专利名称：抑制igf－i和－ii和gh－rh拮抗性相似物的制作方法
技术领域：
本发明的完成部分地获得来自老兵事务局医学研究部的政府资助。政府对本申请具有某些权利。
本发明是关于抑制哺乳动物垂体释放生长激素的新型合成肽，以及含有这种新型肽的治疗组合物。
背景技术：
生长激素(“GH”)是一种具有191个氨基酸的肽，它刺激产生多种不同的生长因子例如胰岛素样生长因子I(IGF-I)，并因此促进多种组织(骨骼、结缔组织、肌肉和内脏)生长，以及引起一些生理活性(促进核酸和蛋白质合成及脂解，但降低尿素分泌)。
GH的释放受下丘脑分泌的释放和抑制因子的控制。主要的释放因子是生长激素释放激素(“GH-RH”)，人生长激素-释放激素(“hGH-RH”)是一种具有44个氨基酸的肽。本发明的新型肽涉及仅具有残基1至29的hGH-RH(“hGH-RH(1-29)NH2”)的相似物，即具有如下氨基酸序列的肽相似物Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile5-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr10-Arg-Lys-Val-Leu-Gly15-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg20-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp25-Ile-Met-Ser-Arg29-NH2已发现GH与几种疾病有关。一种涉及GH的疾病是肢端巨大症，是由于存在过量水平的GH。通过给予GH-RH拮抗剂可治疗这种疾病中表面和肢端骨的异常增长。
另一类涉及GH的疾病是糖尿病性视网膜病和糖尿病性肾病。认为这类疾病中分别由GH引起的视网膜和肾的损伤可导致失明或肾功能障碍。通过给予有效的GH-RH拮抗剂可阻止或延缓这种损伤。
但是，GH-RH拮抗剂的主要应用是在癌症领域(A.V.Schally等，生长激素促分泌素的临床应用。Bercu，B.B和Walker，R.F编著，Dekker，New York，pp 145-162，1998)。对于各种癌症，IGF-I和-II是强有力的促细胞分裂剂。通过抑制GH分泌，GH-RH拮抗剂可降低IGF-I在肝和其它组织中的合成。GH-RH拮抗剂还降低各种肿瘤自体分泌和旁路分泌产生IGF-I和/或IGF-II。对于几种实验性癌症，用GH-RH拮抗剂治疗可导致IGF-I和-II减少，伴随着对肿瘤生长的抑制。
在治疗这类疾病和其它一些状态的努力中，某些研究者试图通过使用一种GH释放抑制剂，生长激素释放抑制因子来控制GH的水平。但是如果单独给予生长激素释放抑制因子，不能将GH或IGF-I抑制到所希望的程度。如果与GH-RH拮抗剂合并给药，生长激素释放抑制因子将更好地改善对IGF-I水平的抑制作用。
为了阐明GH-RH的结构与其活性的关系，科研工作者研究了GH-RH的各种修饰，致力于提供具有改进的激动剂或拮抗剂特性的人工合成同类物。因此早已确定，含有残基1-29的GH-RH片段，或GH-RH(1-29)是生物活性所必需的最小序列。此片段保留了天然GH-RH的50％或更多的效力。
第一个被描述的GH-RH拮抗剂[Ac-Tyr1，D-Arg2]hGH-RH(1-29)NH2，在文献中通常被称为“标准拮抗剂”，已发现它可阻止hGH-RH(1-29)NH2对大鼠垂体前叶腺苷酸环化酶的激活作用。这种肽在垂体和下丘脑中可阻断GH-RH对其受体的作用，并且抑制生长激素的脉动式分泌。
在已发表的文献中有相当数量的专利和论文公开了一些GH-RH相似物，它们或者具有GH-RH激动剂的作用(即刺激GH释放的作用)，或者具有GH-RH拮抗剂的作用(即抑制GH释放的作用)。这些肽的大多数都来源于GH-RH(1-29)肽序列，并具有增强它们激动剂或拮抗剂特性的特定结构修饰。
例如美国专利4,659,693公开了一些GH-RH拮抗剂相似物，它们在其GH-RH(1-29)序列的位置2含有某些N，N′-二烷基-ω-胍基α-氨酰基残基。
已公开的专利申请WO91/16923回顾了通过修饰其氨基酸序列来改变hGH-RH二级结构的早期尝试。这些早期尝试包括以它们的D-异构体取代Tyr1，Ala2，Asp3或Asn8；以L-或D-Ser，D-Arg，Asn，Thr，Gln或D-Lys取代Asn8；以Ala取代Ser9以便增强此区域的两亲性；以及以Ala或Aib取代Gly15。据说当此相似物中的R2是D-Arg，以及按上面的提示取代R8，R9和R15，可导致形成拮抗剂活性。据说这些拮抗性肽适合于作为药物组合物给药，用于治疗与GH过度水平有关的疾病状态如肢端巨大症。
美国专利5,084,555中hGH-RH相似物“[Ser9-ψ[CH2-NH]-Tyr10]hGH-RH(1-29)的拮抗剂活性据说是由于R9和R10残基之间伪肽键(即被还原成[CH2-NH]键的肽键)的结果。但是，据说[Ser9-ψ[CH2-NH]-Tyr10]hGH-RH(1-29)的拮抗剂特性不如标准拮抗剂[N-Ac-Tyr1，D-Arg2]GH-RH(1-29)-NH2。
被转让给与本专利申请相同受让人的美国专利5,550,212和美国专利申请08/642,472公开了几种hGH-RH(1-29)NH2的相似物，它们具有增强的拮抗剂特性和延长的作用期。据认为这些特性是由于在GH-RH(1-29)NH2的N-末端以芳香酸或非极性酸取代多个氨基酸并酰基化的结果。应注意的是，在上述美国专利和美国专利申请中，R9通常是Ser，R16是Gln或形成内酰胺桥的氨基酸(即Glu)，R28是Ser，Asn，Asp，Ala或Abu，以及R29是Agm，Arg-NH2，Arg-OH，Cit-NH2，Cit-OH，Har-NH2，Har-OH，或形成内酰胺桥的氨基酸(即Lys或Orn)。
发明概述在此提供了一系列hGH-RH(1-29)NH2的新型合成相似物。这些相似物可抑制内源性hGH-RH的活性，因此可阻止生长激素的释放。同以前所描述的相似物比较，此新型相似物较强的抑制能力是由于对多个氨基酸取代的结果。
具体地说，本发明是关于包含如下结构式的肽及其可药用的盐X-R1-R2-Asp-Ala-R5-R6-Thr-R8-R9-R10-Arg-R12-R13-R14-R15-R16-Leu-R18-R19-Arg-R21-R22-Leu-Gln-Asp-Ile-R27-R28-R29-NH2其中X是PhAc，IndAc，Ibu，Nac，1-或2-NPr，或者Fpr，R1是Tyr或His，R2是D-Arg或D-Cit，
R5是Ile或Val，R6是Phe，Nal或Phe(Y)，在此Y＝F，Cl，Br，R8是Asn，Gln，Ser，Thr，Ala，D-Asn，D-Gln，D-Ser，D-Thr，Abu，D-Abu，或Aib，R9是Arg，Har，Lys，Orn，D-Arg，D-Har，D-Lys，D-Orn，Cit，Nle，Tyr(Me)，Ser，Ala或Aib，R10是Tyr或Phe(Y)，在此Y＝H、F、Cl、Br，或OCH3，R12是Lys，D-Lys，或Orn，R13是Val或Nle，R14是Leu或Nle，R15是Gly，Ala，Abu，Nle或Gln，R16是Gln或Arg，R18是Ser或Nle，R19是Ala或Abu，R21是Lys或Orn，R22是Leu，Ala或Aib，R27是Met，Leu，Nle，Abu，或D-Arg，R28是Arg，D-Arg，Ser，Asn，Asp，Ala或Abu，R29是Arg，D-Arg，Har或D-Har。
此肽在优选的实施方案中，其中X是PhAc，IndAc或Nac，R1是Tyr或His，R2是D-Arg，R5是Ile，R6是Phe(pCl)，R8是Asn或Abu，R9是Arg或Har，Lys，Orn，D-Arg，D-Har，D-Lys，D-Orn，Cit，Nle或Tyr(Me)，R10是Tyr或Tyr(Me)，R12是Lys，R13是Val或Nle，R14是Leu或Nle，R15是Abu，Ala或Nle，R16是Gln或Arg，R18是Ser或Nle，R19是Ala或Abu，R21是Lys，R27是Nle或D-Arg，R28是D-Arg，Arg或Ser，R29是D-Arg，Har或D-Har。
要指出的是，天然GH-RH分子中的氨基酸残基30-44看来对活性不是必不可少的，它们的具体种类也不是关键的。因此，看来对本发明hGH-RH(1-29)-NH2相似物的C-末端加入另外这些氨基酸残基的某些或全部将不会影响这些相似物作为GH-RH拮抗剂的效力。如果要对此hGH-RH(1-29)-NH2相似物的C-末端加入这些氨基酸的某些或全部，则所加入的氨基酸残基可以是与天然hGH-RH序列中残基30-44相同的残基，或者是适当的相等物。合成方法可通过适当的方法获得合成肽，例如完全的固相技术，部分的固相技术，片段缩合法或经典的液相合成法。
