选择性Nox1抑制剂肽及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于预防和/或治疗与NADPH氧化酶I (Noxl)活性和/或活性氧簇 (reactive oxygen species) (ROS)产生增加相关的病理学病症和疾病的新型肽、组合物和 方法。因此，所述新型肽特别适用于治疗和/或预防癌症、动脉粥样硬化、血管发生和衰老。
【背景技术】
[0002] Noxl在生理条件下和一些病理学病症中生成R0S。已知ROS在生物体内导致损伤， 因此与许多不同的病症相关。还已知NADPH氧化酶为氧化应激的来源，其导致了许多病症 的病因。已知Noxl的表达与许多不同的病症（包括癌症）相关。
[0003] 没有毒性的治疗选择性显然对治疗剂而言是重要的。具体而言，在癌症治疗中，优 先杀死癌症细胞而对正常细胞没有毒性是最重要的考虑因素之一。
[0004] 在本发明之前，已鉴定了若干NADPH氧化酶（Nox)的抑制剂，但是迄今为止尚未开 发出特异性的Nox抑制剂。
[0005] 还已经测试了若干可穿透细胞的肽抑制齐[I，例如gp91ds_tat肽、PR-39,以及Rac 肽抑制剂。gp91ds-tat肽被设计为通过模拟Nox2序列来特异性抑制Nox2,所述Nox2序列 被认为对与p47phox的相互作用而言是重要的。但是，由于所述肽革El向的区域在其他Nox 同工型中是同源的，因此，所述肽缺少特异性。此外，所述肽是低效抑制剂，其在50mM时抑 制嗜中性粒细胞的ROS生成达25%。
[0006] 最近，GenKyoTex公司使用吡唑并-吡啶并-二氮杂卓、-吡嗪和-噁嗪二酮衍生 物开发了更特异性的Nox抑制剂，其具体祀向Noxl和Nox4酶。GenKyoTex目前正在使用 小分子GKT137831进行I期临床试验，用于治疗糖尿病肾病。还进行了临床前试验用于治 疗糖尿病肾病、动脉粥样硬化、特发性肺纤维化、肝纤维化和血管发生的模型。但是，尽管 GKT137831是特异性针对Noxl/Nox4的，但其也对Nox2、Nox3和Nox5表现出亲和性，因此 具有低选择性。
[0007] 其他化合物已被使用多年，包括夹竹桃麻素（apocynin)、二亚苯基碘鐵（DPI)、 4-(2-氨基乙基）-苯磺酰氟盐酸盐（AEBSF)和新蝶呤。
[0008] 夹竹桃麻素是从胡黄连（Picrorhiza kurroa)中提取的，其能够阻止活性氧化酶 复合体的形成。但是，夹竹桃麻素的抑制作用是有争议的。实际上，已证明夹竹桃麻素并非 特异性针对NADPH氧化酶，而是影响其他事件，例如血栓素 A2形成和AP-I转录因子的诱 导，并且夹竹桃麻素是抗氧化剂而非Nox抑制剂。
[0009] 二亚苯基碘鑰（DPI)是所有黄素酶的非特异性抑制剂，因此能够抑制Nox酶，但是 也能够抑制黄嘌呤氧化酶和细胞色素 P450酶。除了是非选择性的，还已经证明DPI具有毒 性。它还是乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶以及内部Ca2+栗的抑制剂，除了其固有的毒性之 外这也引起了对其应用的主要忧虑。
[0010] 已证明氨基乙基-苯磺酰氟（AEBSF)阻止黄素细胞色素 b55S与p47 ph°x结合、NADPH 氧化酶的激活以及巨噬细胞中0 ·_2产生的激发。但是AEBSF主要是丝氨酸蛋白酶抑制剂； 因此它能够以更高效率抑制蛋白酶（例如糜蛋白酶、激肽释放酶、纤溶酶、凝血酶和胰蛋白 酶），并具有许多其他作用。
