氨基酸序列(图1B；SEQ ID NO2)的cDNA(图1A；SEQ ID NO1)的一部分的核苷酸序列。
图2A-2B描述了编码1118、1118*、1119、1121和1121*抗IFN-γ抗体的轻链恒定区的氨基酸序列(图2B；SEQ ID NO4)的cDNA(图2A；SEQ ID NO3)的一部分的核苷酸序列。
图3A-3B描述了编码1119抗IFN-γ抗体的重链可变区的氨基酸序列(图3B；SEQ ID NO6)的c DNA(图3A；SEQ ID NO5)的一部分的核苷酸序列。
图4A-4B描述了编码1119抗IFN-γ抗体的轻链可变区的氨基酸序列(图4B；SEQ ID NO8)的cDNA(图4A；SEQ ID NO7)的一部分的核苷酸序列。
图5A-5B描述了编码1118抗IFN-γ抗体的重链可变区的氨基酸序列(图5B；SEQ ID NO10)的cDNA(图5A；SEQ ID NO9)的一部分的核苷酸序列。图5C描述了编码1118*抗IFN-γ抗体的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO30)。图5D描述了编码1118*抗IFN-γ抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO56)。
图6A-6B描述了编码1118或1118*抗IFN-γ抗体的轻链可变区的氨基酸序列(图6B；SEQ ID NO12)的cDNA(图6A；SEQ ID NO11)的一部分的核苷酸序列。
图7A-7B描述了编码1121或1121*抗I FN-γ抗体的重链可变区的氨基酸序列(图7B；SEQ ID NO14)的cDNA(图7A；SEQ ID NO13)的一部分的核苷酸序列。
图8A-8B描述了编码1121抗IFN-γ抗体的重链可变区的氨基酸序列(图8B；SEQ ID NO16)的cDNA(图8A；SEQ ID NO15)的一部分的核苷酸序列。图8C描述了编码1121*抗IFN-γ抗体的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO31)。图8D描述了编码1121*抗IFN-γ抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO56)。
图9包含一个显示在以1119、1118和1121单克隆抗体进行的A549生物测定中IFN-γ生物学活性的中和作用或抑制作用的图表。
图10包含一个显示在由1119、1118和1121单克隆抗体进行的THP-1/HLA DR生物测定中IFN-γ生物学活性的中和作用或抑制作用的图表。
图11包含一个显示在由1119单克隆抗体进行的全血生物测定(两个供体)中IFN-γ生物学活性的中和作用或抑制作用的图表。
图12显示称为1118、1118*、1121和1119的抗IFN-γ抗体的重链的氨基末端部分(包括可变区)的比对。序列包括在实施例3中分离的cDNAs所编码的信号序列。信号序列从位置1延伸到位置19。将CDRs进行下划线。如在图中所描述的，CDR1跨越50-54，CDR2跨越69-85，而CDR3跨越118-125。Kabat等(1991，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，Public Health Service N.I.H.，Bethesda，MD)的计数系统在成熟抗体的第一个氨基酸处起始并且不包括信号序列。因而，本图中的位置20对应于Kabat等(同上)的位置1。
图13显示称为1118、1121、1121*和1119的抗IFN-γ抗体的轻链的氨基末端部分(包括可变区)的比对。序列包括在实施例3中分离的cDNAs所编码的信号序列。信号序列从位置1延伸到位置20。将CDRs进行下划线。如在图中所描述的，CDR1跨越44-55，CDR2跨越71-77，而CDR3跨越110-118。由于Kabat等(同上)的计数系统不包括信号序列，所以本图中的位置21对应于Kabat等(同上)的位置1。
图14显示由全血相应于IFN-γ的IP-10的生产，所述全血在抗IFN-γ抗体的三次注射开始之前2或1个星期(图14中标以“-2”和“-1”的线条)或2、8、15、29或36天之后(图14中标以“2”“8”“15”和“36”的线条)取自黑猩猩，所述注射每星期一次。
图15类似于图14，除了使用一只不同的黑猩猩的血液。
详述本文所用的节标题是为组织性的目的并且不应理解为限制所述的主题内容。特此将本申请中引用的所有参考文献为任意目的并入作为参考。
定义对于重组DNA、寡聚核苷酸合成，以及组织培养和转化(例如，电穿孔，脂转染)可以使用标准的技术。可以根据生产商的说明书或如本领域通常实现地或如本文所述地实施酶学反应和纯化技术。上述的技术和方法通常可以根据本领域所公知的传统方法以及如在本说明书全文中所引用和讨论的各种普遍的和更加具体的参考文献中所述地来进行。参见例如，Sambrook等，2001，分子克隆实验指南，第三版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，本文为任何目的将其并入作为参考。除非提供具体的定义，相关使用的术语，以及本文所述的分析化学、合成有机化学以及医药化学的实验室方法和技术是本领域公知的和普遍使用的那些方法和技术。可以使用标准的技术进行化学合成、化学分析、药物制备、配剂和给药，以及病人的治疗。
如根据本说明书所用的，下面的术语，除非另外指定，应理解为具有下面的意义
如本文所用的术语“分离的多核苷酸”意为一种基因组多核苷酸、cDNA或合成的起源或其某种组合，由于其起源，分离的核苷酸(1)与一种多核苷酸的全部或一部分没有关联，在自然中于所述多核苷酸中发现了分离的多核苷酸，(2)与一种多核苷酸相连，在自然中与所述多核苷酸并不相连，或(3)在自然中不作为一个更大序列的一部分而出现。
本文所提到的术语“分离的蛋白质”意为一种(1)不含有一些其它在自然界中一般与其一起发现的蛋白质，(2)基本上不含来自相同来源，例如来自相同物种的其它蛋白质，(3)由一种不同物种所表达，(4)已从至少50％的在自然界中与其在一起的多核苷酸、脂类、糖类或其它物质中分离出来，(5)不与在自然界中与该“分离的蛋白质”相关联的蛋白质的部分相关联(通过共价或非共价的相互作用)，(6)与一种在自然界中与其不相关联的多肽可操作性地相关联(通过共价或非共价的相互作用)，或(7)在自然界中不出现的受试蛋白质。这样一种分离的蛋白质可由合成起源的基因组DNA、cDNA、mRNA或其它RNA，或其任何组合所编码。优选地，分离的蛋白质基本上不含蛋白质或多肽或其它污染物，它们在其自然环境中被发现，所述环境会干扰其应用(治疗性的、诊断性的、预防性的研究或其它)。
术语“多肽”或“蛋白质”意为一条或多条氨基酸链，其中每条链包含由肽键共价连接的氨基酸，并且其中所述多肽或蛋白质能够包含多个由肽键非共价地和/或共价地连接在一起的链，其具有天然蛋白质的序列，即由天然的和特定非重组细胞，或经遗传工程化的或重组的细胞所产生的蛋白质，并且包含具有天然蛋白质氨基酸序列的分子，或具有一个或多个氨基酸的天然序列的缺失、添加和/或取代的分子。术语“多肽”或“蛋白质”具体地包括抗IFN-γ抗体，或具有一个或多个氨基酸的天然序列的缺失、添加和/或取代的序列。因而，“多肽”或“蛋白质”能够包含一条(称为“单体”)或多条(称为“多聚体”)氨基酸链。
术语“多肽片段”指一种可以是单体或多聚体的多肽，它具有天然的或重组产生的多肽的一个氨基端缺失、一个羧基端缺失和/或一个中间缺失或取代。在某些实施方案中，一个多肽片段可以包含一条至少5到大约500个氨基酸长的氨基酸链。可以理解在某些实施方案中，片段为至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450个氨基酸长。特别有用的多肽片段包括功能性结构域，包括结合性结构域。在抗IFN-γ抗体的情况中，有用的片段包括，但不限于一个CDR区，特别是重或轻链的CDR3区；一个重或轻链的可变区；抗体链的一部分或只是包括两个CDR的它的可变区等。
如本文所用的术语“免疫功能性免疫球蛋白片段”指一种至少包含免疫球蛋白重链和轻链的CDR的多肽片段。本发明的免疫功能性免疫球蛋白片段能够结合一种抗原。在这些实施方案中，本发明的免疫功能性免疫球蛋白片段的结合阻止或抑制了配体与其受本的结合，扰乱了由配体结合到其受体上所产生的生物学反应。优选地，本发明的免疫功能性免疫球蛋白片段特异性结合到IFN-γ上。最为优选地，该片段特异性结合到人IFN-γ上和/或抑制或调节人IFN-γ的生物学活性。
如本文所用的并应用到一种客体上的术语“天然出现的”指客体能够在自然界中发现的事实。例如，存在于一种生物(包括病毒)中的多肽或多肽片段是天然出现的，所述生物能够在自然界中由一种来源分离并且未曾被人有意地进行修饰过。
术语“可操作地连接”意为该术语的应用的组分处于这样一种联系中，所述联系允许它们在适当条件下执行它们的固有功能。例如，将一种“可操作地连接”到一种蛋白质编码序列上的转录控制序列进行连接从而在与该控制序列转录活性一致的条件下实现该蛋白质编码序列的表达。
如本文所用的术语“控制序列”指能够影响与它们连接的编码序列的表达、处理或胞内定位的多核苷酸序列。这类控制序列的性质可以依赖于宿主生物。在特定的实施方案中，原核生物的转录控制序列可以包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。在其它特定的实施方案中，真核生物的转录控制序列可以包括含有一个或多个转录因子识别位点的启动子、转录增强子序列、转录终止序列和多聚腺苷酸序列。在某些实施方案中，“控制序列”可以包括引导序列和/或融合配合体序列。
本文所提到的术语“多核苷酸”意为至少10个碱基长的单链的或双链的核酸多聚体。在某些实施方案中，包含多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或是两种类型核苷酸的修饰形式。所述修饰包括碱基修饰如bromuridine、核糖修饰如阿拉伯糖苷和2’，3’-双脱氧核糖以及核苷酸间键修饰如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate和磷酰胺酯。术语“多核苷酸”具体地包括DNA的单链和双链形式。
本文所提到的术语“寡核苷酸”包括天然出现的，以及通过天然出现的和/或非天然出现的寡核苷酸键连接在一起的经修饰的核苷酸。寡核苷酸是一种多核苷酸子集，它包含通常为单链并具有200个碱基或更少的长度的成员。在某些实施方案中，寡核苷酸长度为10-60个碱基。在某些实施方案中，寡核苷酸长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20到40个碱基。寡核苷酸可以是单链或双链的，例如用于一种基因突变体的构建。发明的寡核苷酸可以是相对于蛋白质编码序列有义的或反义的寡核苷酸。
除非另外指定，单链多核苷酸序列的左侧端是5’末端；双链多核苷酸序列的左侧方向称为5’方向。新生RNA转录物由5’到3’添加的方向称为转录方向；在DNA链上具有与RNA相同序列并且是RNA转录物的5’到5’末端的序列区称为“上游序列”；在DNA链上具有与RNA相同序列并且是RNA转录物的3’到3’末端的序列区称为“下游序列”。
术语“天然出现的核苷酸”包括脱氧核糖核酸和核糖核酸。术语“经修饰的核苷酸”包括具有修饰的或取代的糖基等的核苷酸。术语“寡核苷酸键”包括寡核苷酸键如硫代磷酸、二硫代磷酸、硒代磷酸、二硒代磷酸、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate、磷酰胺酯等。参见，例如LaPlanche等，1986，Nucl.Acids Res.，149081；Stec等，1984，J.Am.Chem.Soc.，1066077；Stein等，1988，Nucl.Acids Res.，163209；Zon等，1991，Anti-Cancer DrugDesign，6539；Zon等，1991，OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUESA PRACTICAL APPROACH，87-108页(F.Eckstein编辑)，牛津大学出版社，英国牛津；Stec等，美国专利号5,151,510；Uhlmann和Peyman，1990，Chemical Reviews，90543，在此为了任何目的将它们的内容并入作为参考。寡核苷酸可以包括一种可检测的标记以使得能够检测寡核苷酸或其杂交。
术语“载体”用于指任何用来将编码信息传递给宿主细胞的分子(例如，核酸、质粒或病毒)。
术语“表达载体”指一种适于转化宿主细胞并含有指导和/或控制插入的异源核酸序列表达的核酸序列的载体。表达包括，但不限于过程如转录、翻译和RNA拼接，如果存在内含子的话。
术语“宿主细胞”用于指已被导入或能够被导入核酸序列并进一步表达或能够表达选择的目标序列的细胞。该术语包括母细胞的后代，不论后代在形态上或在基因组构成上是否与起始细胞相同，只要存在选择的基因。
术语“转导”用于指基因由一种细菌转移到另一种细胞，通常是通过一种病毒。“转导”还指通过反转录病毒进行的原核细胞序列的获得和转移。
术语“转染”用于指细胞对外来的或外源的DNA的吸收，当外源DNA已经被导入细胞膜里面时细胞就被“转染”了。多种转染技术在本领域是公知的并在本文中公开。参见，例如，Graham等，1973，Virology52456；Sambrook等，2001，分子克隆实验指南，冷泉港实验室出版社；Davis等，1986，分子生物学基本方法，Elsevier；和Chu等，1981，Gene 13197。这些技术能够用于将一种或多种外源DNA部分导入适当的宿主细胞中。
本文所用的术语“转化”指细胞遗传特性的变化，当一个细胞被修饰为含有一种新的DNA时它就已被转化了。例如，当一个细胞被从它的天然状态进行了遗传修饰它就被转化了。转染或转化后，转化的DNA可以通过物理整合入细胞的染色体中与细胞的DNA进行重组，或可以暂时保持为游离元件而不被复制，或可以作为一种质粒独立地进行复制。当DNA与细胞的分裂一起复制时细胞就被认为已经被稳定地转化了。
当与生物材料如核酸分子、多肽、宿主细胞等一起使用时，术语“天然出现的”或“天然的”指在自然界中发现的或并非为人所操作的材料。类似地，本文所用的术语“非天然出现的”或“非天然的”指没有在自然界中发现的或已被人进行过结构改进或合成的材料。
术语“抗原”指能够被一种选择性结合剂，如一种抗体所结合，另外能够用于动物中以产生能够结合到该抗原表位上的抗体的分子或分子的一部分。抗原可以具有一个或多个表位。
术语“表位”包括任何能够特异性结合到一种免疫球蛋白或T细胞受体上的决定簇，优选是多肽决定簇。表位是抗原的一个区域，它被一种抗体所结合。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子如氨基酸、糖侧链、磷酸基或磺酰基的化学活性的表面簇，并且在某些实施方案中，可以具有特异性的三维结构特性，和/或特异性的电荷特性。在某些实施方案中，当一种抗体优选识别它在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的靶抗原时就说这种抗体是特异性结合到抗原上。当平衡解离常数≤10-7或10-8M时就说一种抗体特异性结合到一种抗原上。在某些实施方案中，平衡解离常数可以≤10-9或≤10-10M。
如本文所用的，当第一序列由例如，10个氨基酸的序列RASQSVSSSY(SEQ ID NO56)组成时，如果7个氨基酸与该序列中的氨基酸相同并以它们在该序列中所出现的相同相对位置出现，则另一个序列具有7个与它们在第一序列中所出现的“相同顺序和间隔”的氨基酸。例如，RAAAAVSSSY(SEQ ID NO57)具有7个与它们在RASQSVSSSY(SEQ IDNO56)中所出现的相同顺序和间隔的氨基酸。相反的，对于序列RASSVSSSY(SEQ ID NO58)就不正确，因为它含有一个相对于RASQSVSSSY(SEQ ID NO56)的内部缺失，在缺失的两侧有3个和6个氨基酸。因而，它至多具有6个与第一序列相同顺序和间隔的氨基酸。能够具有7个与RASQSVSSSY(SEQ ID NO56)中相同顺序和间隔的氨基酸的最短的可能序列是7个氨基酸长，例如SQSVSSS(SEQ ID NO59)。
如本领域公知的术语“同一性”，指如通过比较序列测定的在两种或更多多肽分子或两种或更多核酸分子之间的关系。在本领域中，“同一性”还意指在核酸分子或多肽之间的序列相关度，如通过两种或多种核苷酸或两种或多种氨基酸链之间的匹配所测定的那样。“同一性”测量两种或多种序列的较小部分之间的相同匹配的百分率，缺口比对(如果有的话)由一种特定的数学模型或计算机程序(即，“算法”)进行位置确定。
术语“相似性”相对于一种有关概念用于本领域，但与“同一性”形成对比，“相似性”指一种相关性的测量，它，它包括相同匹配和保守性取代二者。如果两种多肽序列具有，例如，10/20的相同氨基酸，并且余下的全部是非保守性取代，那么百分率同一性和相似性都是50％。如果在同一个例子中，还有5个位置有保守性取代，那么百分率同一性仍然是50％，但百分率相似性将为75％(15/20)。因而，在有保守性取代的情况下，两种多肽之间的百分率相似性将比那两种多肽之间的百分率同一性更高。