当借助于固相法合成本发明的相似物，先以适当的方法将其C-末端残基(在此是R29)连接(锚定)于一种惰性支持物(树脂)，此残基同时支承着其α-氨基(在适当的情况下是其侧链功能基)的保护基。完成此步骤之后，从被锚定的氨基酸残基除去α-氨基保护基，并加入其α-氨基(以及任何适当的侧链功能基)已被适当保护的下一个氨基酸残基R28，然后照此继续。加入每个残基之后除去N-末端保护基，但是还不除去侧链保护基。在将全部所需的氨基酸，以合适的顺序连接之后，在对序列中的残基具有最小破坏作用的条件下使肽从支持物上断开下来，并除去所有的侧链保护基。随之对此合成产物小心地进行纯化并作仔细的鉴定，以便确保所获得的序列确实是所需要的结构。
在偶联步骤中以酸或碱敏感性保护基保护氨基酸的α-氨基功能是特别优选的。这类保护基具有在肽键形成的条件下是稳定的特点，同时易被除去而不破坏形成的肽链，不外消旋化其中包含的任何手性中心。适合的α-氨基保护基是Boc和Fmoc。医学应用可将这种hGH-RH拮抗剂肽或这种肽的盐配制成含有其有效量的药物制剂形式，用于为治疗或诊断的目的对人或动物给药。这种肽可被用于抑制GH水平，治疗与过量GH水平有关的疾病，例如糖尿病患者的视网膜病和肾病，以及肢端巨大症。还可以通过对需要这种治疗的个人给予本发明的组合物，提供治疗这类疾病的方法。但是，GH-RH拮抗剂的主要用途是在癌症领域，例如人类的乳腺癌，肺癌，结肠癌，脑癌，胰腺癌和前列腺癌，这些癌症都存在对于IGF-I或IGF-II的受体。
附图简述图I是在用某些GH-RH拮抗剂治疗的过程中，相对于治疗天数MXT小鼠乳腺癌体积改变的曲线图。
图II是在用某些GH-RH拮抗剂治疗过程中，相对于治疗天数在裸鼠MDA-MB-468人乳腺癌体积改变的曲线图。
图III是在用某些GH-RH拮抗剂治疗过程中，相对于治疗天数在裸鼠HT-29人结肠癌体积改变的曲线图。
图IV是在用一种GH-RH拮抗剂治疗过程中，相对于治疗天数在裸鼠U87MG人神经胶质瘤(glioblastomas)体积改变的曲线图。
图V是在用某些GH-RH拮抗剂治疗过程中，相对于治疗天数在裸鼠PC-3人前列腺癌体积改变的曲线图。
对优选实施方案的详述A.缩写用于定义这些肽的专门术语是由生物化学术语IUPAC-IUB委员会规定的术语，其中根据常规的表示法，在N-末端其氨基出现在左侧，在C-末端其羧基出现在右侧。在此使用的名词“天然氨基酸”意指如下一种在天然存在的蛋白质中发现的天然存在的L-氨基酸Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Lys、Arg、Asp、Asn、Glu、Gln、Cys、Met、Phe、Tyr、Pro、Trp和His。当天然的氨基酸残基具有异构体形式时，在此表示的是此氨基酸的L-构型，除非另有特定的指示。
非编码氨基酸，或氨基酸相似物也被掺入GH-RH拮抗剂中(非编码氨基酸是不在天然存在的肽中发现的大约20种天然氨基酸中的那些氨基酸)。如下氨基酸包括在可能用于hGH-RH拮抗性肽的非编码氨基酸或氨基酸相似物中以Abu表示α-氨基丁酸，以Aib表示α-氨基异丁酸，以Har表示高精氨酸，以Nal表示2-萘基-丙氨酸，以Nle表示正亮氨酸，以及以Orn表示鸟氨酸。当这些非编码氨基酸或氨基酸相似物具有异构体形式时，所表示的是此氨基酸的L-构型，除非另有特定的指示。
在此所采用的缩写有Abu α-氨基丁酸Ac 乙酰基AcOH乙酸Ac2O乙酸酐Aib α-氨基异丁酸Boc 叔丁氧羰基Bom 苄氧甲基2BrZ2-溴-苄氧羰基cHx 环己基Cit 瓜氨酸(2-氨基-5-脲基戊酸)2CIZ2-氯-苄氧羰基DCM 二氯甲烷DIC N，N′-二异丙基碳化二亚胺DIEA二异丙基乙胺DMF 二甲基甲酰胺Fmoc芴基甲氧羰基Fpr 3-苯丙酰基GH 生长激素GH-RH GH释放激素Har 高精氨酸HBTU2-(1H-苯并叠氮-1-基)-1，1，3，3-四甲基uronium六氟磷酸盐hGH-RH 人GH-RHHOBt1-羟基苯并三唑HPLC高效液相色谱Ibu 异丁酰基IndAc 吲哚-3-乙酰基MBHA对-甲基二苯甲基胺MeOH甲醇MeCN乙腈Nac 1-萘基乙酰基Nal 2-萘基丙氨酸NMM N-甲基吗啡Npr 萘基丙酰基PAM 苯乙酰氨甲基Phe(pCl)对-氯-苯丙氨酸PhAc苯乙酰基rGH-RH 大鼠GH-RHRP-HPLC 反相HPLCTFA 三氟乙酸Tos 对甲苯磺酰基Tyr(Me) 酪氨酸甲基醚Z 苄氧羰基B.GH-RH相似物本发明的hGH-RH相似物被设计成对受体具有增高的肽亲和性，具有改进的代谢稳定性，以及具有最大的双亲性分子二级结构。这些相似物中的许多在体外和体内对由hGH-RH(1-29)NH2刺激的GH释放可引起非常有效的和长时间持续的抑制作用。
因为具有显著的生物活性，如下实施方案是特别优选的[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)8，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽1[IndAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽2[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Har9，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽3[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Har9，Abu16，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽4[Nac0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽5[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽6[PhAc0，His1，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu16，Nle27，D-Arg28，Har29)hGH-RH(1-29)NH2肽7[Nac0，His1，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽8[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽9[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu15，Arg16，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29]NH2肽10[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽11[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Nle9，Abu15，Nle27，D-Arg28]hGH-RH(1-29)NH2肽12[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Nle13，Nle14，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽13[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Nle15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽14[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu15，Nle18，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽15[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽16[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu8，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽17[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，D-Abu8，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽18[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Tyr(Me)10，Abu15， D-Arg27，Arg28，D-Arg29]hGH-缺席RH(1-29)NH， 肽19[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Tyr(Me)9， Abu15，D-Arg27，Arg28，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽20[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu15，D-Arg27，Arg28，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽21[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu8，Tyr(Me)10，Abu15，D-Arg27，Arg28，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽22[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，D-Abu8，Tyr(Me)10，Abu15，D-Arg27，Arg28，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽23[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)8，Lys9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽24[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Orn9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽25[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，D-Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽26[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，D-Har9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽27[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，D-Lys9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽28[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，D-Orn9，Abu115，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽29[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)8，Cit9，Abu16，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽30六个非常优选的实施方案具有如下的结构式
PhAo0-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr10-Arg11-Lys12-Val11-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2肽1IndAc0-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln10-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2肽2PhAc0-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Har9-Tyr(Me)10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2肽3PhAc0-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr(Me)10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2肽6PhAc0-His1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2肽7Nac0-His1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2肽8按照已确定的惯例，这些肽可简写成如下形式[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽1[IndAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽2[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Har9，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽3[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽6[PhAc0，His1，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽7[Nac0，His1，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽8C.制备方法1.合成法概述可借助于适当的方法合成这种肽，例如完全的固相技术，部分的固相技术，片段缩合法或经典的液相合成法。例如在教科书“肽固相合成法”，J.M.Stewart和J.D.Young，Pierce化学公司，Rockford，111，1984(第二版)，以及M.Bodanszky，“肽合成原理”，Springer Verlag，1984中阐述了完全的固相合成技术。优选地可应用固相合成法制备这种hGH-RH拮抗性肽，例如由Merrifield，美国化学学会杂志85 p.2149(1963)所概述的方法，虽然如前面所述还可以应用本领域已知的其它等效的化学合成法。
以在其α-氨基被保护的氨基酸进行这种合成。尿烷型保护基(Boc或Fmoc)优选地被用于保护α-氨基。优选的保护基是Boc。
按照固相合成法，是借助于化学键将在C-末端形成最终肽氨酰基的N-α-保护氨基酸部分附着在多聚树脂支持物上。在偶联反应完成之后，选择性地除去此α-氨基保护基，以便能在氨基末端进行后续的偶联反应，当N-α-保护基是Boc时优选地可用在DCM中配制的50％TFA。逐步将具有相同Boc-保护α-氨基的其余氨基酸偶联于树脂上前面氨基酸的自由氨基，以便获得所需的肽序列。因为氨基酸残基是偶联于C-末端残基的α-氨基，所以合成hGH-RH相似肽的延长是在C-末端开始并向N-末端延伸。当获得了所需的序列，在N-末端将此肽酰化，并从多聚支持物上分离下来。
过量地使用每种被保护的氨基酸(2.5或3当量)，并通常在DCM，DMF或它们的混合物中进行偶联反应。借助于茚三酮反应在每个阶段监测偶联反应完成的程度。在被确定为不完全偶联的情况下重复此偶联步骤，或者在除去α-氨基保护基，然后偶联下一个氨基酸之前，通过乙酰化未反应的氨基进行封端。
表1中显示了一个典型的合成周期。
表1用于应用Boc-法的典型合成周期方案步骤试剂混合时间(分钟)1.保护 DCM配制的50％TFA5＋25DCM洗涤液 12-丙醇洗涤液12.中和 DCM配制的5％DIEA1DCM洗涤液 1MeOH洗涤液 1DCM配制的5％DIEA3MeOH洗涤液 1DCM洗涤液(3次) 1-13.偶联 DCM配制的3当量Boc-氨基酸或者DMF＋3当量DIC或预先形成的Boc氨基酸的HOBt酯60MeOH洗涤液 2DCM洗涤液 24.乙酰化DCM配制的Ac2O(30％)10＋20(如果适当时)MeOH洗涤液(3次) 2DCM洗涤液(3次) 2合成完成之后，应用熟知的肽化学方法可使肽从树脂上断开。