有关核酸和多肽的同一性和相似性能够通过公知的方法容易地进行计算。这类方法包括，但不限于，在计算分子生物学，(Lesk，A.M.编辑)，1988，牛津大学出版社，纽约；，New York；生物计算信息学和基因组计划，(Smith，D.W.编辑)，1993，学术出版社，纽约；序列数据的计算机分析，部分1，(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)，1994，Humana Press，新泽西；von Heinje，G.，分子生物学中的序列分析，1987，学术出版社，纽约；Carillo等，1988，SIAMJ.Applied Math.，481073；和Durbin等，1998，生物学序列分析，剑桥大学出版社中所介绍的那些方法。
将优选的测定同一性的方法设计来给出待测序列之间的最大匹配。测定同一性的方法在公众所能获得的计算机程序中进行了介绍。优选的测定两种序列之间同一性的计算机程序方法包括，但不限于，GCG程序包，包括GAP(Devereux等，1984，Nucl.Acid.Res.，12387；Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，WI)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等，1990，J.Mol.Biol.，215403-410)。BLASTX程序从国家生物技术信息中心(NCBI)和其它来源(BLAST手册，Altschul等.NCB/NLM/NIH Bethesda，MD20894；Altschul等，1990，同上)可以由公众获得。众所周知的SmithWaterman算法也可以用于测定同一性。
某些比对两种氨基酸或多核苷酸序列的比对方案可以导致只有两种序列的短区的匹配，并且这一小的比对区可以具有非常高的序列同一性，即使在两种全长序列之间没有显著的关系。因此，在某些实施方案中，选择的比对方法(GAP程序)将导致至少跨越50个目标多肽的连续的氨基酸的比对。在某些实施方案中，比对能够包含至少60、70、80、90、100、110或120个目标多肽的氨基酸。如果利用GAP比对多核苷酸，比对能够跨越至少大约100、150或200个连续的核苷酸。
例如，利用计算机程序GAP(Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，WI)，对两种要测定其百分率序列同一性的多肽进行比对以寻求它们各自氨基酸的优化匹配(如该算法所测定的“匹配的跨度”)。在某些实施方案中，结合算法利用一种缺品开放补偿(它计算为平均对角线的三倍；其中“平均对角线”是所用比较矩阵的对角线的平均数；“对角线”是通过特定比较矩阵赋与每个完全匹配的分数或数目)和一种缺品延伸补偿(它通过为缺口开放补偿的十分之一)，以及一种比较矩阵如PAM250或BLOSUM 62。在某些实施方案中，还通过算法利用一种标准的比较矩阵(见Dayhoff等，1978，Atlas of Protein Sequence and Structure，5345-352 for the PAM 250c omparison matrix；Henikoff等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci USA，8910915-10919 for the BLOSUM 62comparison matrix)。
在某些实施方案中，多肽序列比较的参数包括以下算法Needleman等，1970，J.Mol.Biol.，48443-453；比较矩阵来自Henikoff等，1992，同上的BLOSUM 62；缺口补偿12缺口长度补偿4相似性临界值0GAP程序可以以上面的参数而有效。对于核苷酸序列，参数能够包括一个缺口补偿50和一个缺品长度补偿3，所述缺口长度补偿对于每个缺口中的每个字符都为补偿值3。在某些实施方案中，上述参数是利用GAP算法对于多肽比较默认的参数(连同对于末端缺口无补偿一起)。
如本文所用的，20种传统氨基酸及其缩写遵循传统用法。见IMMUNOLOGY--A SYNTHESIS，第二版，(E.S.Golub和D.R.Gren，编辑)，Sinauer AssociatesSunderland，MA，1991，本文为任何目的将其并入作为参考。20种传统氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)；非天然氨基酸如α-，α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非传统氨基酸也可以是本发明多肽的适合组分。非传统氨基酸的例子包括4-羟基脯氨酸、Y-羧基谷氨基、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基蛋氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其它类似的氨基酸与亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。在本文所用的多肽表示法中，根据标准用法和传统，左侧方向是氨基末端方向而右侧方向是羧基末端方向。
天然出现的残基可以基于共同的侧链性质分为以下类别1)疏水的正亮氨酸(Nor)、Met、Ala、Val、Leu、Ile；2)中性亲水的Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；3)酸性的Asp、Glu；4)碱性的His、Lys、Arg；5)影响链定向的残基Gly、Pro；和6)芳香族的Trp、Tyr、Phe。
保守性的氨基酸取代可以包括一种这些类别的一个成员与同类别的另一个成员的互换。保守性的氨基酸取代可以包含非天然出现的氨基酸残基，它一般通过化学肽合成进行整合而非通过生物系统中的合成。这些包括肽模拟学和其它氨基酸部位保守的或反转的形式。
非保守性取代可以包括一种这些类别的一个成员互换为另一类别的一个成员。这类取代的残基可以导入与非人抗体同源的人抗体区域中，或导入分子的非同源区。
根据某些实施方案，在进行这类变化中，可以考虑氨基酸的水合指数。每种氨基酸都已在其疏水性和电荷性质的基础上赋予一个水合指数。它们是异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
水合性氨基酸指数在赋予蛋白质交互的生物学功能中的重要性在本领域为人所理解(见，例如，Kyte等，1982，J.Mol.Biol.157105-131)。已知某些氨基酸可以取代为其它具有相似水合指数或分数并仍然保持相似生物学活性的其它氨基酸。在某些实施方案中，在基于水合指数进行变化中，包括水合指数在±2之内的氨基酸的取代。在某些实施方案中，包括水合指数在±1之内的氨基酸的取代，并且在某些实施方案中，包括水合指数在±0.5之内的氨基酸的取代。
本领域中还理解类似氨基酸的取代能够在亲水性的基础上有效地进行，特别是在本文所公开的用于免疫学实施方案中的生物功能蛋白质或由其产生的肽中。在某些实施方案中，由其邻近氨基酸的亲水性所决定的一种蛋白质的最大局部平均亲水性与其免疫原性和抗原性相关联，即，与蛋白质的生物学特性相关联。
已赋予这些氨基酸残基以下亲水性值精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在某些实施方案中，在基于相似的亲水性值进行变化中，包括亲水性值在±2之内的氨基酸的取代，在某些实施方案中，包括亲水性值在±1之内的氨基酸的取代，并且在某些实施方案中，包括亲水性值在±0.5之内的氨基酸的取代。基于亲水性也可以鉴定来自一级氨基酸序列的抗原表位。这些区域也称为“抗原表位核心区”。
示例性的氨基酸取代在表1中给出。
表1
熟练的技术人员将能够利用公知技术确定本文所给出的多肽的适合变异体。在某些实施方案中，本领域技术人员可以通过靶向据认为对于活性不重要的区域来鉴别可以变化的适当区域而不破坏活性。在其它的实施方案中，熟练的技术人员能够鉴别在相似多肽中保守的分子的残基或部分。在另外的实施方案中，甚至对于生物学活性或对于结构重要的区域进行保守性氨基酸取代而不会破坏生物学活性或不会相反地影响多肽结构。
此外，本领域技术人员能够回顾在相似多肽中鉴别对于活性或结构重要的残基的结构-功能研究。考虑到这种比较，熟练的技术人员能够预测氨基酸残基在蛋白质中的重要性，它与在相似蛋白质中对于活性或结构重要的氨基酸残基相对应。本领域技术人员可以对于这类预测的重要氨基酸残基选择化学上相似的氨基酸取代。
本领域技术人员还能够相对于相似多肽中的结构分析三维结构和氨基酸序列。考虑到这类信息，本领域技术人员可以预测关于其三维结构的抗体的氨基酸残基比对。在某些实施方案中，本领域技术人员可以选择不对据预测在蛋白质表面的氨基酸残基进行根本的改变，因为这类残基可能涉及与其它分子的重要相互作用。而且，本领域技术人员可以生产在每个希望的氨基酸位点含有单个氨基酸取代的试验变异体。随后能够利用本领域技术人员公知的活性测试对这些变异体进行筛选。这类变异体可以用于收集关于适合的变异体的信息。例如，如果发现一个特定氨基酸残基的变化导致破坏的、不合需要地减弱的或不适当的活性，就能够避免具有这一变化的变异体。换言之，基于由这类常规实验所收集的信息，本领域技术人员能够轻易地确定应当避免进一步取代的氨基酸，不论是单独地或与其它突变相结合。
许多科学出版物致力于二级结构的预测。见，例如，Moult，1996，Curr.Op.in Biotech.7422-427；Chou等，1974，Biochemistry13222-245；Chou等，1974，Biochemistry 113211-222；Chou等，1978，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.4745-148；Chou等，1979，Ann.Rev.Biochem.47251-276；和Chou等，1979，Biophys.J.26367-384。而且，辅助预测二级结构的计算机程序目前是已有的。一种预测二级结构的方法基于同源性模型。例如，具有大于30％或大于40％同源性的两种多肽或蛋白质经常具有相似的结构拓扑学。最近蛋白质结构数据库(PDB)的发展提供了增强的二级结构的预测能力，包括在多肽或蛋白质结构内潜在的折叠数目。见Holm等，1999，Nucl.Acid.Res.27244-247。有人提出(Brenner等，1997，Curr.Op.Struct.Biol.7369-376)在一种给定的多肽或蛋白质中有有限数目的折叠并且一旦临界数目的结构被分解，结构预测将戏剧性地变得更加精确。
预测二级结构的其它方法包括“穿线法”(Jones，1997，Curr.Opin.Struct.Biol.7377-87；Sippl等，1996，Structure 415-19)、“剖面分析法”(Bowie等，1991，Science 253164-170；Gribskov等，1990，Meth.Enzym.183146-159；Gribskov等，1987，Proc.Nat.Acad.Sci.844355-4358)和“进化谱系法”(见Holm，1999，supra；和Brenner，1997，同上)。
根据某些实施方案，氨基酸取代是那些(1)减弱对蛋白质水解的敏感性，(2)减弱对氧化作用的敏感性，(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲合性，(4)改变结合亲合性，和/或(5)赋予或改进这类多肽的其它理化或功能特性的。根据某些实施方案，单个或多个氨基酸取代(在某些实施方案中，保守性氨基酸取代)可以在天然出现的序列中进行(在某些实施方案中，在形成分子间联系的结构域处面的多肽的部分中)。在优选的实施方案中，保守性氨基酸取代一般不基本改变亲本序列的结构特性(例如，一个替换氨基酸不应趋于破坏出现于亲本序列中的螺旋，或破坏作为亲本序列特征的其它类型的二级结构)。技术识别的多肽二级结构和三级结构的例子在蛋白质，结构和分子理论，(Creighton编辑)，1984，W.H.Freeman and Company，纽约；蛋白质结构介绍(C.Branden和J.Tooze编辑)，1991，GarlandPublishing，纽约，N.Y.；和Thornton等，1991，Nature 354105，本文并入每一篇作为参考。
在制药工业中通常将肽类似物用作非肽类药物，它具有与模板肽那些特性类似的特性。这些类型的非肽化合物称为“肽模拟物”。见Fauchere，1986，Adv.Drug Res.1529；Veber和Freidinger，1985，TINS p.392；以及Evans等，.1987，J.Med.Chem.301229，本文为任何目的将其并入作为参考。经常在计算机化分子建模的辅助下开发这类化合物。可以利用与治疗上有用的肽结构相似的肽模拟物来产生类似的治疗或预防效果。一般地，肽模拟物与一种示例肽结构上相似(即，一种具有生物化学特性或药理学活性的多肽)，如人抗体，但具有由选自-CH2-NH-、-CH2-S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-的键，通过本领域公知的方法随意替换的一个或多个肽键。具有相同类型D-氨基酸(例如，D-赖氨酸替换L-赖氨酸)的一致序列的一种或多个氨基酸的系统性取代可以用在某些实施方案中以生产更加稳定的肽。此外，含有一种一致序列或基本上相同的一致序列变异型的限制性肽可以通过本领域公知的方法进行生产(Rizo和Gierasch，1992，Ann.Rev.Biochem.61387，在此为任何目的并入作为参考)；例如，通过添加能够形成环化肽的分子内二硫链桥的内在半胱氨酸残基。
如本文所用的，术语“抗体”或“抗体肽”指包含一个或多个多聚肽的单体的或多聚体的蛋白质。一种抗体能够特异性地结合到一种抗原上并且可能能够抑制或调节抗原的生物学活性。“抗体”包括下面介绍的天然出现的抗体。在某些实施方案中，通过重组DNA技术生产抗体。在另外的实施方案中，通过天然出现的抗体的酶学或化学剪切生产抗体。抗体包括，但不限于，F(ab)、F(ab′)、F(ab′)2、Fv，和单链Fv片段，以及单链的、嵌合的、人源的、完整人的、多克隆的和单克隆的抗体。至少，一种如本文所意指的抗体包含一个能够特异性结合到一种含有全部或部分轻或重链可变区的抗原的多肽。
一个可变区至少包含三个嵌于一个框架区(由Kabat等，同上命名的框架区1-4，FR1、FR2、FR3和FR4，；还见Chothia和Lesk，同上)内的重或轻链互补决定区(CDR，也称作高变区，由Kabat等，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，PublicHealth Service N.I.H.，Bethesda，MD命名为CDR1、CDR2和CDR3；还见Chothia和Lesk，1987，J.Mol.Biol.196901-17；Chothia等，1989，Nature 342877-83)。CDRs和框架区如下散布，起始于可变区的氨基末端FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
抗体可变区的框架区的一级序列具有若干个跨门普遍保守的残基。但是，许多残基是跨门和/或在物种和/或门内高度保守的。见Kabat等，同上。
或者一个序列可以通过其预测的三级结构而鉴定为一种抗体。包含形成称作Greek主β筒的9条β链的可变区的三级结构，是极端充分保守的，并且在此结构之内的CDR的位置也是高度保守的。见例如，Bork等，1994，J.Mol.Biol.242309-20；Hunkapiller和Hood，1989，Adv.Immunol.441-63；Williams和Barclay，1988，Ann.Rev.Immunol.6381-405；Chothia和Lesk，同上；Kabat等，同上。
三级结构可以通过各种计算机程序进行预测，如，例如，GENEFOLD(Tripos，Inc.，St.Louis，MO；Godzik和Skolnik，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8912098-12102；Godzik等，1992，J.Mol.Biol.227227-38；Godzik等，1993，Protein Engng.6801-10)，一种将一个查询蛋白质序列覆盖到蛋白质数据库(PDB)(Berman等，2000，Nucleic Acids Res 28235-242；Jaroszewski等，1998，Prot Sci 71431-1440)的结构代表上的蛋白质穿线程序。为了利用GENEFOLD对一种新的氨基酸序列进行分类，将序列输入程序中，它赋予概率一个概率分值，反映其如何充分折叠成先前已知的蛋白质结构(“模板”结构)，所述蛋白质结构存在于GENEFOLD数据库中。关于打分，GENEFOLD依赖于一级氨基酸序列相似性、残基的隐藏模式、局部相互作用和二级结构比较。GENEFOLD程序将氨基酸序列折叠(或穿线)成蛋白质折叠的预置的数据库中的所有模板结构，它包括许多抗体的溶解性结构。GENEFOLD的输出是来自数据库内的三列蛋白质，其三级结构是最可能通过输入的氨基酸序列进行假定的。所述三列含有基于(i)只是序列，(ii)序列加局部构象偏好加隐藏条件，和(iii)序列加局部构象偏好加隐藏条件加二级结构计算的三种不同分值。在每种情况中，程序决定最佳的比对，计算概率(P值)，即这种偶然出现的比对的程序，并报告P值的倒数作为分值，以999.9(9.999×102)作为最高的可能性分值。这些分值因而反映了新的蛋白质匹配各种对照结构的程度并对于将一种新蛋白质指定为一种已知蛋白质家族中的成员有用。例如，预计一种具有抗体可变区结构的序列由于相当高的P值，如至少大约200、300、400、500、600、700、800或更高，会被指定为至少一种已知的抗体可变区结构。
术语“重链”包括任何具有足够可变区序列以赋予对于IFN-γ的结合特异性的免疫球蛋白多肽。术语“轻链”包括任何具有足够可变区序列以赋予对于IFN-γ的结合特异性的免疫球蛋白多肽。这样的重或轻链可以，但不需要，在缺少轻链的情况下结合到IFN-γ上，如果它是重链的话，或在缺少重链的情况下结合到IFN-γ上，如果它是轻链的话。全长重链包括一个可变区结构域VH，和三个恒定区结构域CH1、CH2和CH3。VH结构域位于多肽的氨基末端，而CH3结构域位于羧基末端。如本文所用的，术语“重链”包含全长重链或基片段。全长轻链包括一个可变区结构域VL，和一个恒定区结构域CL。象重链一样，轻链的可变区位于多肽的氨基末端。如本文所用的，术语“轻链”包含全长轻链或基片段。F(ab)片段由一条轻链和CH1以及一条重链的可变区所组成。F(ab)分子的重链不能和其它重链分子形成二硫键。F(ab′)片段包含一条轻链和一条含有更多恒定区的在CH1和CH2结构域之间的重链，从而能够在两条重链之间形成链间二硫键以形成一个F(ab′)2分子。Fv区含有来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。单链抗体是Fv，其中重链和轻链可变区已通过一个柔韧接头进行了连接以形成一个单链多肽链，它形成一个抗原结合区。单链抗体在国际专利申请公开号WO 88/01649和美国专利号4,946,778和5,260,203中进行了详细讨论。
本发明还包括完整人的、人源的和嵌合的抗体。如本文所意指的，完整人抗体含有仅由基本上是人起源的多核苷酸所编码的氨基酸序列或与这类序列相同的氨基酸序列。如本文所意指的，由插入小鼠基因组的人免疫球蛋白编码DNA编码的产生于转基因小鼠内的抗体是完整人抗体，因为它们是由基本上人起源的DNA所编码的。在这种情况中，人免疫球蛋白编码DNA能够在小鼠中进行重排(编码一种抗体)，并且也可以出现躯体突变。已在小鼠中进行过这种变化的由起始人DNA所编码的抗体是本文所意指的完整人抗体。这类转基因小鼠的应用使得选择针对一种人抗原的完整人抗体成为可能。在自然界，大多数情况下这是不可能的，因为相对于自身抗原的人免疫反应通常不会发生。本领域员将会理解完整人抗体对于用作特别是治疗慢性疾病的疗法是有益的，因为它们不太可能参与相对于它们自身的免疫反应。相反地，已知许多非人抗体当用于人类中时参与相对于它们自身的免疫反应，这是一种令这些抗体在人类中的慢性应用不妥的环境。完整抗体因而解决了在使用抗体治疗慢性状况，包括人疾病中所面临的一个长期存在的问题。见例如Billiau，1988，Immunol.Today 237-40；Horneff等，1991，Clin.Immununol.&Immunopathol.5989-103；Tjandra等，1990，Immunol&Cell Biol.68367-76。因而，完整人抗IFN-γ抗体特别好地适于慢性的人IFN-γ介导的疾病的治疗，如自身免疫疾病。
在一个人源化的抗体中，整个抗体，除了CDR以外，由一个人源的多核苷酸所编码或与这种抗体相同除了在其CDR内。将由源于一种非人生物的核酸所编码的CDR移入一种人抗体可变区的β折叠内以产生一种抗体，它的特异性由移入的CDR所决定。这种抗体的产生在例如，WO92/11018，Jone等，1986，Nature 321522-25，Verhoeyen等，1988，Science 2391534-36中进行了介绍。这一研究强调了CDR在形成抗原结合位点中的关键重要性。嵌合抗体包含一个人恒定区(它由人源的多核苷酸所编码或与这种人恒定区相同)以及一个非人可变区。这种抗体的产生在例如美国专利号5,681,722中进行了介绍。
在某些实施方案中，据理解一个二价抗体而非一个“多特异性”或“多功能性”抗体包含具有相同抗原特异性的结合位点。
在分析根据本发明的抗体的结合和特异性中，当过量的抗体减少结合IFN-γ的受体量，或反之亦然至少20％、40％、80％、85％或更多时(如在一种体外竞争性结合分析中所测量的)，抗体特异性地结合和/或基本上抑制IFN-γ附着于其受体上。可以预期一种特异性结合抗体具有小于或等于10-8摩尔的结合IFN-γ的平衡解离常数，优选小于或等于10-9或10-10摩尔。
关于治疗用途，抗IFN-γ抗体的一个重要特性是它是否能够抑制或调节IFN-γ的生物学活性。IFN-γ具有许多在不同细胞类型中的能够于许多不同的测试中进行测量的不同生物学效应。一种抗IFN-γ抗体抑制或调节IFN-γ生物学活性的能力能够利用在下面实施例6中所述的A549测试或利用一种类似的测试进行测量，在所述类似的测试中测量抗体在IFN-γ存在下所观察到的逆转细胞增殖抑制的能力。对于产生有意义结果的测试，用在测试中的细胞的增殖必须通过用于测试中的IFN-γ进行抑制。人IFN-γ能够抑制一些细胞类型的增殖，包括A549细胞(实施例6和7)。鼠IFN-γ能够抑制RAW264.7细胞的增殖(实施例7)，但不能抑制A549细胞的增殖。特别是当测试抗体抑制或调节非人IFN-γ的生物学活性的能力时，能够使用除了A549细胞以外的细胞类型，因为非人IFN-γ可以是能或不能抑制A549细胞的增殖。并非每种特异性结合到一种抗原上的抗体都能够阻抑抗原结合到其正常受体上并因而抑制或调节在结合其受体后该抗原的生物学活性。如本领域所公知的，这种效应能够依赖于抗原结合到抗原的哪一部分并且依赖于抗原和抗体，在本案中，为IFN-γ和抗IFN-γ抗体的绝对和相对的浓度。当IFN-γ浓度在一个范围内，例如于大约EC80或EC90时，一种抗体必须能够逆转在IFN-γ存在下观察到的细胞增殖的抑制至少20％、40％、80％、85％、100％或更多，才能被认为能够抑制或调节如本文所意指的IFN-γ的生物学活性，其中一种试剂抑制其生物学活性的效应可以是显而易见的，所述抑制如通过在A549测试(实施例6)或一种类似的测试中的荧光进行测量。EC80，如本文所意指的，是对于要观察到80％的IFN-γ的最大效应所需的IFN-γ量。如果IFN-γ浓度远远大于EC90，那么抑制剂的效应由于过量的IFN-γ可能较不明显。抑制或调节IFN-γ的生物学活性所需的抗体浓度可以广泛变化并可以依赖于抗体结合到IFN-γ上的紧密程度。例如，一个分子或更少的抗体/1分子IFN-γ可以足以抑制或调节A549测试中的生物学活性。在某些实施方案中，当IFN-γ浓度为大约EC50-大约EC90时，可以需要大约IFN-γ∶抗体的比率2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶20、1∶40、1∶60、1∶100，或1∶50，000以抑制或调节IFN-γ的生物学活性。在这些值之间的IFN-γ抗体的比率也是可能的。
在其它的实施方案中，抗体变异体能够包括含有一个修饰的Fc片段或一个修饰的重链恒定区的抗体。能够通过突变修饰代表“结晶的片段”的Fc片段，或重链恒定区以赋予抗体变化的特性。见，例如，Burton和Woof，1992，Advances in Immunology 511-84；Ravetch和Bolland，2001，Annu.Rev.Immunol.19275-90；Shields等，2001，Journal of Biol.Chem.2766591-6604；Telleman和Junghans，2000，Immunology 100245-251；Medesan等，1998，Eur.J.Immunol.282092-2100；本文将它们都并入作为参考。这类突变能够包括取代、添加、删除，或其任何组合，并且一般利用一种或多种变寡核苷酸根据本文所述方法，以及根据本领域公知的方法(见，例如，Maniatis等，分子克隆实验指南，第三版，2001，冷泉港，N.Y.和Berger和Kimmel，酶学方法，152卷，分子克隆技术指南，1987，学术出版社，Inc.，San Diego，CA.，本文将其并入作为参考)通过定点突变进行生产。
在某些实施方案中，抗体变异体包括糖基化变异体，其中与亲本多肽的氨基酸序列相比糖基化位点的数目和/或类型已经进行了变化。在某些实施方案中，蛋白质变异体包含比天然蛋白质更多或更少的N-连接糖基化位点。N-连接糖基化位点特征序列为Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中表示为X的氨基酸残基可以是除了脯氨酸的任何氨基酸残基。产生该序列的氨基酸残基的取代提供了一个添加N-连接糖链的潜在的新位点。或者，除去此序列的取代将去除一个现有的N-连接糖链。还提供了一种N-连接糖链的重排，其中除去了一个或多个N-连接糖基化位点(一般是那些天然出现的)并产生一个或多个新的N-连接位点。另外的优选的抗体变异体包括半胱氨酸变异体，其中与亲本氨基酸序列相比一个或多个半胱氨酸残基被删除或取代为另一种氨基酸(例如，丝氨酸)。当抗体必须重新折叠成生物学活性构象如不溶性包含体的分离后时半胱氨酸变异体可以是有用的。半胱氨酸变异体一般比天然蛋白质具有较少的半胱氨酸，并且一般具有一个偶数以使由未配对半胱氨酸所产生的相互作用最小化。
本文使用术语“剂”来表示一种化学化合物、一种化学化合物的混合物、一种生物学大分子，或一种由生物材料制成的提取物。
如本文所用的，术语“标记”或“标记的”指一种可检测标记物的掺入，例如，通过一种放射性标记氨基酸的掺入，或附于一种荧光标记物、一种化学发光标记物或一种具有可检测活性的酶的多肽或核酸上，或附于一种能够通过标记的抗生物素蛋白进行检测的生物素部分的多肽上(例如，优选包含一种可检测标记物如荧光标记物、化学发光标记物或一种酶活性的抗生蛋白链菌素，所述酶活性能够通过光学或比色的方法进行检测)。在某些实施方案中，标记也能够是治疗性的。名种标记多肽和糖蛋白的方法是本领域公知的并且可以有益地用于本文所公开的方法中。多肽的标记的例子包括，但不限于，下列放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99mTc、111In、125I、131I)、荧光标记(例如，异硫氰酸荧光素或FITC、罗丹明，或稀土磷)、酶学标记(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、虫荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记、半抗原标记如生物素基团，和由一种第二报告物识别的预定多肽抗原表位(例如，亮氨酸拉链配对序列、第二抗体结合位点、金属结合结构域，或抗原表位标签。在某些实施方案中，标记由各种长度的间隔区臂(如(CH2)n，其中n＜大约20)所附着以减少潜在的空间障碍。
如本文所用的术语“生物样品”，包括，但不限于，来自活体事物或从前是活体事物的任何量的物质。这类活体事物包括，但不限于，人、小鼠、猴、大鼠、兔和其它动物。这类物质包括，但不限于，血液、血清、尿、细胞、器官、组织、骨、骨髓、淋巴结和皮肤。
如本文所用的术语“药剂或药物”指一种当正确对病人给药时能够诱导期望的疗效的化学化合物或组合物。
术语“IFN-γ介导的疾病”包括，但不限于，炎症性的、感染性的和自身免疫疾病。如本文所用的“自身免疫病症”指一种疾病状态和状况，其中病人的免疫反应指向病人自已的成分。例如，IFN-γ介导的疾病包括，但不限于，获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、类风湿性关节炎，包括幼年型类风湿关节炎、炎症性肠道疾病，包括溃疡性结肠炎和局限性回肠炎、多发性硬化症、Addison病、糖尿病(I型)、附睾炎、肾小球肾炎、突眼性甲状腺肿、格-巴二氏综合征、桥本病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮肾炎、重症肌无力、天疱疮、银屑病、银屑病关节炎、动脉粥样硬化、促红细胞生成素抗性、移植物抗宿主病、移植排异、自身免疫肝炎诱导的肝损伤、胆汁性肝硬变、酒精诱导的肝损伤，包括酒精性肝硬变、风湿热、结节病、硬皮病、Sjogren综合征、脊椎关节病，包括强直性脊柱炎、甲状腺炎和脉管炎。术语“IFN-γ介导的疾病”还包括任何与提高的IFN-γ水平或提高的对IFN-γ的敏感性相关的医学状况。
包括自身免疫疾病的IFN-γ介导疾病的治疗，包括病症的至少一种症状的缓和、疾病严重性的减弱，或延缓或预防一种继治疗的状况之后以某一频率发生的更严重疾病的进程。治疗不必意味着疾病完全治愈。一种有用的治疗剂只需要减弱一种疾病的严重性、减弱一种与该疾病相关的一种或几种症状的严重性，或对病人的生活质量提供改进，或延缓能够继治疗的状况之后以某一频率发生的更严重疾病的发病。例如，如果疾病是类风湿性关节炎，一种治疗剂可以降低关节的肿胀，减小影响到的关节数，或延缓或抑制骨的丧失。一个系统性红斑狼疮病人可以具有症状如皮肤损害、发烧、虚弱、关节炎、淋巴结病、胸膜炎、心包炎和/或贫血等。这些症状能够通过任何一些传统技术包括，例如，视觉观察、摄影、温度测量、握紧强度或关节大小，和/或血液的显微镜检查以测定红血细胞的浓度进行评定。本发明包括一种治疗的方法，包括对患有IFN-γ介导的疾病的病人给药一定量的IFN-γ抗体足够的时间以诱导超过指示项基线的持续的改善或延缓或避免在一些或所有病例中继治疗的状况之后更加严重的疾病的发作，所述指示项反映特定病症的严重性或由该病症引起症状的严重性。发明不排除以其它的治疗剂在用IFN-γ抗体治疗之前、之后和/或期间的可能的治疗。
如本文所用的，“基本上纯的”或“基本上纯化的”意为一种化合物或物类，它是优势存在的物类(即，在摩尔浓度基础上它比任何其它组合物中的个别物类都要多)。在某些实施方案中，一种基本上纯化的成分是一种组合物，其中该物类包含所有存在的大分子物类的至少大约50％(在摩尔浓度基础上)。在某些实施方案中，一种基本上纯的组合物将包含存在于组合物中的所有大分子物类的超过大约80％、85％、90％、95％或99％。在某些实施方案中，将该物类纯化为基本同质(在组合物中通过传统检测方法不能检测到污染物)，其中组合物基本上由一种单一的大分子物类所组成。
术语“病人”包括人和动物受试者。
除非上下文需要，单数术语将包括复数。
由于IFN-γ是一种具有多重功能的细胞因子，包括保护躯体不受病毒感染并调节免疫反应的几方面，增强的IFN-γ活性可以有助于几种病理状况。根据本发明的某些实施例，定向于IFN-γ的抗体可以用于治疗IFN-γ介导的疾病，包括但不限于，那些以上提及的疾病。
在本发明的一方面提供了针对人IFN-γ培养的并且具有特异性结合人IFN-γ的生物学和免疫学特异性的完整人单克隆抗体。本发明包括包含在这些抗体中的可变区(SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ IDNO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ IDNO30和SEQ ID NO31)、这些抗体的完整重链和轻链(SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21和SEQ ID NO22)，以及含有特异性CDR(重链和轻链CDR1，CDR2，和/或CDR3；SEQ ID NO34到SEQ ID NO44)。发明的这方面的特定的实施方案是相应于由本发明所提供的重链和轻链的CDRs，特别是来自CDR1到CDR3的序列。另外，本发明包括含有本文所公开的CDR3序列的抗体(SEQ ID NO36、SEQ ID NO37、SEQ ID NO43，和/或SEQ ID NO44)，它可能还含有与本文所公开的任何可变区序列或完整的重链或轻链序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大约99％相同的序列，其中该抗体能够抑制或调节IFN-γ的生物学活性。
在发明的另一个方面提供了编码本发明抗体的分离的核酸或多核苷酸。本发明的抗体能够特异性地结合和/或抑制或调节IFN-γ的生物学活性。本发明具体包括含有编码氨基酸序列SEQ ID NO17、SEQ IDNO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21、SEQ ID NO22、SEQ ID NO32、SEQ ID NO33、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO30、SEQ ID NO31，和/或与这些序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大约99％相同的序列的核苷酸序列，其中以上序列和测试序列之间的比对至少跨越大约50、60、70、80、90或100个氨基酸。本发明进一步提供包含SEQ ID NO45，SEQ ID NO46、SEQ ID NO47和/或SEQ IDNO48的多核苷酸，其编码能够特异性结合和/或抑制或调节IFN-γ的生物学活性的抗体。另外，本发明包括与SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO30、SEQ ID NO31、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21、SEQ ID NO22、SEQ ID NO32或SEQ ID NO33至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大约99％相同的多核苷酸，其中部分由每种这些多核苷酸所编码的抗体能够抑制或调节IFN-γ的生物学活性和/或特异性结合IFN-γ，并且其中上面直接命名的核苷酸序列与测试序列之间的比对跨越至少大约100、150或200个核苷酸。