此肽的某些氨基酸残基具有与用于偶联或去保护的试剂易反应的侧链功能基。当存在这种侧链功能基时，为了防止在用于形成肽的反应过程中发生不希望有的化学反应，可使适合的保护基与这些功能基接合。在选择特定的侧链保护基时应遵守如下一般性规则(a)在偶联反应条件下此保护基可优选地保持其保护特性，并不会被断开，(b)在每一合成步骤除去α-氨基保护基的条件下这种保护基应该是稳定的，(c)当所需氨基酸序列的合成完成时，在不使肽链发生不良改变的反应条件下这种侧链保护基必须可被除去。
优选地可按如下保护反应性侧链功能基苄基用于保护Thr和Ser，2-溴-苄氧羰基用于保护Tyr，对-甲苯磺酰基或硝基用于保护Arg和Har，2-氯苄氧羰基或芴基甲氧羰基用于保护Lys和Orn，苄氧甲基用于保护His，以及环己基或芴基甲基用于保护Asp和Glu。Asn和Gln侧链不需保护。
3.使氨基酸残基逐步偶联于多聚体支持物可以在多种多聚体支持物即MBHA，Merrifield，PAM或Wang树脂上合成这种hGH-RH拮抗性肽。当N-α-Boc保护的氨基酸被用于合成时，优选的树脂是MBHA。在此情况下，当从此支持相断开时可获得具有酰胺化C-末端的肽。
首先将此C-末端氨基酸附着于被中和的MBHA树脂，然后进行随后的氨基酸偶联。以相对于树脂-结合的自由氨基残基大约3倍克分子量的过剩量偶联每种被保护的氨基酸，可在介质如DMFCH2Cl2(1∶1)中，或者单独在DMF或CH2Cl2中进行偶联反应。选择适合的偶联剂是本领域技术人员熟知的。特别适合作为偶联剂的是N，N′-二异丙基碳化二亚胺(DIC)，或者是与HOBt组合的HBTU。在合成的每个阶段，优选地可借助于茚三酮反应监测偶联反应的结果。在发生不完全偶联的情况下，重复此偶联步骤，或者用Ac2O/DCM乙酰化树脂-结合的未反应的氨基残基，然后除去α-氨基保护基。
以同前面偶联步骤相同的方式对肽的N-末端作最后的酰基化，不同之处是用适当的羧酸而不是氨基酸。
4.使肽与多聚体支持物分离合成完成之后使肽与支持相分离。通过用试剂如液体氟化氢处理可使肽与树脂分离，同时还断开其余所有的侧链保护基。
适合的方法是，用间甲酚和无水氟化氢组成的混合物处理干燥的和被保护的肽-树脂，每克肽-树脂用1.0ml间甲酚和10ml无水氟化氢在0℃处理60分钟，使肽与树脂断开并且分离所有的侧链保护基。在氮气流和真空条件下除去氟化氢之后，用乙醚沉淀游离的肽，过滤，用乙醚和乙酸乙酯洗，用50％乙酸提取并冷冻干燥。
5.纯化可应用肽化学领域熟知的程序纯化此粗制肽。例如，可在MacRabbit HPLC系统(Rainin仪器公司，Woburn.MA)上进行纯化，此系统带有Knauer UV光度检测器和Kipp及Zonen BD40记录仪，使用Vydac 218TP5010反相柱(10×250mm，装填300孔径，5μm颗粒尺寸的C18硅胶)(Separations集团公司，Hesperia，CA)。用由(A)0.1％TFA水溶液和(B)在70％MeCN水溶液中配制的0.1％TFA组成的溶剂系统，按线性梯度方式(例如在120分钟内30-55％B)对柱进行洗脱。在220nm监测洗出液，借助于应用Hewlett-Packard型HP-1090液相层析的分析HPLC对组分进行检测，并合并获得最高的纯度。以由上述的(A)和(B)组成的溶剂系统，应用等度洗脱在Vydac 218TP52反相柱(2×250mm，C18，300，5μm)上实施分析HPLC。在220和280nm监测洗脱峰。通过分析HPLC可断定此肽基本上是纯的(＞95％)。还可通过氨基酸分析证实预期的氨基酸组成。D.药物组合物可将本发明的肽以可药用的无毒性盐的形式给药，例如以酸式加成盐的形式。作为这种酸式加成盐的例证有如下多种盐氢氯化物、氢溴化物、硫酸盐、磷酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、单宁酸盐、马来酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、藻酸盐、双羟萘酸盐、苹果酸盐、抗坏血酸盐和酒石酸盐等。特别优选的拮抗剂是低溶解度的盐，例如Pamoate盐等。这些盐表现出较长的活性持续时间。
本发明的化合物适合对受试的人或动物给药，通过皮下注射，肌肉注射或静脉注射；鼻内给药或通过肺吸入，或者由可生物降解的适合多聚体(如D，L-丙交酯-共乙交酯)制成的储囊形式(例如微胶囊，微粒或圆柱棒样植入物)，前二种储囊方式是优选的。其它等效的给药方式也属于本发明的范畴，即连续滴注，depot注射，输注泵给药和延迟释放的方式如微胶囊等。可在任何一种生物学允许的注射载体中给药，生理盐水是可接受的，虽然还可以使用本领域已知的其它载体。
这种肽优选地是通过注射给药，随同药剂学允许的载体如等渗盐水作肌内注射，皮下注射或静脉内注射。另外，这种肽还可用适当的载体作为鼻内喷雾剂给药或通过肺内吸入给药。一种适合的给药途径是储囊形式(depot form)，是由生物可降解的适合多聚体如聚D，L-丙交酯-共乙交酯制备成含有分散的拮抗性化合物的微胶囊，微粒或圆柱形植入物。
所需肽的剂量取决于给药方式和预期的结果。一般来说其剂量范围是每天每公斤体重1-100μg。E.GH-RH拮抗剂的治疗用途hGH-RH拮抗剂可用于治疗由过量的生长激素引起的疾病，例如肢端巨大症，表现为表面和肢端骨的异常增长。此GH-RH拮抗剂还可以用于治疗糖尿病患者的肾病(是糖尿病患者失明的主要原因)和糖尿病患者的视网膜病，认为其中是由于GH分别引起了眼和肾的损伤。
这种hGH-RH拮抗剂被设计成能阻断GH-RH的结合，因此阻断GH-RH的作用，GH-RH刺激GH的分泌，GH又刺激产生IGF-I。GH-RH拮抗剂可被单独给药，或者与生长激素释放抑制因子相似物一同给药，后者是一种可更有效地抑制IGF-I水平的组合形式。给予GH-RH拮抗剂而不是生长激素释放抑制因子是有利的，因为GH-RH拮抗剂可能被用在其靶标位点没有生长激素释放抑制因子受体的部位。
但是，GH-RH拮抗剂的主要应用是在癌症范围内。这是基于如下的考虑GH-RH拮抗剂是被设计成能阻断GH-RH的结合，因此阻断GH-RH的作用，GH-RH刺激GH的分泌，GH又刺激产生胰岛素样生长因子I(IGF-I)，也被称为促生长因子-C。已充分地证实IGF-I(促生长因子-C)与乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、骨肿瘤和其它一些恶性肿瘤有关，并且生长激素释放抑制因子相似物单独不能充分地抑制GH和IGF-I的水平。为了更好地抑制肿瘤生长需要完全抑制IGF-I的水平或分泌。多种肿瘤自体分泌产生IGF-I也可能是在GH-RH的控制之下，因此可被GH-RH拮抗剂抑制。GH-RH拮抗剂还可抑制IGF-I的产生。GH-RH在肿瘤学(癌症)领域内应用的更精确的理论基础是在人原发性乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、脑癌、胰腺癌以及在肾细胞癌症中都存在对IGF-I的受体。
这些肿瘤中IGF-I受体的存在看来与这些癌症的恶性转移的增殖有关。对于多种人类癌症，IGF-I可起内分泌、旁路分泌或自体分泌生长因子的作用，也就是说，这些肿瘤的生长取决于IGF-I。GH-RH拮抗剂通过抑制GH分泌而减少IGF-I的产生。因为IGF-l刺激多种肿瘤(癌)的生长，所以降低血液循环中IGF-I的水平将导致肿瘤生长的抑制。GH-RH拮抗剂还可能降低肿瘤旁路分泌或自体分泌产生IGF-I，这也应该导致癌肿增殖的抑制。这些观点符合临床肿瘤学和现代概念。GH-RH拮抗剂可单独给药或与生长激素释放抑制因子相似物一同给药，这种组合将导致对IGF-I水平更完全的抑制，更完全地降低组织中的IGF-I水平，例如排除人骨肉瘤中的，以及乳癌、结肠癌、前列腺癌和非-小细胞肺癌(非-SCLC)中的IGF-I。
GH-RH拮抗剂优于生长激素释放抑制因子相似物是基于如下事实GH-RH拮抗剂可用于抑制没有生长激素释放抑制因子受体的肿瘤，例如人骨原性肉瘤。
已表明GH-RH的拮抗性相似物在体内可抑制多种肿瘤的生长。部分地是通过抑制GHRH-GH-IGF-I轴心来行使这种作用。尽管如此，IGF-II对增殖的自体分泌/旁路分泌控制在许多肿瘤也是主要的因素。干扰这种自体分泌性生长-刺激途径提供了一种控制肿瘤的方法。如通过比色测定和[3H]-胸苷掺入试验所显示的，在体外GH-RH的拮抗性相似物MZ-4-71{[Ibu0，Tyr1，D-Arg2，Abu15，Nle27]hGH-RH(1-28)Agm}和MZ-5-156{[PhAc0，D-Arg2，Abu15，Nle27]hGH-RH(1-28)Agm}显著地抑制了乳腺癌(MDA-MB-468，ZR-75-1)、前列腺癌(PC-3和DU-145)和胰腺癌(MiaPaCa-2，SW-1990和Capan-2)细胞系增殖的速度，降低了这些细胞中IGF-II mRNA的表达和lGF-II分泌进入培养基的浓度。同样这二种GH-RH拮抗剂在体内对前列腺肿瘤(PC-3，DU-145)，肾脏腺癌(Caki-1)和非-小细胞肺癌(H157)也产生了类似的结果(抑制增殖和减少IGF-II产生)。这些发现提示，GH-RH和拮抗性相似物不但可以通过抑制GHRH-GH-IGF-I轴心，而且可以通过减少某些肿瘤细胞中IGF-II的产生从而中断它的自体分泌调节途径来抑制肿瘤生长。
将结合下面的实施例对本发明进行论述，提出这些实施例仅仅是为了说明的目的。在这些实施例中，所使用的都是被保护的L-构型旋光活性氨基酸，除非另有特别注明。
下面的实施例提供了通过固相技术合成这种新型GH-RH拮抗剂的适当方法。
实施例IPhAc0-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Arg9-Tyr10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2(肽1){[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2}应用手工操纵的固相肽合成装置，以逐步进行的方式实施此肽的合成。简单地说，按照表1中所述的方案以CH2Cl2配制的5％DIEA中和对-甲基二苯甲基胺(MBHA)树脂(Bachem，California)(720mg，0.50mmole)并洗涤。在手工操纵的固相肽合成仪中，将DMF-CH2Cl2(1∶1)配制的Boc-Har(NO2)-OH(500mg，1.5mmole)溶液与中和的树脂和DIC(235μl，1.5mmole)一起震摇1小时。通过阴性茚三酮试验证明偶联反应完成之后，以CH2Cl2配制的50％TFA去保护基，并用CH2Cl2配制的5％DIEA中和，通过在树脂上按所指明的顺序偶联下面的被保护氨基酸以便获得所需的肽序列，逐步构成了此肽链Boc-D-Arg(Tos)-OH，Boc-Nle-OH，Boc-Ile-OH，Boc-Asp(OcHx)-OH，Boc-Gln-OH，Boc-Leu-OH，Boc-Leu-OH，Boc-Lys(2CIZ)-OH，Boc-Arg(Tos)-OH，Boc-Ala-OH，Boc-Ser(Bzl)-OH，Boc-Leu-OH，Boc-Gln-OH，Boc-Abu-OH，Boc-Leu-OH，Boc-Val-OH，Boc-Lys(2CIZ)-OH，Boc-Arg(Tos)-OH，Boc-Tyr(2Brz)-OH，Boc-Arg(Tos)-OH，Boc-Asn-OH，Boc-Thr(Bzl)-OH，Boc-Phe(pCl)-OH，Boc-Ile-OH，Boc-Ala-OH，Boc-Asp(OcHx)-OH，Boc-D-Arg(Tos)-OH，Boc-Tyr(2BrZ)-OH 。
上面按照普遍接受的惯例提供了这些被保护的氨基酸残基(通常也可从Bachem公司购得)。对于特定氨基酸的侧链功能基的适当保护基显示在圆括弧中。上面结构式中的OH基表明每个残基的羧基末端是自由的。
除了以它们预先形成的HOBt酯偶联的Boc-Asn-OH和Boc-Gln-OH之外，其余被保护的氨基酸(各1.5mmole)都是以DIC(235μl，1.5mmole)偶联。在从Tyr1除去N″-Boc保护基之后，用DIC(313μl，2mmole)，以苯乙酸(PhAc)(272mg，2mmole)酰化此肽。
为了使此肽从树脂上断开并使它去保护基，在0℃将干燥的肽树脂(2.18g)与2ml间-甲酚和20ml氟化氢(HF)一起搅拌1小时。在真空下蒸发HF之后，用无水二乙醚和乙酸乙酯洗此残留物。将被断开和去保护的肽溶解于50％乙酸中，借助于过滤使其与树脂分离。用水稀释并冷冻干燥后得到1.51g粗制产品。
通过分析性HPLC审核此粗制肽应用Hewlett Packed HP-1090液相色谱仪，以Vydac 218TP52反相柱(2×250mm，装填C18硅胶，硅胶孔径300，颗粒大小5μm)(The Separations集团公司，Hesperia，CA)进行层析，并用由(A)0.1％TFA水溶液和(B)在70％MeCN水溶液中配制的0.1％TFA组成的溶剂系统作线性梯度洗脱(例如40-70％B)。将500mg粗制肽溶解于AcOH/H2O中，搅拌、过滤后施加于Beckman Vltraprep ODS柱(21.1×150mm，装填C18硅胶，此硅胶孔径300，颗粒大小10μm)上。用上述的溶剂系统以线性梯度方式(例如30-55％B，120分钟)洗脱此柱，流速6ml/分钟。在220nm监测洗出液，通过分析性HPLC对组分进行检测。合并纯度高于95％的组分，冷冻干燥获得98mg结晶。此分析性HPLC是在上述的Vydac C18反相柱上进行，用上述的溶剂系统作等度洗脱，流速0.2ml/分钟。在220和280nm监测洗脱峰。通过分析性HPLC断定此产品基本上是纯的(＞95％)。借助于电喷射质谱法检查分子量，并通过氨基酸分析证实预期的氨基酸组成。
实施例IIPhAc0-Tyr1-D-Arg2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe(pCl)6-Thr7-Asn8-Har9-Tyr(Me)10-Arg11-Lys12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Lys21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-D-Arg28-Har29-NH2(肽3){[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Har9，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2}应用手工操纵的固相肽合成装置，以逐步进行的方式实施此肽的合成。简单地说，按照表1中所述的方案以CH2Cl2配制的5％DIEA中和对-甲基二苯甲基胺(MBHA)树脂(Bachem，California)(100mg，0.070mmole)并洗涤。在手工操纵的固相肽合成装置中，将DMF-CH2Cl2(1∶1)配制的Boc-Har(NO2)-OH(83mg，0.25mmole)溶液与中和的树脂和DIC(44μl，0.275mmole)一起震摇1小时。通过阴性茚三酮试验证明偶联反应完成之后，以CH2Cl2配制的50％TFA去保护基，并用CH2Cl2配制的5％DIEA中和，通过在树脂上按所指明的顺序偶联下面的被保护氨基酸以便获得所需的肽序列，逐步构成了此肽链Boc-D-Arg(Tos)-OH，Boc-Nle-OH，Boc-Ile-OH，Boc-Asp(OcHx)-OH，Boc-Gln-OH，Boc-Leu-OH，Boc-Leu-OH，Boc-Lys(2CIZ)-OH，Boc-Arg(Tos)-OH，Boc-Ala-OH，Boc-Ser(Bzl)-OH，Boc-Leu-OH，Boc-Gln-OH，Boc-Abu-OH，Boc-Leu-OH，Boc-Val-OH，Boc-Lys(2CIZ)-OH，Boc-Arg(Tos)-OH，Boc-Tyr(Me)-OH，Boc-Har(NO2)-OH，Boc-Asn-OH，Boc-Thr(Bzl)-OH，Boc-Phe(pCl)-OH，Boc-Ile-OH，Boc-Ala-OH，Boc-Asp(OcHx)-OH，Boc-D-Arg(Tos)-OH，Boc-Tyr(2BrZ)-OH。
上面按照普遍接受的惯例提供这些被保护的氨基酸残基(通常也可从Bachem公司购得)。对于特定氨基酸的侧链功能基的适当保护基显示在圆括弧中。上面结构式中的OH基表明每个残基的羧基末端是自由的。
除了以它们预先形成的HOBt酯偶联的Boc-Asn-OH和Boc-Gln-OH之外，其余被保护的氨基酸(各0.25mmolr)都是以DIC(44μl，0.275mmole)偶联。在从Tyr1除去N″-Boc保护基之后，使用DIC(70μl，0.44mmole)以苯乙酸(PhAc)(54mg，0.4mmole)酰化此肽。
为了使此肽从树脂上断开并使它去保护基，在0℃将干燥的肽树脂(206mg)与0.5ml间-甲酚和5ml氟化氢(HF)一起搅拌1小时。在真空下蒸发HF之后，用无水二乙醚和乙酸乙酯洗此残留物。将此被断开和去保护的肽溶解于50％乙酸中，借助于过滤使其与树脂分离。用水稀释并冷冻干燥后得到112mg粗制产品。