表2相对于它们的序列识别号提供了序列的简介。
表2
仍然在另一方面本发明提供了表达本发明的免疫球蛋白分子和抗体，优选单克隆抗体的杂交瘤细胞和细胞系。在另外一个方面，来自一个表达和/或分泌本发明的免疫球蛋白分子和抗体的细胞系能够移植入一个病人中，藉此在病人中表达本发明的抗体或其免疫功能性免疫球蛋白片段，由此抑制或调节IFN-γ的活性。
本发明还提供抗体的生物学和免疫学纯化的制品，优选针对人IFN-γ培养的并且具有特异性结合人IFN-γ的生物学和免疫学特异性的单克隆抗体。
在酵母人工染色体(YAC)中克隆和重构兆碱基大小的人基因位点并将它们导入小鼠胚系中的能力允许发展一种有益的方法以阐释极大的或粗绘的基因位点以及生产有用的人疾病模型。而且，利用这种技术以它们的人等同物进行小鼠基因位点的取代产生了对发育过程中人基因产物的表达和调控、它们与其它系统的联系和它们参与疾病诱导和进程的独特的了解。
这种策略的一个重要的实践应用是通过将人免疫球蛋白(Ig)位点导入小鼠中来改变小鼠体注免疫系统，在小鼠中内源的Ig基因已被灭活。国际申请号WO 93/12227。这一系统提供研究程序化表达和抗体的装配以及它们在B细胞发育中作用的机制的机会。另外，这一策略提供一种生产完整人单克隆抗体(MAb)。完整人MAbs有望使小鼠或小鼠源MAbs固有的免疫原和过敏性反应最小化，并由此提高给药抗体的效率和安全性。完整人抗体能够用于慢性和复发性人疾病的治疗，如骨关节炎、类风湿性关节炎和其它炎症状况，其治疗需要反复的抗体给药。因而，本发明的抗IFN-γ抗体的一种特别的益处是抗体是完整人的并能够以一种非剧烈的方式给药给病人，同时使通常与小鼠抗人抗体或其它以前描述的非完整人抗体或来自非人物种的非人抗体相关联的副作用最小化。
利用本文所提出的方法，本领域技术人员能够以人Ig基因位点的大片段来改进小鼠抗体生产不足的小鼠品系，以使这种小鼠在不存在小鼠抗体的情况下产生人抗体。大的人Ig片段可以保持大的可变基因多样性以及适当的抗体生产和表达的调控。通过利用抗体多样化和筛选的小鼠细胞结构和对人蛋白质免疫耐受性的缺失，在这些小鼠品系中再生产出来的人抗体所有组成部分产生了相对于任何目标抗原的高亲和性的抗体，包括人抗原。利用杂交瘤技术，可以生产并筛选具有预期特异性的抗原特异性人MAbs。
在某些实施方案中，熟练技术人员能够在这种小鼠中与人可变区一起使用来自除了人之外的物种的恒定区以生产嵌合性抗体。
天然出现的抗体结构大多数天然出现的抗体结构单位一般都包含一个四聚体。每一个这种四聚体一般都由二对相同的多肽链组成，每对具有一个全长“轻”链(一般具有约25kDa的分子量)和一个全长“重”链(一般具有约50-70kDa的分子量)。每个轻链和重链的氨基末端部分一般都包括一个大约100-110个或更多氨基酸的可变区，它一般负责抗原识别。每条链的羧基末端一般都定义一个负责效应物功能的恒定区。人轻链一般分为κ和λ轻链。重链一般分为μ、δ、γ、α或ε，并分别定义抗体的同型为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有包括，但不限于IgGI、IgG2、IgG3和IgG4的几个亚类。IgM具有包括，但不限于IgM1和IgM2的亚类。IgA类似地细分为包括，但不限于IgA1和IgA2的亚类。在全长的轻链和重链之内，可变区恒定区一般通过一个大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包括一个大约10或更多氨基酸的“D”区。见，例如，基础免疫学，第七章，第二版，(Paul，W.编辑)，1989，Raven Press，纽约(为任何目的将其全部内容并入作为参考)。每一个轻/重链对的可变区一般都形成抗原结合位点。
一些已经在骆驼和美洲驼羊中发现的天然出现的抗体，是含有两条重链并且不包括轻链的二聚体。Muldermans等，2001，J.Biotechnol.74277-302；Desmyter等，2001，J.Biol.Chem.27626285-90.本发明包括由两条重链组成的二聚体抗体，它能够结合和/或抑制IFN-γ的生物学活性。骆驼抗体的结晶学研究显示19个氨基酸长的重链CDR3，形成了一个与抗原相互作用的表面并且覆盖了两个其它的高变区。Desmyter等，同上。因而，CDR3对于在二聚体骆驼抗体中，以及在更典型的四聚体抗体中的抗原结合是重要的。
可变区一般显示相同的三个高变区相连的相对保守的框架区(FR)的普通结构，也称为互补决定区或CDRs。来自每对两条链的CDRs一般埋入框架区内，它可以使结合特异性抗原表位成为可能。从N末端到C末端，轻链和重链可变区一般都包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每个结构域的氨基酸的分配一般依照如下面更详细地解释的Kabat等的定义。Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(1991，国立卫生研究院，Bethesda，Md.)；还见Chothia和Lesk，1987，J.Mol.Biol.196901-917；Chothia等，1989，Nature 342878-883。CDRs构成抗原结合的主要表面接触点。见例如Chothia和Lesk，同上。另外，轻链的CDR3和，尤其是重链的CDR 3可以构成在抗原结合中于轻链和重链可变区之内的最重要的决定簇。见Chothia和Lesk，同上；Desiderio等(2001)，J.Mol.Biol.310603-15；Xu和Davis(2000)，Immunity 13(1)37-45；Desmyter等(2001)，J.Biol.Chem.276(28)26285-90；和Muyldermans(2001)，J.Biotechnol.74(4)277-302。在一些抗体中，重链CDR3好象构成了在抗原和抗体之间接触的主要区域。Desmyter等，同上。只有CDR3变化的体外筛选方案能够用于改变一种抗体的结合特性。Muyldermans，同上；Desiderio，同上。
以下列方式能够将CDR s定位于重链可变区序列中。CDR1起始于成熟抗体的大约第31残基处并且通常为大约5-7个氨基酸长，它几乎总是跟在Cys-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx之后(SEQ ID NO48)(其中“Xxx”是任何氨基酸)。在重链CDR1之后的几乎总是一个色氨酸，经常是Trp-Val、Trp-Ile或Trp-Ala。在CDR1中的最后一个残基和CDR2中的第一个残基之间几乎总是14个氨基酸，并且CDR2一般包含16-19个氨基酸。CDR2可以紧接着Leu-Glu-Trp-Ile-Gly(SEQ ID NO49)并可以在后面紧随着Lys/Arg-Leu/IleNal/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala。其它氨基酸可以在CDR2之前或之后。在CDR2中的最后一个残基和在CDR3中的第一个残基之间几乎总是32个氨基酸，并且CDR3可以从大约3-25个残基长。Cys-Xxx-Xxx总是紧连着在CDR3之前，而Trp-Gly-Xxx-Gly(SEQ ID NO50)几乎总是在CDR3之后。
以下列方式能够将轻链CDRs定位于轻链序列中。CDR1起始于成熟抗体的大约第24残基处并且通常为大约10-17个残基长。它几乎总是跟在一个Cys之后。几乎总是有15个氨基酸在CDR1中的最后一个残基和CDR2中的第一个残基之间，并且CDR2几乎总是7个残基长。CDR2一般跟在Ile-Tyr、Val-Tyr、Ile-Lys或Ile-Phe之后。在轻链CDR2和CDR3之间几乎总是有32个氨基酸，并且CDR3通常是大约7-10个氨基酸长。CDR3几乎总是紧跟在Cys之后并且经常后面接着Phe-Gly-Xxx-Gly(SEQ ID NO51)。
本领域技术人员将意识到CDRs周围的框架区长度可以包含使得它们的长度区别于一般长度的插入或删除。如本文所意指的，重链框架区的长度落入下列范围FR1，0-41个氨基酸；FR2，5-24个氨基酸；FR3，13-42个氨基酸；和FR4，01-21个氨基酸。另外，本发明要求轻链框架区的长度落入下列范围FR1，6-35个氨基酸；FR2，4-25个氨基酸；FR3，2-42个氨基酸；和FR4，0-23个氨基酸。
天然出现的抗体一般包括一个信号序列，它指示抗体进入蛋白质分泌的细胞途径并且它不存在于成熟抗体中。编码本发明抗体的多核苷酸可以编码一种天然出现的信号序列或一种如下所述的异源信号序列。
抗体的体外突变抗体能够在体外进行成熟以生产具有变化的特性的抗体，如对于一种抗原的较高亲和力或一种较低的解离常数。在CDR，特别是CDR3中的仅仅是残基的变异，可以导致结合到相同抗原上的但具有更高亲和力的变化抗体。见例如Schier等，1996，J.Mol.Biol.263551-67；Yang等，1995，J.Mol.Biol.254392-403。本发明包括多种体外筛选方案所产生的抗体，如亲和性突变和/或链混编(shuffling)(Kang等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.8811120-23)，或DNA混编(shuffling)(Stemmer，1994，Nature 370389-391)，通过这些方法可以筛选具有有利特性的抗体。在许多方案中，一种已知的抗体在某些位置，经常是在CDR内于体外被随机打乱并进行筛选操作，由此可以分离具有期望特性的抗体，如对于某一抗原的提高的亲和力。见例如van den Beucken等，2001，J.Mol.Biol.310591-601；Desiderio等，2001，J.Mol.Biol.310603-15；Yang等，1995，J.Mol.Biol.254392-403；Schier等，1996，J.Mol.Biol.263551-67。一般地，依赖于突变和筛选步骤，这种突变抗体可以在一个或多个CDR中包含几个改变的残基。见，例如van den Beucken等，同上。
双特异性或双功能性抗体双特异性或双功能性抗体一般是一种具有两个不同重链/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可以由许多种方法包括，但不限于，杂交瘤融合或F(ab′)片段的连接。见，例如，Songsivilai和Lachmann，1990，Clin.Exp.Immunol.79315-321；Kostelny等，1992，J.Immunol.1481547-1553。
抗体的制备本发明提供特异性结合人IFN-γ的抗体。这些抗体可以通过以全长IFN-γ或其片段的免疫进行生产。本发明的抗体可以是多克隆的或单克隆的和/或可以是重组的抗体。在某些实施方案中，例如，通过能够生产人抗体的转基因动物的免疫来制备完整人抗体(见，例如，国际专利申请公开WO 93/12227)。
本发明的抗IFN-γ抗体的轻链和重链可变区的CDR可以移入来自相同或另一种物种的框架区(FR)。在某些实施方案中，抗IFN-γ抗体的轻链和重链可变区的CDR可以移入一致的人FR中以产生一种“人源化的”抗体。这种人源化的抗体为本发明所包括。为了产生一致的人FR，将来自几种人重链或轻链氨基酸序列的FR进行比对以鉴定一种一致的氨基酸序列。抗IFN-γ抗体的重链或轻链的FR能够用来自不同重链或轻链的FRs进行替换。在抗IFN-γ抗体的重链和轻链的FR中的稀有氨基酸一般不被替换，而其余的FR氨基酸能够被替换。稀有氨基酸是在FR中位置上的特定氨基酸，通常在所述位置不会发现它们。移入的来自本发明的抗IFN-γ抗体的可变区能够与一个恒定区一起使用，所述恒定区与抗IFN-γ抗体的起始恒定区不同。或者，移入的可变区是单链Fv抗体的一部分。CDR移植在例如美国专利号6,180,370、5,693,762、5,693,761、5,585,089和5,530,101中进行了介绍，特此为任何目的将其并入作为参考。
能够利用转基因小鼠制备本发明的抗体，所述转基因小鼠具有插入在小鼠抗体生产细胞中的人抗体生产基因位点的基本部分，并且进一步对其进行设计从而不足以生产内源的鼠抗体。这种小鼠能够生产人免疫球蛋白分子和抗体并且不产生或产生基本上减小的量的鼠免疫球蛋白分子和抗体。用于实现这一结果的技术在本文的说明书中公开的专利、申请和参考文献中进行了公开。在某些实施方案中，熟练的工作人员可以利用如国际专利申请公开号WO 98/24893中所公开的方法，特此为任何目的将其并入作为参考。还见Mendez等，1997，Nature Genetics 15146-156，特此为任何目的将其并入作为参考。
本发明的单克隆抗体(mAb)可以通过许多技术进行生产，例如，Kohler和Milstein(1975，Nature 256495)的标准体细胞杂交技术。尽管体细胞杂交方法在理论上是优选的，依然能够利用其它生产单克隆抗体的技术，例如，B淋巴细胞的病毒性或致瘤性转化。
一种可能用于制备杂交瘤的动物系统是小鼠。小鼠中的杂交瘤生产被非常充分地建立起来，并且免疫化脾细胞的分离以进行融合的免疫方法和技术是本领域公知的。融合配对物(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是公知的。
在一些实施方案中定向于IFN-γ，优选人IFN-γ的完整人单克隆抗体能够利用携带人免疫系统而非小鼠系统的部分的转基因小鼠进行生产。这些转基因小鼠，本文称为“HuMab”小鼠，包含编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小位点，以及灭活内源性μ和κ链位点的靶向突变(Lonberg等，1994，Nature 368856-859)。因此，小鼠显示了小鼠I gM的减弱的表达并且对免疫产生反应，导入的人重链和轻链转基因发生了类型变换和结构突变以产生高亲和力的人IgGκ单克隆抗体(Lonberg等，同上；Lonberg和Huszar，1995，Intern.Rev.Immunol.1365-93；Harding和Lonberg，1995，Ann.N.Y.Acad.Sci.764536-546)。HuMab小鼠的制备在Taylor等，1992，Nucleic Acids Res.206287-6295；Chen等，1993，International Immunology 5647-656；Tuaillon等，1994，J.Immunol.1522912-2920；Lonberg等，1994，Nature 368856-859；Lonberg，1994，Handbook of Exp.Pharmacology 11349-101；Taylor等，1994，International Immunology6579-591；Lonberg&Huszar，1995，Intern.Rev.Immunol.1365-93；Harding和Lonberg，1995，Ann.N.Y.Acad.Sci 764536-546；Fishwildetal.，1996，Nature Biotechnology 14845-851中进行了详细介绍，特此将它们的内容都并入作为参考。另外见全部授予Lonberg和Kay的美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；以及授予Surani等的美国专利号5,545,807；公开于1993年6月24日的国际专利申请号WO 93/1227；公开于1992年12月23日的WO 92/22646；和公开于1992年3月19日的WO 92/03918，特此将它们的全部内容都并入作为参考。或者，能够使用下面实施例中所介绍的HCo7和HCo12转基因小鼠生产人抗IFN-γ抗体。
在这些实施方案中，本发明的抗体以小于10-7M、10-8M、10-9M或10-10M的平衡解离常数(KD)特异性结合到IFN-γ上。在本发明的某些实施方案中，抗体以介于大约10-8M和10-12M之间的平衡解离常数(KD)结合到IFN-γ上。
在优选的实施方案中，本发明的抗体为IgGI、IgG2或IgG4同种型。在其它的实施方案中，本发明的抗体为IgM、IgA、IgE或IgD同种型。在本发明优选的实施方案中，抗体包含一个人κ轻链和一个人IgGI重链。包含一个IgGI重链恒定区的本发明的抗体的表达在下面的实施例中进行介绍。在特定的实施方案中，将抗体的可变区连接到一个除了IgGI同种型的恒定区之外的恒定区上。在某些实施方案中，本发明的抗体已经进行了克隆以在哺乳动物中表达。
在某些实施方案中，对于抗IFN-γ抗体的重链和轻链的保守性改进(和将改进相应于编码核苷酸)将产生具有与那些抗IFN-γ抗体相似的功能和化学特性的抗IFN-γ抗体。相反地，可以通过在重链和轻链的氨基酸序列中筛选取代来实现抗IFN-γ抗体功能和/或化学特性的实质性改进。所述取代在其保持(a)在取代区的分子主链的例如，作为β折叠或螺旋构象的结构，(b)在靶位点分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积的效应上显著不同。
例如，“保守性的氨基酸取代”可以包括以一种非天然残基取代一种天然氨基酸残基从而对在该位置上氨基酸残基的极性或电荷有小的效应或没有效应。而且，多肽中的任何天然残基也可以如先前对于“丙氨酸扫描突变”所介绍的以丙氨酸进行取代。
期望的氨基酸取代(不论是保守的还是非保守的)能够由本领域技术人员在期望这种取代的时间进行确定。在某些实施方案中，氨基酸取代能够用于鉴定抗IFN-γ抗体的重要残基，或提高或降低本文所述的抗IFN-γ抗体的亲和力。
在选择性的实施方案中，本发明的抗体能够在除了杂交瘤细胞系的细胞系的进行表达。在这些实施方案中，编码特定抗体的序列应用用作合适哺乳类宿主细胞的转化。根据这些实施方案，能够利用任何公知的将多核苷酸导入宿主细胞的方法实现转化，包括，例如将多核苷酸组装于病毒中(或到病毒载体中)并以病毒(或载体)转导宿主细胞或通过休领域公知的转染方法，如美国专利号4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455(特此为任何目的将它们并入作为参考)所例示的。通常，所用的转化方法可以依赖于待转化的宿主。将外源多核苷酸导入哺乳类细胞的方法是本领域所公知的并且包括，但不限于，葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、多聚季胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸于脂质体中的包装，和DNA直接微注射入核中。
本发明包括编码本发明的抗IFN-γ抗体的重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区或轻链可变区的氨基酸序列的核酸分子(或多核苷酸)。这种多核苷酸能够利用标准连接技术插入适合的表达载体中。在优选的实施方案中，将编码抗IFN-γ抗体重链或轻链恒定区的多核苷酸添加于编码适合的可变区的多核苷酸的下游末端并连接入一个表达载体中。一般选择该载体在所用特定宿主细胞中是功能性的(即，该载体与宿主细胞结构相兼容从而基因的扩增和/或基因的表达可以发生)。对于表达载体的论述，见METH.ENZ.185(Goeddel，编辑)，1990，学术出版社。
一般地，用于任何宿主细胞中的表达载体都将包含用于质粒保持和外源核苷酸序列的克隆和表达的序列。在某些实施方案中这种统称为“侧翼序列”的序列一般将包括一种或多种下列核苷酸序列启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、包含供体和受体接合位点的完整的内含子序列、编码多肽分泌的引导序列的序列、核糖体结合位点、多聚腺苷酸化序列、插入编码待表达的多肽的核酸的多联结子区，和一个可选择的标记物元件。这些序列的每种都在下面进行讨论。
任选地，载体可以包含一个“标签”编码序列，即一位定位于抗IFN-γ抗体多肽编码序列的5’或3’端的寡核苷酸分子；该寡核苷酸序列编码多聚组氨酸(如六组氨酸)，或另一种“标签”如FLAG、HA(红血球凝聚素流感病毒)，或商业上存在现有抗体的myc。这种标签一般在多肽的表达后融于多肽中，并且能够作为一种亲和性纯化或来自宿主细胞的IFN-γ抗体的检测手段而起作用。亲和性纯化能够，例如，通过利用相对于标签的抗体作为亲和性基质的柱层析来实现。任选地，标签随后能够通过各种方法如利用某些肽酶进行剪切从纯化的抗IFN-γ抗体多肽中去除。
侧翼序列可以是同源的(即，来自与宿主细胞相同物种和/或品系)、异源的(即，来自与宿主细胞不同的物种或品系)、杂合的(即，来自一个以上来源的侧翼序列)、合成的或天然的。像这样，侧翼序列的来源可以是任何原核的或真核的生物，任何脊椎动物或无脊椎动物，或任何植物，只要该侧翼序列在宿主细胞结构中是功能性的并能够被宿主细胞结构所激活。
在本发明的载体中有用的侧翼序列可以通过任何本领域所公知的几种方法获得。一般地，本文有用的侧翼序列已由图谱和/或限制性内切酶消化所鉴定并且因而能够利用适当的限制性内切酶从适合的组织来源中分离出来。在一些情况中，完整的侧翼序列的核苷酸序列可以是已知的。在此，侧翼序列可以利用本文所述的核酸合成或克隆的方法进行合成。
不论侧翼序列的全部或仅仅一部分是已知的，它都可以利用聚合酶链式反应(PCR)和/或通过以适当的探针筛选基因组文库而获得，所述探针如寡核苷酸和/或来自相同或另一种物种的侧翼序列片段。当侧翼序列未知时，可以从较大片段的DNA中分离出含有侧翼序列的DNA片段，所述较大片段的DNA可以包含，例如，一个编码序列或甚至是另一种或多种基因。分离可以通过限制性内切酶消化以生产适合的DNA片段，随后通过利用琼脂糖凝胶纯化、Qiagen柱层析(Chatsworth，CA)，或其它的熟练技术人员所公知的方法进行分离而实现。实现这一目的的适合的酶的筛选对于本领域普通技术人员将是显而易见的。
复制的起点一般是那些商业购买的原核表达载体的一部分，并且该起点有助于宿主细胞中的载体的扩增。如果选择的载体不包含复制位点的起点，可以基于已知的序列进行化学合成，并连接到载体中。例如，来自质粒pBR322的复制起点对于大多数革兰氏阴性细菌是适合的，并且各种病毒的起点(例如，SV40、多瘤、腺病毒、水泡性口炎病毒(VSV)，或乳头状瘤病毒如HPV或BPV)对于在哺乳类细胞中克隆载体是有用的。通常，复制组分的起点对于哺乳类表达载体是不需要的(例如，SV49起点只是由于它也包含于病毒早期启动子中而经常进行应用)。
转录终止序列一般位于一个多肽编码区的3’末端并作用来终止转录。通常，原核细胞中的转录终止序列是后面跟着多聚-T序列的富G-C片段。尽管该序列容易作为载体的一部分从文库中或者甚至商业购买，它还能够轻易地利用核酸合成的方法如本文所介绍的那些进行合成。
可选择的标记物基因编码一种对于生长在选择性培养基中的宿主细胞的存在和生长必需的蛋白质。典型的选择标记物基因编码(a)赋予原核宿主细胞对于抗生素或其它毒素，例如氨苄青霉素、四环素、卡那霉素的抗性；(b)细胞的补充营养缺陷，或(c)提供复合培养基或成份确定的培养基所不具有的关键营养物的蛋白质。优选的可选择标记物为卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。有益地，新霉素抗性基因也可以用于在原核的和真核的宿主细胞中的筛选。
其它可选择的基因可以用于扩增将要表达的基因。扩增是基因在重组细胞继代的染色体内顺序地进行重复，所述基因对于对生长或细胞存活关键的蛋白质的生产所必需的。哺乳类细胞的适合的可选择标记物包括二氢叶酸原酶(DHFR)和无启动子的胸腺嘧啶核苷激酶基因。哺乳类细胞转化子在选择压力下得以安排，其中只有重组子由于存在于载体中的可选择基因独特地适于存活。通过在培养基中选择剂的浓度连续升高，由此导致可选择基因和编码另一种基因的DNA二者的扩增的条件下培养转化细胞来施加选择压力，所述另一种基因如结合到IFN-γ多肽上的抗体。作为结果，多肽如抗IFN-γ抗体的增加量由扩增的DNA所合成。
核糖体结合位点通常对于mRNA的翻译起始是必需的并且特征是Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)。该元件一般位于启动子的3’和待表达多肽的编码序列的5’。
在一些情况中，如在真核宿主细胞表达系统中想要糖基化作用的情况中，可以制作各种前序列或原序列以增强糖基化作用或产量。例如，可以改变特定信号肽的肽酶剪切位点，或添加也可以影响糖基化作用的原序列。最终蛋白质产物可以在-1位置(相对于成熟蛋白质的第一个氨基酸)具有一个或多个表达所附带的额外的氨基酸，它可能还未被完全去除。例如，最终蛋白质产生可以具有在肽酶剪切位点发现的一个或两个附于氨基末端的氨基酸残基。或者，如果酶在成熟多肽内的这种区域内剪切的话，一些酶切位点的应用可以导致期望多肽的截短形式。
本发明的表达和克隆载体一般将包含为宿主细胞所识别的启动子并可操作性地连接于编码抗IFN-γ抗体的分子上。启动子是位于一个结构基因(通常在大约100-1000bp之内)的起始密码子的上游(即，5’)的非转录序列。传统上将启动子分入两类之一可诱导的启动子和基本启动子。相应于培养条件的某种变化，如营养物的存在或缺失或温度的变化，启动子启动在其控制下的由DNA转录的增强的水平。另一方面基本启动子均一地对它们所操作性连接的基因进行转录，即，在基因表达上有小的或没有控制。通过将启动子以限制性酶消化从源DNA上去除并且将期望的启动子序列插入载体中，将适合的启动子操作性地连接到含有本发明的抗IFN-γ抗体的编码重链或轻链的DNA上。
适用于酵母宿主细胞的启动子也是本领域所公知的。酵母增强子有益地与酵母启动子一起使用。适用于哺乳类宿主细胞的启动子是公知的并且包括，但不限于，那些由病毒如多瘤病毒、鸡痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、鸟肉瘤病毒、巨细胞病毒、反转录病毒、乙肝病毒和最优选的猿猴病毒40(SV40)的基因组获得的启动子。其它适合的启动子包括异源哺乳类启动子，例如，热激启动子和肌动蛋白启动子。
另外的目标启动子包括，但不限于SV40早期启动子(Benoist和Chambon，1981，Nature 290304-10)；CMV启动子(Thomsen等，1984，Proc.Natl.Acad.USA 81659-663)；包含于劳氏肉瘤病毒的3’长末端重笔中的启动子(Yamamoto等，1980，Cell 22787-97)；疱疹胸腺嘧啶核苷激酶启动子(Wagner等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.781444-45)；来自金属硫蛋白基因的启动子和调控序列(Brinster等，1982，Nature 29639-42)；和原核启动子如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，753727-31)；或tac启动子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，8021-25)。下列动物转录控制区也是目标，它们显示组织特异性并且已用于转基因动物中在胰腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等，1984，Cell 38639-46；Ornitz等，1986，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50399-409(1986)；MacDonald，1987，Hepatology7425-515)；在胰β细胞中有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan，1985，Nature 315115-22)；在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grossched1等，1984，Cell 38647-58；Adames等，1985，Nature 318533-38；Alexander等，1987，Mol.Cell.Biol.，71436-44)；在睾丸、乳房、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳癌病毒控制区(Leder等，1986，Cell 45485-95)；在肝中有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等，1987，Genes and Devel.1268-76)；在肝中有活性的α-feto-蛋白基因控制区(Krumlauf等，1985，Mol.Cell.Biol.，51639-48；Hammer等，1987，Science 23553-58)；在肝中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等，1987，Genesand Devel.1161-71)；在髓样细胞中有活性的β-珠蛋白基因控制区(Mogram等，1985，Nature 315338-40；Kollias等，1986，Cell4689-94)；在脑中的少突胶质细胞中有活性的髓磷脂碱性蛋白基因控制区(Readhead等，1987，Cell 48703-12)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区白(Sani，1985，Nature 314283-86)；和在下丘脑有活性的促性腺释放激素基因控制区(Mason等，1986，Science 2341372-78)。
可以将增强子序列插入到载体中以增强较高等真核生物的编码包含本发明的抗IFN-γ抗体的轻链或重链的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通过大约10-300长，它作用于启动子上以增强转录。增强子是相对地定向和位置独立的，已在转录单位的5’和3’都被发现。几种现有的来自哺乳类基因的增强子序列是已知的(例如，珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎-蛋白基因和胰岛素)。但是一般地，使用来自病毒的增强子。本领域公知的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤增强子和腺病毒增强子是用于激活真核启动子的例示性增强元件。尽管增强子可以位于编码序列的5’或3’，它一般位于启动子的5’位点上。
能够将编码适当的天然或异源信号的序列整合进表达载体中，以促进抗体的胞外分泌。信号肽或引导肽的选择依赖于生产抗本的宿主细胞的类型，并且异源信号序列能够替换天然信号序列。在哺乳类宿主中为功能性的信号肽的例子包括下列在美国专利号4,965,195中所介绍的白介素7(IL-7)的信号序列；在Cosman等(1984，Nature 312768)中介绍的白介素2受体的信号序列；在EP专利号0367566中介绍的白介素4受体的信号肽；在美国专利号4,968,607中介绍的I型白介素1受体信号肽；在EP专利号0460846中介绍的II型白介素1受体信号肽；人IgK的信号序列(为METDTLLLWVLLLWVPGSTG；SEQ ID NO52)；人生长激素的信号序列(为MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA；SEQ IDNO53)；和人信号序列MGSTAILALLLAVLQGVCA(SEQ ID NO54)和METPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO55)，其由编码在实施例3中所分离的重链和轻链的cDNAs所编码。
本发明的表达载体可以由一种起始载体如一种商业上现有的载体进行构建。这种载体可以包含或不包含所有的期望的侧翼序列。当本文所述的一种或多种侧翼序列并非已然存在于载体中时，它们可以个别地获得并连接入载体中。用于获得每种侧翼序列的方法对于本领域技术人员是公知的。
在构建载体以有将编码轻链、重链或包含抗IFN-γ抗体的轻链和重链的核酸分子插入载体的适当位点以后，可以将完整的载体插入适合的宿主细胞以进行扩增和/或多肽的表达。抗IFN-γ抗体的表达载体转化入一个选择的宿主细胞中可以通过公知的方法如转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、微注射、脂染、DEAE-葡聚糖介导的转染，或其它公知的技术来实现。选择的方法将部分地是所用宿主细胞的一种功能。这些方法和其它适合的方法对于熟练的技术人员是公知的，并且例如在Sambrook等，同上中进行了阐明。
当在适当的条件下进行培养时，宿主细胞合成随后能够从培养基中(如果宿主将它分泌入培养基的话)或直接从生产它的宿主细胞中(如果它不进行分泌)收集的抗IFN-γ抗体。适当的宿主细胞的筛选将依赖于多种因素，如期望的表达水平、期望的或对活性必需的多肽修饰(如糖基化作用或磷酸化作用)以及折叠成生物学活性分子的轻易性。
现有的作为表达宿主的哺乳类细胞系是本领域公知的并且包括，但不限于，来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的现有的永生化细胞，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)，以及许多其它细胞系。在某些实施方案中，细胞系可以通过测定哪些细胞系具有高表达水平并且基本上产生具有IFN-γ结合特性来进行选择。在另一个实施方案中，能够选择一种不生产其自身的抗体但却具有生产并分泌异源抗体的来自B细胞谱系的细胞系。
本发明的抗体对于检测生物样品中的IFN-γ以及鉴定生产IFN-γ蛋白质的细胞或组织是有用的。特异性结合到IFN-γ上的本发明的抗体可以在治疗IFN-γ介导的疾病中是有用的。所述抗体能够用于结合分析中以检测IFN-γ产抑制IFN-γ与IFN-γ受体形成一种复合物。所述结合到IFN-γ上并阻抑与其它结合性化合物的相互作用的抗体可以在调节IFN-γ介导的疾病中具有治疗用途。在优选的实施方案中，IFN-γ的抗体可以阻抑IFN-γ结合到它的受体上，这可以导致IFN-γ诱导的信号转导级联的中断。
在一些实施方案中，本发明提供了与可药用的溶剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂一起含有治疗上有效量的一种或多种本发明的抗体的药物组合物。优选地，可接受的制剂材料在应用的剂量和浓度上是对受试者无毒的。在优选的实施方案中，提供了含有治疗上有效量的抗IFN-γ抗体的药物组合物。
在一些实施方案中，可接受的制剂材料在应用的剂量和浓度上优选是对受试者无毒的。