通过分析性HPLC审核此粗制肽应用Hewlett Packed HP-1090液相层析仪，以Vydac 218TP52反相柱(2×250mm，装填孔径300，颗粒大小5μm的C18硅胶)(The Separations集团公司，Hesperia，CA)进行层析，并用由(A)0.1％TFA水溶液和(B)在70％MeCN水溶液中配制的0.1％TFA组成的溶剂系统作线性梯度洗脱(例如40-70％B)。将80mg粗制肽溶解于AcOH/H2O中，搅拌、过滤后施加于以C8硅胶装填的Vydac 218TP5010柱(10×250mm)上。用上述的溶剂系统以线性梯度方式(例如30-55％B，120分钟)洗脱此柱，流速2ml/分钟。在220nm监测洗出液，并通过分析性HPLC对组分进行检测。合并纯度高于95％的组分，冷冻干燥获得9.6mg结晶。此分析性HPLC是在上述Vydac C18反相柱上进行，用上述的溶剂系统以0.2ml/分钟的流速作等度洗脱。在220和280nm监测洗脱峰。通过分析性HPLC断定此产品基本上是纯的(＞95％)。借助于电喷射质谱法检查分子量并通过氨基酸分析证实预期的氨基酸组成。
以同肽1和肽3相同的方式合成肽2和肽4至肽30，不同的是这些肽还含有其它取代基，将产生下列肽[IndAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽2[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Har9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽4[Nac0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽5[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽6[PhAc0，His1，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽7[Nac0，His1，D-Arg2，Phe(pCl)8，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽8[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽9[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu15，Arg16，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽10[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽11[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)8，Nle9，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽12[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)0，Nie13，Nle14，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽13[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Nle15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽14[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu15，Nle18，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽15[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽16[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu8，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽17[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，D-Abu8，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽18[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Tyr(Me)10，Abu15，D-Arg27，Arg28，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽19[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)8，Tyr(Me)9，Abu15，D-Arg27，Arg28，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽20[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)8，Abu15，D-Arg27，Arg28，D-Arg29]hGH-RH(1-29)NH2肽21[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Abu8，Tyr(Me)10，Abu15，D-Arg27，Arg28，D-Arg29[hGH-RH(1-29)NH2肽22[PhAc0，D.Arg2，Phe(pCl)6，D-Abu8，Tyr(Me)10，Abu15，D-Arg27，Arg28，D-Arg29[hGH-RH(1-29)NH2肽23[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Lys9，Abu16，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽24[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Orn9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽25[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，D-Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2， 肽26[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，D-Har9，Abu16，Nle27，D-Arg28，Har29[hGH-RH(1-29)NH2肽27[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)8，D-Lys9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-
29)NH2肽28[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，D-Orn9，Abu16，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH[1-29)NH2肽29[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)8，Cit9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽30实施例III生物活性以体外和体内测定法测定了本发明的肽，测定它们抑制hGH-RH(1-29)NH2诱发的GH释放的能力。过冷大鼠垂体系统按照以前描述的一种测定法(S.Vigh和A.V.Schally，肽5241-347，1984)的修改形式(Z.Rekasi和A.V.Schally，P.N.A.S.902146-2148，1993)对这些肽相似物进行了体外测定。
简单地说，细胞与多种浓度的肽(3ml)预温育9分钟。温育后立即加入1nM hGH-RH(1-29)NH2(1ml)作用3分钟
。为了检测此相似物拮抗性作用的持续时间，在30、60、90和120分钟后加入1nM hGH-RH(1-29)NH2，作用3分钟[30、60、90、120分钟的应答]。估算GH应答的净整数值。将GH应答与1nM hGH-RH(1-29)NH2诱发的最初GH应答相比较，并以最初应答的百分数表示。将新拮抗剂的作用与“标准拮抗剂”[Ac-Tyr1，D-Arg2]hGH-RH(1-29)NH2的作用相比较。生长激素放射免疫测定法采用由National Hormone and Pituitary Program，Baltimore，Maryland供给的材料，通过双抗体放射免疫测定法测定了等分量未稀释的和稀释的过冷样品(Superfusion Samples)中大鼠GH的含量。用我们研究所建立的计算机程序分析此RIA结果(V.Csernus和A.V.Schally，神经分泌研究方法，Harwood(Greenstein，B.D.编著，London，pp 71-109，1991。特此引入作为参考)。每次检测间的差异小于15％，一次检测内的差异小于10％。GH-RH结合测定法为了测定GH-RH拮抗剂的结合特征建立了灵敏的放射受体结合测定法(G.Halmos，A.V.Schall等，受体3，87-97(1993))，特此引入作为参考。此测定法是基于标记的[His1，Nle27] hGH-RH(1-32)NH2与大鼠垂体前叶膜匀浆的结合。通过氯胺-T法(F.C.Greenwood等，生物化学89114-123，1963，特此引入作为参考)制备[His1，Nle27]hGH-RH(1-32)NH2的碘化衍生物。用来自雄性Sprague-Dawley大鼠(250-300g)的垂体制备粗制膜。为了进行饱和结合分析，在存在和不存在过量未标记肽(1μM)时，将膜匀浆与0.005-0.35 nM范围内的至少6个浓度的[His1，125I-Tyr10，Nle27]hGH-RH(1-32)NH2共温育。
在γ-计数器内对沉淀作放射活性计数。以竞争性结合实验测定待测拮抗性肽对大鼠垂体GH-RH受体的亲和性。以Ki(抑制剂-受体复合物解离常数)评估最终的结合亲和性，并可借助于Munson和Rodbard的Ligand PC和McPherson计算机程序(P.J.Munson和D.Rodbard，分析生物化学，107，220-239，1980)测定。与标准拮抗剂[Ac-Tyr1，D-Arg2]hGH-RH(1-29)NH2相比较的相对亲和性被计算为所测定GH-RH拮抗剂的Ki对标准拮抗剂的Ki之比。体内试验对Sprague-Dawley雄性幼大鼠(200-250g)试验了这些相似物的GH-RH拮抗作用。每次实验用5组动物，每组7只动物。将这些化合物(80μg/kg)和GH-RH(1-29)NH2(3μg/kg)溶解于5.5％甘露醇，在戊巴比妥钠麻醉下对大鼠颈静脉作静脉内注射。根据如下方案，不同组之间给予拮抗剂和给予GH-RH之间的时间间隔不同。第一组动物在给予拮抗剂之后5分钟接受GH-RH注射；对于第二、第三和第四组动物，注射拮抗剂和注射GH-RH之间的时间间隔分别是15、30和60分钟。对照组先只注射溶剂不注射拮抗剂，5分钟之后注射GH-RH。
给予拮抗剂之前(“血液0”)，以及注射GH-RH之后5分钟(“血液1”)各采血样0.4ml用于GH RIA测定。每组中的GH应答被计算为rGH＝(GH血液1/GH血液0)，以个体差异的平均数±S.E.M表示。每个处理组中对GH应答的相对抑制作用被计算为100×(rGH处理组-1)/(rGH对照组-1)。体外试验结果对过冷的大鼠垂体系统测定的拮抗活性和结合测定的体外试验结果分别被概括在表II和表III中。从这些数据可以看到，当与标准拮抗剂相比较，分子中存在取代基可导致巨大地增加体外试验中的受体结合以及对GH释放的抑制作用。体外试验中最强有力的拮抗剂肽1，在标准试验条件下导致对GH-RH诱发的GH释放的完全抑制达90分钟。在暴露于此相似物之后120分钟检测到GH-RH响应性恢复的第一个信号。
表II在过冷的大鼠垂体系统中对GH释放的抑制作用拮抗剂 剂量对GH释放的抑制作用(％)(nM) 0分钟 30分钟 60分钟 90分钟 120分钟标准拮抗剂100 62.1 2.519肽1 30100100100100 94肽2 30100100100100 91肽3 3085 98 91 92 87肽4 3083 86 80 79 68肽5 3079 77 59 58 50肽6 3093 93 97 95 90肽7 3097 92 82 77 65肽8 3010010098 97 90肽9 3091 87 79 72 59肽103075 69 46 24 22肽113096 89 80 56 42肽123068 75 48 52 52肽163065 87 83 56 65肽193058 47 59 23 39
表IIIhGH-RH拮抗剂的Ki值和相对亲和性(R.A)肽 Ki(nM) R.A.标准拮抗剂 2.94 1肽10.00467肽20.04664肽30.06843肽40.08734肽50.03682肽90.05851肽10 0.10727肽11 0.07141肽12 0.07042肽16 0.07042体内试验结果表IV显示对于用GH-RH拮抗剂预先处理的大鼠其血清GH应答和它们的相对抑制作用。所有被测定的相似物(肽1、肽2、肽3、肽4、肽8、肽9、肽11和肽16)对由hGH-RH(1-29)NH2激发的GH释放可产生很强的和长时间持续的抑制作用。在短期肽1和肽2是最强有力的，当在给予hGH-RH(1-29)NH2之前5分钟给予肽1和肽2抑制GH应答达95％和91％。这二个肽的作用持续至少30分钟。另一方面，在短期作用稍微弱点的肽11和肽3具有非常长时间的作用它们的作用持续至少60分钟。
表IV在给予hGH-RH(1-29)NH2之前不同的时间间隔用GH-RH拮抗剂预处理的大鼠血清GH的应答和对GH应答的相对抑制作用拮抗剂 时间间隔 GH应答相对抑制作用(分钟)平均数±S.E.M ％肽1 5 1.13±0.139515 1.87±0.136830 1.97±0.166460 3.89±0.65-8对照 3.68±0.78 0肽2 5 1.40±0.299115 3.45±0.134530 3.64±0.714160 5.41±1.35 2对照 5.47±0.97 0肽3 5 3.01±0.416815 3.63±0.806130 4.89±0.954160 5.36±0.6334对照 7.65±0.66 0肽4 5 3.08±0.588215 7.73±1.12433012.00±2.54 76011.88±0.90 8对照12.82±1.38 0肽8 5 2.3±0.3 7415 3.6±0.4 4630 5.5±0.6 860 5.8±0.7 1对照 5.8±0.5 0肽95 2.75±0.757515 3.85±0.505930 3.34±0.306760 7.32±1.1610肽11 5 5.15±1.11841513.64±1.41503016.04±4.36406016.61±6.0238对照26.17±3.92 0肽16 5 2.89±0.657715 3.44±0.627030 5.24±1.364860 9.19±1.89 0对照 9.13±1.69 0实施例IV肿瘤学试验对多种癌症模型试验了本发明肽的抗肿瘤活性。将这些新型的抗肿瘤作用同以前的相似物(MZ-4-71和MZ-5-156，属于美国专利5,550,212和美国专利申请08/642,472)进行比较。GH-RH拮抗剂对MXT小鼠乳腺肿瘤的作用对雌性BDF小鼠皮下移植雌激素非依赖性MXT肿瘤。移植后的第一天将小鼠分组，每组10只动物，并开始治疗。第1、2、3和4组小鼠以每天20μg的剂量接受不同GH-RH拮抗剂的皮下注射，每日一次持续18天。第5和6组小鼠以每日20μg肽的剂量通过Alzet渗透泵释放给予这二种肽。定期测量肿瘤，计算肿瘤的体积。在第18天处死这些小鼠，测定肿瘤的重量。结果肽1和肽3对MXT小鼠乳腺癌具有相似的强抑制作用。以MZ-5-156治疗也导致肿瘤生长的显著抑制，但是它的作用比肽1和肽3的作用弱(见表V和
图1)。