在某些实施方案中，药物组合物可以包含用于改进、保持或保留，例如，组合物的pH、容积渗透克分子浓度、粘性、澄明度、颜色、等渗性、气味、无菌、稳定性、溶解或释放速率、吸附或穿透。在这些实施方案中，适合的制剂材料包括，但不限于，氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗菌剂；抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCI、柠檬酸盐、磷酸盐或其它有机酸)；增量剂(如D-甘露醇或或甘氨酸)；螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；复合剂(如咖啡因，聚乙烯吡咯烷酮，β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填料；单糖；二糖；和其它糖类(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色、调味和稀剂；乳化剂；亲水的聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；形成盐的阴离子(如钠)；防腐剂(如氯苄烷铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、羟苯甲酯、羟苯丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如D-甘露醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或潮湿剂(如聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物，PEG，脱水山梨糖醇酯，聚山梨酯如聚山梨酯20、聚山梨酯80，曲酮，氨丁三醇，卵磷脂，胆固醇，泰洛沙泊)；稳定性增强剂(如蔗糖或山梨糖醇)；弹性增强剂(如碱金属卤化物，优选氯化钠或氯化钾，D-甘露醇山梨糖醇)；递送介质；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。见REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，(A.R.Gennaro编辑)，1990，Mack Publishing Company。
在某些实施方案中，本领域技术人员将依赖于，例如，预期的给药途径、递送格式和希望的剂量来确定最佳的药物组合物。见，例如，REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，同上。在某些实施方案中，这种组合物可以影响本发明抗体的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。
在某些实施方案中，在药物组合物中的基本介质或载体本质上既可以是水样的也可以是非水样的。例如，适合的介质或载体可以是注射用水、生理盐水或人造脑脊液，可能会补充以其它在肠胃外给药的组合物中的普通材料。中性缓冲的盐水或混以血清白蛋白的水是另外的示例性介质。在优选的实施方案中，药物组合物包含pH约7.0-8.5的Tris缓冲液，或pH约4.0-5.5的醋酸缓冲液，并可以进一步包括山梨糖醇或其适合的替代品。在本发明的某些实施方案中，抗IFN-γ抗体的组合物可以通过将选择的具有期望纯度的组合物与优选的冻干块状或水溶液形式的制剂(REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，同上)相混合来制备以进行保藏。另外，在某些实施方案中，抗IFN-γ抗体产品可以利用适当的赋形剂如蔗糖制成冻干品。
可以选择本发明的药物组合物进行肠胃外的递送。或者，可以选择该组合物进行吸入或通过消化道，如口服进行递送。这种可药用的组合物的制备是本领域所公知的。
优选制剂成分以给药位点可以接受的浓度存在。在某些实施方案中，使用缓冲液以将组合物保持于生理pH上或稍低的pH上，一般在从大约5到大约8的pH范围之内。
当打算进行肠胃外给药时，可以以无热原的、肠胃外可接受的水溶液的形式提供用于本发明的治疗性组合物，它含有期望的在可药用的介质中的抗IFN-γ抗体。一种对于肠胃外注射特别适合的介质是无菌蒸馏水，抗IFN-γ抗体在其中制成一种适当贮存的无菌的等渗溶液。在某些实施方案中，制备可以包括期望的分子与一种试剂，如可注射的微球、生物可侵蚀的颗粒、聚合的化合物(如聚乳酸或聚羟乙酸)、珠或脂质体的配剂，这可以提供能够通过长效注射递送的产品的受控制的或持续的释放。在某些实施方案中，可植入的药物递送装置可以用来导入期望的抗体分子。
本发明的药物组合物能够配剂成吸入剂。在这些实施方案中，将抗IFN-γ抗体有益地配剂成干燥的可吸入的粉末。在优选的实施方案中，也可以与一种推进剂一起来配制一种抗IFN-γ抗体吸入剂溶液以进行气雾剂给药。在某些实施方案中，溶液可以进行雾化。在国际专利申请号PCT/US94/001875中进一步介绍了肺部给药及其配制方法，并介绍了化学修饰的蛋白质的肺部给药，将其并入作为参考。
还设想配剂能够进行口服给药。以这种方式给药的抗IFN-γ抗体能够与或不与通常用于固体配药形式如片剂和胶囊中的载体一起进行配制。在某些实施方案中，可以将胶囊设计为在胃肠道的点上于生物有效性最大化和系统前降解最小化时释放制剂的活性部分。能够包括额外的试剂以促进抗IFN-γ抗体的吸收。还可以采用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、滑润剂、悬浮剂、片剂分解剂和粘合剂。
优选提供本发明的药物组合物包含与非毒性赋形剂一起在混合物中的有效量的一种或多种抗IFN-γ抗体，所述非毒性赋形剂适于片剂的生产。通过将片剂溶于无菌水，或另一种适当的介质中，可以以单位剂量形式制备溶液。适合的赋形剂包括，但不限于，惰性释稀剂，如碳酸钙、碳酸钠、重碳酸钠、乳糖或磷酸钙；或结合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
其它的药物组合物对于本领域技术人员是显而易见的，包括含有以持续性或控制性给药形式存在的抗IFN-γ抗体的制剂。配制多种其它持续性的或控制性方法的技术，如脂质体载体、生物可侵蚀的微粒或多孔珠和长效注射，也是本领域技术人员所公知的。见，例如，国际专利申请号PCT/US93/00829，将其并入作为参考而且它介绍了多孔聚合微粒进行药物组合物给药的控制性释放。
持续性释放制品可以包括以成形商品形式存在的半透性聚合物基质，例如膜或微胶囊。持续性释放基质可以包括聚酯、水凝胶、聚丙交酯(如在美国专利号3,773,919和欧洲专利申请公开号EP 058481中所介绍的，将它们都并入作为参考)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸盐的共聚物(Sidman等，1983，Biopolymers 22547-556)，多聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等，1981，J.Biomed.Mater.Res.15167-277和Langer，1982，Chem.Tech.1298-105)、醋酸乙烯酯(Langer等，同上)或多聚-D(-)-3-羟丁酸(欧洲专利申请号EP133,988)。持续性释放组合物还可以包括能够通过本领域公知的几种方法的任何一种制备的脂质体。见例如，Eppstein等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 823688-3692；欧洲专利申请号EP 036,676；EP 088,046和EP 143,949，将其并入作为参考。
一般将用作体内给药的药物组合物提供为无菌制品。能够由通过无菌滤膜的过滤来实现灭菌。当对组合物进行冻干时，利用这种方法的灭菌可以在冻干和恢复之前或之后进行。肠胃外给药的组合物能够以冻干的或在溶液中的形式保存。一般将肠胃外组合物放置入一个具有无菌存取口的容器中，例如一种静脉内溶液包或具有一个可被皮下注射针刺穿的塞子的小玻璃瓶。
一旦配制好药物组合物，就可以将它作为溶液、悬浮液、凝胶、乳剂、固体、晶体或作为脱水的或冻干的粉末保存于无菌小玻璃瓶中。这种制剂既可以以即用形式也可以以在给药之前恢复的形式(例如，冻干的)进行保存。
本发明还提供生产单一剂量给药单位的试剂盒。本发明的试剂盒每种都可以包含一个具有干燥蛋白质的第一容器和一个具有水样制剂的第二容器。在本发明的某些实施方案中，提供包含单一和多管预充满的注射器(例如，液体注射器和冻干注射器)的试剂盒。
要应用的含有治疗有效量的抗IFN-γ抗体的药物组合物将依赖于例如治疗的环境和对象。本领域技术人员将会理解治疗的适当剂量的水平将部分地依赖于递送的分子、使用抗IFN-γ抗体针对的适应征、给药途径，和病人的大小(体重、体表或器官大小)和/或状况(年龄和综合健康)而变化。在某些实施方案中，临床医生可以测定剂量的效价和改进给药途径以获得最佳治疗效果。标准的剂量依赖于上面提到的因素可以从大约0.1μg/kg到高达大约30mg/kg或更高的范围变动。在优选的实施方案中，剂量可以从0.1μg/kg到高达大约30mg/kg的范围变动，优选从1μg/kg到高达大约30mg/kg或从大约10μg/kg到高达大约5mg/kg。
服药频率将依赖于在所用制剂中特定抗IFN-γ抗体的药物动力学参数。一般地，临床医生给药组合物直到达到实现期望效果的剂量。组合物可以随着时间给药为单次剂量，或为二次或更多剂量(可以包含或不包含期望分子的相同量)，或为通过植入装置或导管的持续性输液。适当剂量的进一步的改进为本领域技术人员常规地进行并且是在他们常规进行的工作范围之内。适当的剂量可以通过使用适当的剂量反应数据来确定。在某些实施方案中，能够长时期对病人给药本发明的抗体。本发明抗体的慢性给药使通常与针对人抗原在非人动物中培养的抗体，例如，在非人物种中生产的非完整人抗体或非人抗体，相关联的不良免疫或变应性反应最小化。
药物组合物的给药途径是依照已知的方法，例如，口服，通过静脉内、腹膜内、脑内(实质体内)、脑室内、肌内、眼球内、动脉内、门内、病灶内途径；通过持续性释放系统或通过植入装置的注射。在某些实施方案中，组合物可以通过快速浓注或持续地通过输液或通过植入装置进行给药。
组合物还可以通过一种吸收或包入了期望的分子的膜、海绵或另一种适合的材料的植入而进行局部给药。在某些实施方案中，在使用一种植入装置时，该装置可以植入任何适合的组织或器官中，以通过扩散、定时的丸剂或持续性给药进行期望分子的给药。
先体外后体内地应用根据本发明的抗IFN-γ抗体药物组合物也是可以期望的。在这种情况中，将从病人中移除的细胞、组织或器官暴露于抗IFN-γ抗体药物组合物中，随后将细胞、组织和/或器官移植回病人体内。
特别地，抗IFN-γ抗体能够通过利用如本文所述的那些方法植入某些已经遗传工程化的细胞以表达和分泌多肽来进行给药。在某些实施方案中，这种细胞可以是动物或人细胞，并且可以是自体同源的、异源的或异种的。在某些实施方案中，细胞可以进行永生化。
在其它实施方案中，为了减少免疫反应的机会，可以将细胞进行包裹以避免周围组织的渗透。在另外的实施方案中，包裹材料一般是生物适合的、半浸透性的聚合外壳或膜，它允许蛋白质产生释放但阻止细胞被病人的免疫系统或被来自周围组织的有害因子破坏。
实施例下列实施例，包括进行的实验和获得的结果仅仅为说明性的目的而提供并且不解释为限制发明。
实施例1由CHO细胞生产人IFN-γ蛋白质利用人脾Marathon-Ready cDNA(Clontech)作为模板通过PCR扩增全长人IFN-γcDNA。将该序列亚克隆入pDSRα2质粒。以pDSRα2质粒转化DH10B(大肠杆菌(Escherichia coli))细胞。利用标准技术制备DNA，并通过磷酸钙法(Speciality Media，Inc.)转染CHO细胞。使用一种高表达细胞无性繁殖系生产无血清的限制性培养基。
将包含人IFN-γ(hu-IFN-γ)的CHO细胞限制性培养基通过几种层析步骤进行浓缩、透析和纯化。第一步是利用标准NaCl梯度将高度糖基化的hu-IFN-γ从未糖基化的hu-IFN-γ中分离出来的Q-HP(Pharmacia)进行层析。通过麦芽精凝集素层析(EY Laboratories)进一步纯化Q-HP合并物。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离纯化的物质并通过考马斯亮兰和银染进行分析。如通过考马斯亮兰和银染SDS-PAGE测定的纯化的物质纯度大于95％。还通过凝胶凝结法(Limulus Amebocyte Lysate)对该物质进行分析，显示低的内毒素水平。通过使用来自R&D Systems的抗AF-285NA抗体的蛋白质印迹法对hu-IFN-γ的同一性进行确认。最终蛋白质浓度利用消光系数法由吸光度(A280)进行测定，其中A280读数/消光系数＝g/L浓度(消光系数＝0.66)。
实施例2抗IFN-γ的人单克隆抗体的生产转基因人单克隆抗体小鼠利用表达人抗体基因的转基因小鼠的HCo7、HCo12和HCo7+HCo12链制备IFN-γ的完整人单克隆抗体。在这些链的每条中，内源性小鼠κ轻链基因已经如Chen等(1993，EMBOJ.12811-820)中所述的进行了纯合子分裂，并且内源性的小鼠重链基因已经如国际申请公开号WO01/09187(并入作为参考)的实施例1中所述的进行了纯合子分裂。如Fishwild等(1996，Nature Biotechnology 14845-851)中所述的，每条链f都携带一个κ轻链转基因KCo5。如美国专利号5,545,806、5,625,825和5,545,807(并入作为参考)中所述的HCo7携带HCo7人重链转基因。如国际专利申请公开号WO01/09187(并入作为参考)的实施例2中所述的HCo12链携带HCo12人重链转基因。HCo7+HCo12链携带HCo7和HCo12两种重链转基因并且每种转基因都是半合子的。所有这些链本文都称为HuMab小鼠。
HuMab免疫为了生产IFN-γ的完整人单克隆抗体，以源自大肠杆菌或CHO细胞的纯化的重组人IFN-γ作为抗原对HuMab小鼠进行免疫。对于通常的HuMab小鼠的免疫方案在Lonberg等(1994，Nature 368856-859；Fishwild等，同上，和国际专利申请公开号WO 98/24884，将每篇的教示都并入作为参考)中进行了介绍。在第一次输入抗原时小鼠为6-16星期大。将一种纯化的IFN-γ抗原重组制品(25-100μg)(例如，由转染的表达IFN-γ的大肠杆菌或CHO细胞所纯化的)用于腹膜内(IP)或皮下(Sc)免疫HuMab小鼠。
使用在完全弗氏佐剂和两种注射剂中的抗原进行HuMab转基因小鼠的免疫，随后以在非完全弗氏佐剂中的抗原进行2-4星期的IP免疫(多至总共9次免疫)。用每种抗原对几打小鼠进行免疫(在大肠杆菌或CHO细胞中生产的人IFN-γ)。用IFN-γ免疫了总共91只HC07、HC012和HC07+HC012链的小鼠。通过眶后放血监测免疫反应。
为了筛选结合IFN-γ的HuMab小鼠，通过Fishwild等，同上所述的ELISA测试来自免疫小鼠的血清。简言之，以来自CHO细胞或大肠杆菌的于PBS中的1-2μl/mL的纯化的重组IFN-γ涂布微量滴定板并以50μl/孔于4℃过夜温育，随后以200μl/孔的于PBS/Tween(0.05％)中的5％鸡血清进行封闭。将来自IFN-γ免疫小鼠的血浆稀释物加至每孔中并于环境温度温育1-2小时。以PBS/Tween洗涤板并且随后以共轭于辣根过氧化物酶(HRP)上的羊抗人IgG Fc特异性多克隆试剂于室温温育1小时。洗涤后，以ABTS底的(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，Catalog No.A-1888，0.22mg/mL)对板进行显影并通过于415-495nm波长处测定光学密度(OD)进行分光光度计测量分析。使用具有足够效价的抗IFN-γ人免疫球蛋白如下所述生产单克隆抗体。
产生IFN-γ的人单克隆抗体的杂交瘤的生产通过在处死之前2天静脉内注射抗体来制备进行单克隆抗体生产的小鼠，其后将脾去除。将小鼠脾细胞从HuMab小鼠中分离出来并利用标准方法以PEG融合于小鼠骨髓瘤细胞系中。一般地，对于每种抗原进行10-20次融合。
简言之，将来自免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液用50％PEG(Sigma)融合于1/4数目的P3X63-Ag8.653非分泌性小鼠骨髓瘤细胞中(ATCC，登录号CRL 1580)。将细胞以1×105/孔置于平底微量滴定板上，随后在含有10％小牛血清、10％P388D1-(ATCC，登录号CRLTIB-63)限制性培养基、3-5％ORIGEN杂交瘤克隆因子(IGEN)、于DMEM(Mediatech，目录号CRL 10013，具有高葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠)加5mM HEPES中的源自用于培养鼠巨噬细胞样细胞系的培养基的一种部分纯化的杂交瘤生长培养基添加物、0.055mM 2-巯基乙醇、50mg/mL庆大霉素，和1×HAT(Sigma，目录号CRL P-7185)的选择性培养基中温育大约两周。1-2周后，在将HAT以HT替换的培养基中培养细胞。
筛选得到的杂交瘤以进行抗原特异性抗体的生产。通过ELISA(如上所述)对个别的孔筛选人抗IFN-γ单克隆IgG抗体。一旦发生广泛的杂交瘤生长，通常在10-14天之后，对培养基进行监测。对分泌抗体的杂交瘤进行replated，再次筛选并且，如果对人IgG仍然是阳性的话，将抗IFN-γ单克隆抗体通过有限稀释亚克隆至少两次。随后将稳定的亚克隆在体外进行培养以在组织培养基中生产少量的抗体进行纯化和特征鉴定。