表V用GH-RH拮抗剂对MXT小鼠乳腺肿瘤的治疗作用分组 肿瘤体积(mm3) 肿瘤重量残活小鼠第14天第18天 (mg) 的数目1.对照 4051±1007 7040±646 7269±29252.MZ-5-156 2717±773 5368±408*4885±480*43.肽1每日注射2924±6544373±381**6964±67664.肽3每日注射1902±349**3465±607**5266±90685.肽1泵 1329±327**3403±584**4810±645*76.肽3泵 1688±220**4272±295**5939±4538*p＜0.05**p＜0.01GH-RH拮抗剂对裸小鼠中MDA-MB-468人乳腺癌异种移植物的作用将带有MDA-MB-468激素非依赖性人乳腺癌异种移植物的裸小鼠分成每10只动物一组。治疗组接受每日一次皮下注射20μg GH-RH拮抗剂。第一组用肽1治疗，第二组用MZ-5-156治疗作为比较。对照组注射赋形剂溶剂。治疗持续5周。每周测量肿瘤一次，计算肿瘤体积。实验结束时处死小鼠，测量肿瘤的重量。结果二种肽都对MDA-MB-468异种移植物发挥了显著的肿瘤抑制作用。在注射肽1的组，在实验过程中4个肿瘤显著出持续的退化。同样MZ-5-156导致3个肿瘤退化。治疗5周之后，这些癌症退化成小的疤痕状组织残余物。对这些组织的组织学检查揭示出具有广泛坏死的未分化上皮肿瘤，只有狭窄的活肿瘤组织边缘线。相反，在对照动物的所有肿瘤都稳定地发展了。在治疗组最后的肿瘤体积和重量都显著减少了(见表VI和图II)，肽1具有较强的作用。
表VI用GH-RH拮抗剂对裸小鼠中MDA-MB-468人乳腺癌异种移植物的治疗作用分组 肿瘤的最后体积肿瘤重量 退化肿瘤(mm3) (mg) 的数目对照 477.5±41.2440.7±37.70肽1 82.4±29.1**64.0±28.7**4MZ-5-156 104.4±32.2**77.7±31.7**3*p＜0.05**p＜0.01GH-RH拮抗剂对裸小鼠中HT-29人结肠癌异种移植物的作用将HT-29人结肠癌皮下注射移植进入雄性裸小鼠。移植后19天将小鼠分组，每组10只动物，并开始治疗。小鼠以每天20μg的剂量每天接受一次不同GH-RH拮抗剂皮下注射，持续6周。定时测量肿瘤，计算肿瘤的体积。实验最后处死小鼠，测量肿瘤的重量。结果肽1和MZ-5-156对HT-29人结肠癌具有同等强度的抑制作用。用肽9治疗导致了较小但仍有显著性的肿瘤生长抑制作用。肽11和MZ-4-71只具有很小的非显著性作用。(结果概括在表VII和图III中)。
表VII用GH-RH拮抗剂对裸小鼠中HT-29人结肠癌异种移植物的治疗作用分组 肿瘤最后的体积(mm3) 肿瘤重量(mg)对照2117±751 2364±835MZ-4-71 1953±400 2189±458MZ-5-156 908±195*1012±174*肽111663±610 1849±681肽9 1194±506*1383±576*肽1 890±322*1354±480**p＜0.05GH-RH拮抗剂肽1对裸小鼠内U87MG人神经胶质瘤异种移植物的作用以U87MG神经胶质瘤植入小鼠皮下，当肿瘤达到大约70mm3体积时将小鼠随机分成2个实验组。一组用肽1治疗，每日皮下注射一次20μg，持续28天，而另一组作为对照。结果与对照组比较，用肽1治疗4周后抑制肿瘤生长达77％(见表VIII和图IV)。
表VIII用GH-RH拮抗剂肽1对裸小鼠内U87MG人神经胶质瘤异种移植物的治疗作用分组肿瘤的最后体积(mm3) 肿瘤重量(g)对照 3425±7234.7±1.3肽1 817±323**1.4±0.7****p＜0.01GH-RH拮抗剂对裸小鼠内PC-3人前列腺癌异种移植物的作用以3mm3小片PC-3人激素-非依赖性前列腺癌组织皮下植入雄性裸小鼠的腹部二侧。当肿瘤达到大约40-50mm3体积时将小鼠分成3个实验组。第一组和第二组分别用肽3和MZ-5-156治疗，每日皮下注射一次20μg，持续21天，而第三组用作对照组。每隔一周测量肿瘤的体积，在实验结束时测量肿瘤重量。结果二种GH-RH拮抗剂都抑制PC-3肿瘤生长(见表IX和图V)。肽3具有较强的生长抑制作用(抑制肿瘤体积65％，肿瘤重量62)，MZ-5-156较弱(分别为52％和46％)。
表IX用GH-RH拮抗剂对裸小鼠内PC-3人前列腺癌异种移植物的治疗作用分组肿瘤最后体积(mm3) 肿瘤的重量(mg)对照 307.9±64.5 191.8±42.6肽3 107.9±12.5*73.7±11.9*MZ-5-156 148.9±41 104.3±27.2*p＜0.0权利要求
1.一种选自具有如下结构式的肽及其可药用的盐X-R1-R2-Asp-Ala-R5-R6-Thr-R8-R9-R10-Arg-R12-R13-R14-R15-R16-Leu-R18-R19-Arg-R21-R22-Leu-Gln-Asp-Ile-R27-R28-R29-NH2其中X是PhAc、IndAc、Ibu、Nac、1-或2-NPr、或者Fpr，R1是Tyr或His，R2是D-Arg或D-Cit，R5是Ile或Val，R6是Phe、Nal或Phe(Y)、在此Y＝F、Cl、Br，R8是Asn、Gln、Ser、Thr、Ala、D-Asn、D-Gln、D-Ser、D-Thr、Abu、D-Abu或Aib，R9是Arg、Har、Lys、Orn、D-Arg、D-Har、D-Lys、D-Orn、Cit、Nle、Tyr(Me)、Ser、Ala或Aib，R10是Tyr或Phe(Y)，在此Y＝H、F、Cl、Br或OCH3，R12是Lys、D-Lys或Orn，R13是Val或Nle，R14是Leu或Nle，R15是Gly、Ala、Abu、Nle或Gln，R16是Gln或Arg，R18是Ser或Nle，R19是Ala或Abu，R21是Lys或Orn，R22是Leu、Ala或Aib，R27是Met、Leu、Nle、Abu或D-Arg，R28是Arg、D-Arg、Ser、Asn、Asp、Ala或Abu，R29是Arg、D-Arg、Har或D-Har。
2.权利要求1的化合物，是选自下列的肽[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽1[IndAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽2[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Har9，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽3[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽6[PhAc0，His1，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽7[Nac0，His1，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽8。
3.权利要求1的化合物，具有如下结构式[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽1。
4.权利要求1的化合物，具有如下结构式[IndAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽2。
5.权利要求1的化合物，具有如下结构式[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Har9，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽3。
6.权利要求1的化合物，具有如下结构式[PhAc0，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Tyr(Me)10，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽6。
7.权利要求1的化合物，具有如下结构式[PhAc0，His1，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽7。
8.权利要求1的化合物，具有如下结构式[Nac0，His1，D-Arg2，Phe(pCl)6，Arg9，Abu15，Nle27，D-Arg28，Har29]hGH-RH(1-29)NH2肽8。
9.一种对需要抑制过量GH水平的病人抑制过量GH水平的方法，包括给予该病人有效剂量权利要求1的化合物。
10.一种治疗患有癌症病人的方法，其癌症携带有对IGF-1或-II的受体，此方法包括给予该病人有效剂量权利要求1的化合物。
11.一种抑制肿瘤(癌)中IGF-II水平和这种肿瘤中IGF-IImRNA表达的方法，此方法包括给予该病人有效剂量权利要求1的化合物。
全文摘要
在此提供了一系列新型的hGH－RH(1－29)NH
文档编号C07K14/60GK1328570SQ99813735
公开日2001年12月26日 申请日期1999年11月23日 优先权日1998年11月25日
发明者A·V·沙利, J·瓦格加, M·扎兰蒂 申请人:图兰恩教育基金管理人