结合IFN-γ上的人单克隆抗体的选择使用如上所述的ELISA分析筛选显示与IFN-γ免疫原阳性反应的杂交瘤。将分泌单克隆抗体的杂交瘤进行亚克隆并且进一步进行特征鉴定，所述单克隆抗体以高度的亲和力结合到IFN-γ上。选择保持亲本细胞反应性(如通过ELISA所测定的)的每个杂交瘤的一个克隆以做成保存于液氮中的5-10小瓶的细胞库。
进行同种型特异性的ELISA以测定如本文所公开的产生的单克隆抗体的同种型。在这些实验中，以50μL/孔的1μg/mL的于PBS中的小鼠抗人κ轻链涂布微量滴定板的孔燕于4℃过夜培养。以5％的鸡血清进行封闭之后，将板与来自每种测试单克隆抗体的上清液和一种纯化的同种型对照进行反应。将板于环境温度下温育1-2小时。随后将孔与人IgG1或IgG3特异性辣根过氧化物酶反应共轭的羊抗人多克隆抗血清反应，并且如上所述对板进行显影和分析。
利用多种如下所述的生物分析对由杂交瘤上清液中纯化的单克隆抗体进一步测试生物学活性，所述杂交瘤上清液显示显著结合于IFN-γ上。选择的抗体命名为1119、1121、1118*、1121*和1118。
实施例3克隆抗IFN-γ抗体重链和轻链将表达上面实施例2中鉴定的IFN-γ结合单克隆抗体1119、1121、1118*、1121*和1118的杂交瘤用作利用适于分离总RNA、DNA和蛋白质的TRIzol试剂(Invitrogen)、苯酚的单相溶液和异硫氰胍来分离总RNA的来源。利用具有延伸接头(5′-GGC CGG ATA GGC CTC CAN NNNNNT-3′)(SEQ ID NO23)的随机引物合成第一链cDNA并且根据来自生产商的说明书利用GENERACERTM试剂盒(Invitrogen)进行5′RACE(cDNA末端的快速扩增)预备性分析，所述试剂盒是用来以提高的效率进行cDNA末端的快速扩增(RACE)的。对于制备编码完整轻链的cDNA，正向引物为GENERACERTM巢式引物，而反向引物为5′-GGG GTC AGG CTGGAA CTG AGG-3′(SEQ ID NO24)。反向引物被设计来识别在人κ链的3’非翻译区中发现的cDNA序列的保守区。对于制备编码重链的可变区的cDNA，正向引物为GENERACERTM巢式引物，而反向引物为5′-TGAGGA CGC TGA CCA CAC G-3′(SEQ ID NO25)，它被设计来识别人IgG链的Fc区中编码序列的保守区。将RACE产物克隆入pCR4-TOPO(Invitrogen)，测定序列。将一致的序列用来设计全长抗体链PCR扩增的引物。
对于制备编码抗IFN-γκ轻链的cDNA，5’PCR引物编码信号序列的氨基末端、一个XbaI限制性位点和一个优化的Kozak序列(5′-ACA ACAAAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA AAC CCC AGC TCA GCT TCTCTT-3′；SEQID NO26)。3′引物编码羧基末端和终止密码子，以及一个SalI限制性位点(5′-CTT GTC GAC TCA ACA CTC TCC CCT GTT GAAGCT-3′；SEQID NO27)。将得到的PCR产物进行纯化，以XbaI和SalI进行消化，并且随后进行凝胶分离并连接入哺乳类表达载体pDSRα19(见国际申请公开号WO 90/14363，本文为任何目的将其并入作为参考)。
对于制备编码抗IFN-γ重链的cDNA，5’PCR引物编码信号序列的氨基末端、一个XbaI限制性位点和一个优化的Kozak序列(5′-CAG CAGAAG CTT CTA GAC CAC CAT GGG GTC AAC CGC CAT CCTCG-3′；SEQ IDNO28)。3′引物编码可变区的羧基末端，包括一个天然出现的有义链BsmBI位点(5′-CTT GGT GGA GGC ACT AGA GAC GGT GAC CAG GGTGCC ACGGCC-3′；SEQ ID NO29)。将得到的产物进行纯化，以XbaI和BsmBI进行消化，凝胶分离并连接入包含人IgG1恒定区的pDSRα19载体(见国际申请公开号WO 90/14363，本文为任何目的将其并入作为参考)。
实施例4在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的抗IFN-γ抗体的表达通过利用磷酸钙法将1119重链/pDSRα19和1119κ链/pDSRα19质粒共转染入二氢叶酸还原酶缺陷的(DHFR-)、无血清的适合的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中来实现1119抗IFN-γmAb的稳定表达。在含有透析的血清但不含有次黄嘌呤-胸腺嘧啶核苷的培养基中选择转染的细胞以确保表达DHFR酶的细胞的生长。利用测试法如ELISA来筛选转染的细胞从而检测在限制性培养基中1119抗IFN-γmAb的表达。将1119表达细胞系进行氨甲蝶呤扩增。选择扩增后高最高表达的克隆进行单细胞克隆和细胞库的生产。
任何本发明的重组抗IFN-γ抗体都能够利用与上述1119mAb相同的方法在缺少DHFR的中国仓鼠卵巢细胞中产生。将编码每种本发明的抗IFN-γ抗体的完整重链或轻链的DNA克隆入表达载体中。以一种能够表达完整重链的表达载体和一种表达适当抗IFN-γ抗体的完整轻链的表达载体对缺少DHFR的CHO细胞进行共转染。例如，为了生产1118抗体，以一种能够表达含有如SEQ ID NO19所示氨基酸序列的完整重链的载体和一种能够表达含有如SEQ ID NO20所示氨基酸序列的完整轻链的载体共转染细胞。为了生产1121抗体，以一种能够表达含有如SEQID NO21所示氨基酸序列的完整重链的载体和一种能够表达含有如SEQ ID NO22所示氨基酸序列的完整轻链的载体共转染细胞。为了生产1118*抗体，以一种能够表达含有如SEQ ID NO32所示氨基酸序列的完整重链的载体和一种能够表达含有如SEQ ID NO20所示氨基酸序列的完整轻链的载体共转染细胞。为了生产1121*抗体，以一种能够表达含有如SEQ ID NO21所示氨基酸序列的完整重链的载体和一种能够表达含有如SEQ ID NO33所示氨基酸序列的完整轻链的载体共转染细胞。表3概括了各种IFN-γ抗体的完整重链和完整轻链。
表3
实施例5抗IFN-γ抗体的生产通过在表达它的CHO细胞的克隆系中表达来生产1119抗体。对于产物的生产，将来自单个小瓶的细胞融入无血清的细胞培养基中。细胞开始于一个250mL的摇瓶中生长，随后在一个旋转瓶中，最后在一个规模高至2000L的不锈钢生物反应器中进行生长。利用一种批量供料培养物在一个2000L的生物反应器中进行生产，所述培养物中加入一种含有浓缩的培养基成分的营养饲料以维持细胞生长和培养物生存能力。
将生产反应器控制于预定的pH、温度和溶解氧水平。通过二氧化碳气体和碳酸钠的添加来控制pH。通过空气、氮氮气和氧气流来控制溶解氧。
在生产的最后，将细胞肉汤加到一种disk stack离心机中，将培养物上清液与细胞分离。随后通过一种深度过滤器继而通过一种0.2μm的滤器进一步使浓缩物澄清。随后通过切线流动超滤将澄清的限制性培养基进行浓缩。将限制性培养基浓缩15-30倍。随后对得到的浓缩限制性培养基进行处理以纯化其含有的抗体，但它可以在较晚的时间进行冷冻纯化。任何本文所述的其它抗体都能够以相似的方式进行生产。
实施例6对抗IFN-γ抗体进行特征描述由于IFN-γ抗体具有很多生物学效应，可以利用几种不同的生物测试法比较各种IFN-γ抗体的潜能。利用下面介绍的A549分析法进行选择的侯选物的初步筛选以便基于它们在该分析中的性能作进一步的分析。选择的侯选物包括1119、1118和1121抗体。
A549生物测试法一种IFN-γ的确定的特性是其对于多种细胞种群抗增生性效应。见例如Aune和Pogue，1989，J.Clin.Invest.84863-75。人肺细胞系A549经常在介绍IFN-γ的生物活性的出版物中使用。见例如Aune and Pogue，同上；Hill等，1993，Immunology 79236-40。通常，对一种抑制剂的活性在一个落入剂量反应曲线的一部分中的刺激物的浓度上进行测试，在所述曲线上在剂量的的一个小变化就会导致反应的变化。本领域技术人员将会意识到如果使用过量的刺激物，可能需要很大剂量的抑制剂以观察反应的变化。通常使用的刺激物的浓度为EC80和EC90(在该浓度下分别获得80％或90％的最大反应)。
制作一种IFN-γ剂量曲线以确定肺上皮癌细胞系A549的EC90(约30pM)。在随后的实验中，将不同浓度的纯化抗体与固定剂量的IFN-γ(30pM)相混合，并且测定抗体抑制IFN-γ的抗增生效应的生物学活性的能力。实施该测试法5天，通过测定由ALAMARBLUE TM(AccuMedInternational，Inc.，Chicago，Illinois)的还原产生的荧光来测量增生，所述ALAMARBLUE TM是一种通过增殖细胞的代谢活性用于显示细胞生长的染料。见例如，de Fries和Mitsuhashi，1995，J.Clin.Lab.Analysis 9(2)89-95；Ahmed et al.，1994，J.Immunol.Methods 170(2)211-24。
如在图9中所示，1119是最有潜力的抗体，具有14pM的IC50(在该浓度获得50％的IFN-γ效应的抑制)，接下来是1121(46pM)和1118(97pM)。
HLA DR生物测试法另一种IFN-γ的确定的特性是其在多种细胞类型中上调I类和II类MHC的表达的能力。该活性可以特定地与狼疮性肾炎相关联(Yokoyama等，1992，Kidney Int.42755-63)。在介绍IFN-γ的这种生物活性的出版物中经常使用THP-1人单核细胞系。制作一种IFN-γ剂量曲线以确定该实验中所用的特定THP-1细胞系的EC80(约21pM)。在随后的实验中，将不同浓度的纯化抗体与固定剂量的IFN-γ(21pM)相混合，并且测定抗体中和或抑制IFN-γ诱导的在测定细胞表面的HLA DR的上调。实施该测试法24小时，测量的终点是如通过FACS分析测定的平均荧光强度，所述FACS是检测FITC标记的抗HLA DR抗体与细胞的结合的。
如图10中所示，1119是最有潜力的抗体，具有14pM的IC50(在该浓度获得50％的IFN-γ效应的抑制)，接下来是1121(60pM)和1118(86pM)。
全血生物测试法基于公开的观察，即IFN-γ在几种不同的细胞系中上调IP-10趋化因子的生产，发展了一种人全血测试法。这种活性是特别与狼疮性肾炎相关联的(Narumi等，2000，Cytokine 121561-1565)。对来自多个正常人供体的全血测试IFN-γ增强IP-10生产的能力。制作一种IFN-γ剂量曲线以确定个别供体的EC50(约21pM)。如所预期的，在供体之间观察到了一些变化。通常，使用看起来可重复性地显示50-100pM的EC50的供体。将全血与固定浓度的IFN-γ和不同浓度的抗体相混合，温育18.5小时并且随后通过ELISA测量IP-10的水平。来自两个不同供体的代表性结果显示于图11中。来自这些供体的EC50是17和14pM。迄今为止，用全血测试中自发升高的IP-10水平已经鉴定了一个供体而无需添加外源IFN-γ。抗IFN-γ抗体可能是通过阻抑内源生产的IFN-γ而能够阻抑这种IP-10的自发产生。
生化测试通过BIAcore分析测量几种IFN-γ抗体的结合动力学。起始的结果提示抗体具有接近在BIACORETM(Pharmacia Biosensor ABCorporation，Uppsala，瑞典)上进行可靠测量的界限的off-rates，所述BIACORETM是一种利用表面胞质团共振测量分子间结合的装置。因此，发展并使用一种平衡结合测试法。将固定量的抗体与各种浓度的IFN-γ一起温育超过5个小时从而达到平衡并且随后与IFN-γ结合珠接触极短时间，在一种KINEXATM机器中(Sapidyne Instruments Inc.，Boise，ID)测量结合到珠上的自由抗体的量，所述KINEXATM是一种基于荧光的免疫测试仪器。以1119抗体所获得的最低平衡解离常数为约24pM。
实施例7物种间反应性对以上所述的抗体测试它们中和或抑制来自几种不同物种的重组IFN-γ蛋白质的能力。商业购买小鼠IFN-γ蛋白质，而对人、cynomolgus猴和黑猩猩IFN-γ蛋白质进行克隆并在传统的哺乳类表达系统如人293细胞中进行表达。人、cynomolgus和黑猩猩IFN-γ蛋白质在前述A549测试中都是有活性的而小鼠蛋白质则在该测试中无活性。小鼠蛋白质在基于RAW264.7细胞系的测试中是有活性的，所述测试与前述A549测试是基本上相同的，除了小鼠细胞系的取代。RAW264.7是一种小鼠单核巨噬细胞系并且能够从，例如，美国典型培养物保藏中心获得。如表4中所示，所有三种抗体都能够中和人和黑猩猩IFN-γ，而三种没有一个能够中和或抑制来自cynomolgus或小鼠的IFN-γ的生物学活性。
表4
实施例8抗IFN-γ抗体的抗原表位的鉴定成熟人和cynomolgus IFN-γ的氨基酸序列的比较显示在它们中间于人IFN-γ序列中的位置19、20、31、34、65、77、103、110和126上有种个氨基酸差异。在Thakur和Landolfi(1999)，MolecularImmunology 361107-15中公开了人和黑猩猩IFN-γ序列，在Tatsumi和Sata(1997)，Int.Arch.Allergy Immunol.114(3)229-36中公开了食蟹猴IFN-γ序列；而在例如，生物技术信息国家中心(NCBI)登录号NP_032363中公开了小鼠的IFN-γ序列。利用商业上现有试剂盒的定点突变被用来在人IFN-γ内以来自食蟹猴蛋白质的相应氨基酸个别地取代每个分歧的人氨基酸。每个被取代的IFN-γ命名为“hu IFN-γ”，后面跟着用于替换存在于人IFN-γ序列中氨基酸的氨基酸的符号以及在成熟人IFN-γ序列中发生取代的位置。例如，“hu IFN-γD19”代表一种除了在位置19上与人IFN-γ相同的IFN-γ型，在位置19上一个天冬氨酸替换了正常出现在此位置上的组氨酸。以食蟹猴IFN-γ并且以存在于人IFN-γ中的氨基酸取代每个分歧的氨基酸而进行相似的实验。例如，“cyno IFNγL103”代表一种除了在位置103上与食蟹猴IFN-γ相同的IFN-γ型，在位置103上一个亮氨酸替换了正常出现在此位置上的丝氨酸。见表5和6。在传统的哺乳类表达系统如人293细胞中表达这些突变的蛋白质。所有的突变IFN-γ蛋白质都保留如在A549测试中测定的活性。对1119抗体测试其中和或抑制各种突变的IFN-γ蛋白质的如利用A549测试所测定的生物学活性。通过如上所述的测量荧光来测定1119抗体中和或抑制人IFN-γ抗增殖活性的能力，并且这被用作比较1119抗体中和每种IFN-γ突变形式活性的能力的基线。对于起始以人IFN-γ的构建体，将IFN-γ活性测量为一种百分率，其中在人IFN-γ和1119抗体存在时荧光的最大水平(归因于ALAMARBLUETM为增殖的细胞所还原)设置为100％，将在每种IFN-γ的变化形式加1119抗体存在时测量的最大水平与这相比较。或者，对于起始以食蟹猴IFN-γ的构建体，在观察到的荧光的基础上定性地给抑制打分。
如表5中所概括的，1119抗体能够中和或抑制人IFN-γ和所有人IFN-γ的取代突变体的生物学活性，除了hu IFN-γD19和hu IFN-γP20。如在前面的实施例中，食蟹猴IFN-γ蛋白质也不为1119抗体所抑制。这一分析显示残基19和20对于1119抗体与IFN-γ之间的相互作用是特别重要的并且可以作为1119抗体与人IFN-γ之间的接触点起作用。
表5
表6显示一种食蟹猴IFN-γ的变化型未被1119抗体所中和，其中所述变化型包含使得食蟹猴IFN-γ序列与人序列相区配的在位置19和20上的取代。但是，具有在位置19、20和65，或19、20和103上的人序列取代的食蟹猴IFN-γ型被1119抗体所中和，如含有这两种以外的取代的突变型一样。
表6
实施例9对黑猩猩给药后抗IFN-γ抗体的生物学活性将1119抗体对两种黑猩猩以每星期20mg/kg的剂量进行给药持续三周。在抗体给药两周(-2)或一周(-1)由黑猩猩体内取血，在第一剂抗体给药之后2、8、15、29和36天进一步取血。利用与实施例6中所述的人全血测试所用的基本上相同的方法对所取血液进行黑猩猩全血测试，主要区别是没有将抗体外源性加入全血中而是事先体内给药给黑猩猩。将IFN-γ以各种浓度加到血液中(0.01ng/ml，3.9ng/ml，或1ug/ml)，在37℃温育血液24小时，随后通过基于珠的ELISA测量IP-10的生产。
如图14和15中所看到的，在抗体给药之前取自动物中的血液与IFN-γ反应，伴随着IP-10生产的浓度依赖性的增长。相反地，在抗体给药之后取自动物中的血液不与任何测试IFN-γ反应，伴随着IP-10生产的增长。这些数据显示抗体保留着中和IFN-γ的能力，即使是在体内给药之后。另外，加至这些培养物中的IFN-γ的量大大超出了黑猩猩体内的IFN-γ内源性水平，提示给药的抗体能够在体内中和内源性IFN-γ。
应当理解前述的内容强调了本发明的某些具体的实施例并且所有的改进或其等同的替代物都在如所附权利要求书所示的本发明的精神和范围之内。将本文引用的所有参考文献的全部内容都并入作为参考。
序列表<110>Amgen，Inc.
Welcher，AndrewChute，HilaryLi，LukeHuang，Haichun<120>作为选择性IFN-γ途径抑制剂的人抗IFN-γ中和性抗体<130>01-1635-B<150>US 60/419,057<151>2002-10-16<150>US 60/479,241<151>2003-06-17<160>57<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>990<212>DNA<213>人<400>1gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
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1.一种包含重链CDR3的分离的抗体，所述重链CDR3具有以下氨基酸序列(a)一种包含SEQ ID NO36的至少7个氨基酸的氨基酸序列，所述至少7个氨基酸以与它们出现在SEQ ID NO36中的相同顺序和间隔而出现；或(b)一种含有SEQ ID NO37的氨基酸序列；其中该抗体能够特异性结合IFN-γ。
2.权利要求1的抗体，所述抗体还包含轻链CDR，所述轻链CDR3具有以下氨基酸序列(a)一种包含SEQ ID NO43的至少8个氨基酸的氨基酸序列，所述至少8个氨基酸以与它们在SEQ ID NO43中的相同顺序和间隔而出现；或(b)一种包含SEQ ID NO44的至少9个氨基酸的氨基酸序列，所述至少9个氨基酸以与它们在SEQ ID NO44中的相同顺序和间隔而出现。
3.一种包含轻链CDR3的分离的抗体，所述轻链CDR3具有以下氨基酸序列(a)一种包含SEQ ID NO43的至少8个氨基酸的氨基酸序列，所述至少8个氨基酸以与它们在SEQ ID NO43中的相同顺序和间隔而出现；或(b)一种包含SEQ ID NO44的至少9个氨基酸的氨基酸序列，所述至少9个氨基酸以与它们在SEQ ID NO44中的相同顺序和间隔而存在；其中该抗体能够特异性结合IFN-γ。
4.权利要求3的抗体，所述抗体还包含CDR，所述CDR具有SEQ IDNO34、SEQ ID NO35、SEQ ID NO36、SEQ ID NO37、SEQ ID NO38、SEQ ID NO39、SEQ ID NO40、SEQ ID NO41或SEQ ID NO42的氨基酸序列。
5.权利要求2的抗体，其中重链CDR3包含SEQ ID NO36的氨基酸并且轻链CDR3包含SEQ ID NO43的氨基酸。
6.权利要求1-5任一项的抗体，所述抗体包含与SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO14和/或SEQ ID NO30至少80％相同的第一氨基酸序列，其中第一氨基酸序列和SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO14或SEQ ID NO30之间的比对跨越至少50个氨基酸。
7.权利要求6的抗体，其中第一氨基酸序列与SEQ ID NO6、SEQID NO10、SEQ ID NO14和/或SEQ ID NO30至少90％相同。
8.权利要求7的抗体，其中第一氨基酸序列与SEQ ID NO6、SEQID NO10、SEQ ID NO14或SEQ ID NO30相同。
9.权利要求1-8任一项的抗体，所述抗体包含与SEQ ID NO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO16和/或SEQ ID NO31至少80％相同的第二氨基酸序列，其中第二氨基酸序列与SEQ ID NO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO16和/或SEQ ID NO31之间的比对跨越至少50个氨基酸。
10.权利要求9的抗体，其中第二氨基酸序列与SEQ ID NO8、SEQID NO12、SEQ ID NO16和/或SEQ ID NO31至少90％相同。
11.权利要求10的抗体，其中第二氨基酸序列与SEQ ID NO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO16或SEQ ID NO31相同。
12.权利要求1-5任一项的抗体，所述抗体包含与SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21和/或SEQ ID NO32至少80％相同的第一氨基酸序列，其中第一氨基酸序列和SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21和/或SEQ ID NO32之间的比对跨越至少50个氨基酸。
13.权利要求12的抗体，其中第一氨基酸序列与SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21和/或SEQ ID NO32至少90％相同。
14.权利要求13的抗体，其中第一氨基酸序列与SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21或SEQ ID NO32相同。
15.权利要求1-5和12-14任一项的抗体，所述抗体包含与SEQ IDNO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22和/或SEQ ID NO33至少80％相同的第二氨基酸序列，其中第二氨基酸序列和SEQ ID NO18、SEQ IDNO20、SEQ ID NO22和/或SEQ ID NO33之间的比对跨越至少50个氨基酸。
16.权利要求15的抗体，其中第二氨基酸序列与SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22和/或SEQ ID NO33至少90％相同。
17.权利要求16的抗体，其中第二氨基酸序列与SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22或SEQ ID NO33相同。
18.一种分离的抗体，所述抗体包含以下第一氨基酸序列(a)与SEQ ID NO6至少96％相同的氨基酸序列；(b)与SEQ ID NO10至少93％相同的氨基酸序列；(c)与SEQ ID NO14至少91％相同的氨基酸序列；或(d)与SEQ ID NO30至少98％相同的氨基酸序列；其中第一氨基酸序列与SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO14或SEQ ID NO30之间的比对跨越至少50个氨基酸，并且其中抗体能够特异性结合IFN-γ。
19.权利要求18的抗体，其中第一氨基酸序列至少与SEQ ID NO6至少96％相同，与SEQ ID NO10至少95％相同，与SEQ ID NO14至少95％相同，或与SEQ ID NO30至少98％相同。
20.权利要求19的抗体，其中第一氨基酸序列与SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO14或SEQ ID NO30相同。
21.权利要求18-20任一项的抗体，所述抗体还包含与SEQ IDNO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO16和/或SEQ ID NO31至少80％相同的第二氨基酸序列，其中第二氨基酸序列与SEQ ID NO8、SEQ IDNO12、SEQ ID NO16或SEQ ID NO31之间的比对跨越至少50个氨基酸。
22.权利要求21的抗体，其中第二氨基酸序列与SEQ ID NO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO16和/或SEQ ID NO31至少90％相同。
23.权利要求18-22任一项的抗体，其中第一氨基酸序列包含SEQID NO36和/或SEQ ID NO37中的至少5个氨基酸，所述至少5个氨基酸以与它们在SEQ ID NO36和/或SEQ ID NO37中的相同顺序和间隔而出现。
24.权利要求21或22的抗体，其中第二氨基酸序列包含SEQ IDNO43或SEQ ID NO44中的至少5个氨基酸，所述至少5个氨基酸以与它们在SEQ ID NO43或SEQ ID NO44中的相同顺序和间隔而出现。
25.一种分离的抗体，所述抗体包含以下第一氨基酸序列(a)与SEQ ID NO8至少97％相同的氨基酸序列；(b)与SEQ ID NO12至少96％相同的氨基酸序列；(c)与SEQ ID NO16至少97％相同的氨基酸序列；或(d)与SEQ ID NO31至少95％相同的氨基酸序列；其中第一氨基酸序列与SEQ ID NO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO16或SEQ ID NO31之间的比对跨越至少50个氨基酸，并且其中抗体能够特异性结合IFN-γ。
26.权利要求25的抗体，其中第一氨基酸序列与SEQ ID NO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO16或SEQ ID NO31至少97％相同。
27.权利要求26的抗体，其中第一氨基酸序列与SEQ ID NO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO16或SEQ ID NO31相同。
28.权利要求25的抗体，其中第一氨基酸序列包含SEQ ID NO43或SEQ ID NO44中的至少6个氨基酸，其中所述至少6个氨基酸以与它们在SEQ ID NO43或SEQ ID NO44中的相同顺序和间隔而出现。
29.权利要求25-28任一项的抗体，所述抗体还包含与SEQ IDNO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO14和/或SEQ ID NO30至少80％相同的第二氨基酸序列，其中第二氨基酸序列与SEQ ID NO6、SEQ IDNO10、SEQ ID NO14和/或SEQ ID NO30之间的比对跨越至少50个氨基酸。
30.权利要求29的抗体，其中第二氨基酸序列与SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO14和/或SEQ ID NO30至少90％相同。
31.权利要求29或30的抗体，其中第二氨基酸序列包含SEQ IDNO36和/或SEQ ID NO37中的至少5个氨基酸，所述至少5个氨基酸以与它们在SEQ ID NO36和/或SEQ ID NO37中的相同顺序和间隔而出现。
32.一种分离的完整人抗体，其中该抗体能够抑制人IFN-γ和黑猩猩IFN-γ的生物学活性并且其中该抗体不能抑制食蟹猴IFN-γ和鼠IFN-γ的生物学活性，并且其中该抗体包含含有VH区、CH1区、CH2区和CH3区的重链以及含有VL区和CL区的轻链。
33.权利要求32的抗体，其中以脯氨酸取代人IFN-γ的残基20对抗了抗体对人IFN-γ的生物学活性的抑制。
34.权利要求32或33的抗体，其中该抗体能够抑制一种食蟹猴IFN-γ的突变型的生物学活性，其中该突变型包含一个在位置19的组氨酸、一个在位置20的丝氨酸和一个在位置65的丝氨酸。
35.一种分离的抗体，其中该抗体能够抑制人IFN-γ的生物学活性，其中以脯氨酸取代人IFN-γ的残基20对抗了抗体对人IFN-γ的生物学活性的抑制，并且其中该抗体是完整人的。
36.一种包含轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的分离的抗体，其中重链CDR1具有SEQ ID NO34的氨基酸序列；重链CDR2具有SEQ ID NO35的氨基酸序列；重链CDR3具有SEQ ID NO36或SEQ ID NO37的氨基酸序列；轻链CDR1具有SEQ ID NO38、SEQ ID NO39或SEQ ID NO40的氨基酸序列；轻链CDR2具有SEQ ID NO41或SEQ ID NO42的氨基酸序列；轻链CDR3具有SEQ ID NO43或SEQ ID NO44的氨基酸序列；并且该抗体能够特异性结合IFN-γ。
37.权利要求36的抗体，其中重链CDR3具有SEQ ID NO36的氨基酸序列；轻链CDR1具有SEQ ID NO38的氨基酸序列；轻链CDR2具有SEQ ID NO41的氨基酸序列；并且轻链CDR3具有SEQ ID NO43的氨基酸序列。
38.权利要求36或37的抗体，所述抗体包含与SEQ ID NO17、SEQID NO19、SEQ ID NO21和/或SEQ ID NO32至少80％相同的第一氨基酸序列，其中第一氨基酸序列和SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ IDNO21和/或SEQ ID NO32之间的比对跨越至少50个氨基酸并且其中第一氨基酸序列包括重链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列，以及与SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22和/或SEQ IDNO33至少80％相同的第二氨基酸序列，其中第二氨基酸序列和SEQ IDNO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22和/或SEQ ID NO33之间的比对跨越至少50个氨基酸并且其中第二氨基酸序列包括轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列。
39.权利要求38的抗体，其中第一氨基酸序列与SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21和/或SEQ ID NO32至少90％相同，并且第二氨基酸序列与SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22和/或SEQ ID NO33至少90％相同。
40.权利要求39的抗体，其中第一氨基酸序列与SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21和/或SEQ ID NO32相同，并且第二氨基酸序列与SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22和/或SEQ IDNO33相同。
41.权利要求36或37的抗体，所述抗体包含与SEQ ID NO6、SEQID NO10、SEQ ID NO14和/或SEQ ID NO30至少80％相同的第一氨基酸序列，其中第一氨基酸序列和SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ IDNO14和/或SEQ ID NO30之间的比对跨越至少50个氨基酸，以及与SEQ ID NO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO16和/或SEQ IDNO31至少80％相同的第二氨基酸序列，其中第二氨基酸序列和SEQ IDNO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO16和/或SEQ ID NO31之间的比对跨越至少50个氨基酸。
42.权利要求41的抗体，其中第一氨基酸序列与SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO14和/或SEQ ID NO30至少90％相同，并且第二氨基酸序列与SEQ ID NO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO16和/或SEQ ID NO31至少90％相同。
43.权利要求42的抗体，其中第一氨基酸序列与SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO14或SEQ ID NO30相同，并且第二氨基酸序列与SEQ ID NO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO16或SEQ ID NO31相同。
44.一种分离的抗体，所述抗体包含(a)含有SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO14或SEQ ID NO30或一种这些序列的片段的氨基酸序列，和(b)含有SEQ ID NO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO16或SEQ ID NO31或一种这些序列的片段的氨基酸序列，其中该抗体能够特异性结合IFN-γ。
45.权利要求44的抗体，其中该抗体包含重链和轻链，其中重链含有VH区、CH1区、CH2区和CH3区并且其中轻链含有VL区和CL区。
46.权利要求44或45的抗体，其中该抗体包含(a)SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO14或SEQ ID NO30，和(b)SEQ ID NO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO16或SEQ ID NO31。
47.权利要求46的抗体，其中该抗体包含SEQ ID NO6和SEQ IDNO8。
48.权利要求1-31和36-47任一项的抗体，其中该抗体为单链抗体。
49.权利要求1-31和36-47任一项的抗体，其中该抗体为完全人抗体。
50.权利要求1-31和36-47任一项的抗体，其中该抗体为人源化抗体。
51.一种编码权利要求1-50任一项的抗体的分离的多核苷酸。
52.一种包含权利要求51的多核苷酸的载体。
53.一种包含权利要求52的载体的宿主细胞。
54.一种生产抗体的方法，包括培养权利要求53的宿主细胞。
55.一种方法，包括给患IFN-γ介导的疾病的个体给药治疗上有效量的权利要求1-50任一项的抗体。
56.一种组合物，其包含可药用的载体和治疗有效量的权利要求1-50任一项的抗体。
57.一种方法，包括给患IFN-γ介导的疾病的个体给药治疗上有效量的权利要求56的组合物。
58.权利要求55或57的方法，其中IFN-γ介导的疾病为AIDS、类风湿性关节炎，包括幼年型类风湿关节炎、炎症性肠道疾病，包括溃疡性结肠炎和局限性回肠炎、多发性硬化症、Addison病、糖尿病(I型)、附睾炎、肾小球肾炎、突眼性甲状腺肿、格-巴二氏综合征、桥本病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮肾炎、重症肌无力、天疱疮、银屑病、银屑病关节炎、动脉粥样硬化、促红细胞生成素抗性、移植物抗宿主病、移植排异、自身免疫肝炎诱导的肝损伤、胆汁性肝硬变、酒精诱导的肝损伤，包括酒精性肝硬变、风湿热、结节病、硬皮病、Sjogren综合征、脊椎关节病，包括强直性脊柱炎、甲状腺炎或脉管炎。
全文摘要
本发明提供了与人γ干扰素(IFN－γ)相互作用或与之相结合的抗体以及通过给药药学有效量的抗IFN－γ抗体来治疗IFN－γ介导的疾病的方法。还提供经利用抗IFN－γ抗体来检测样品中IFN－γ的量的方法。
文档编号C07K16/28GK1820026SQ200380101543
公开日2006年8月16日 申请日期2003年10月16日 优先权日2002年10月16日
发明者A·A·维尔切尔, H·T·楚特, Y·-S·李, H·黄 申请人:安姆根有限公司, 米德列斯公司