[0011] 已证明一些其他非特异性分子一一其被误导性地命名为间接Nox抑制剂一一干扰 影响Nox酶的上游信号转导通路。这些分子包括抑制Nox酶的TOGF-依赖性Src激活的硫 代三唑并嘧啶化合物VAS2870、血管紧张素转化酶抑制剂（ACE抑制剂）、Ang II受体阻断剂 (ARB)、磷酸二酯酶、类花生酸、皮质类固醇、MAP激酶、蛋白激酶C的抑制剂（例如苯并（b) P比喃 _4_ 酮衍生物，Shionogi Pharma 的 S17834) 〇
[0012] 还有越来越多对使用针对Nox酶的SiRNA方法的报道。具体而言，已经开发一些 RNAi来降低Noxl表达。但是，使用RNAi作为人类的治疗干预仍处于初级阶段，并且可能需 要数年时间来优化。不幸的是，仅真正测试了少量siRNA对Nox同工型的特异性。没有任 何令人满意的用于选择性抑制Nox，特别是Noxl的siRNA方法。
[0013] 因此，迄今为止已开发的化合物无法直接发挥作用阻断所述酶，而是干扰上游转 导通路或作为抗氧化剂或ROS清除剂起作用。然而，能够直接阻断所述酶的唯一一类化合 物缺少选择性并抑制其他酶活性。它们还具有低效力和生物利用度，从而无法在药理学上 证明它们在体内以Nox作为治疗靶标。Nox酶的若干小分子和肽抑制剂已经被用在实验研 究中，但是特异性和毒性的问题限制了任何现有化合物作为药物开发的候选者。
[0014] 考虑到在最近的研究中记载的大量疾病靶标，找到Nox酶的新型临床上有用的抑 制剂是至关重要的。但是，最大的挑战是发现能够特异地作用于单个Nox同工型的肽抑制 剂。
[0015] 申请人已接受并成功解决了这一挑战。事实上，本发明提供了直接并特异性阻 断NADPH氧化酶I (Noxl)装配的新型肽抑制剂，其不抑制其他NADPH氧化酶，特别是Nox2、 Nox4、Nox5、Duoxl和Duox2。Noxl涉及广谱疾病的发生和发展，所述疾病包括癌症、衰老、 神经变性疾病和心血管疾病，因此Noxl代表了重要的治疗靶标。因此，本发明的新型肽也 是特别有利的，因为其不具有非特异性ROS清除或抗氧化活性并且它们不抑制其他ROS来 源。与RNAi技术相比，所述肽抑制剂非常特异性地针对其靶蛋白，从而降低了脱靶效应的 可能性。与化学抑制剂相比，本发明的肽在体内未表现出毒性作用。此外，本发明的肽易于 设计和生产。
【发明内容】
[0016] 因此，本发明提供本身包括氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列包括至少7至35个 连续氨基酸，包括以下氨基酸通用序列的一部分：X1-P-X2-X3-P-X4-R(SEQ ID N0:1)，其中 Xl 是 A、P 或 Q ;X2 是 P、T、V、A、S、C、M 或 K ;X3 是 L、I、V 或 A ;X4 是 T、V、S、A、Μ。所述肽 特别适用于预防和/或治疗与Noxl活性和/或活性氧簇（ROS)产生增加相关的病理学病 症或疾病的方法。
[0017] 本发明涉及能够选择性抑制Noxl激活的新型选择性肽，在下文中将其称为Noxl 抑制剂肽。因此这些新型肽适合用作药物、用作光保护试剂和/或用作抗衰老试剂。它们 可任选地缀合至细胞穿透肽或增加所述肽在细胞中积累的试剂（细胞载体）。
[0018] 根据第一实施方案，本发明涉及包含有效量的本发明的Noxl抑制剂肽的组合物， 以及包含治疗有效量的Noxl抑制剂肽和药学上可接受的赋形剂（vehicle或excipient) 的药物组合物，以及化妆品组合物。
[0019] 本发明的新型Noxl抑制剂肽和组合物可有利地用于治疗和/或预防氧自由基介 导的疾病一一更具体而言是NADPH氧化酶1/Noxl相关疾病一一的方法中，所述疾病包括心 血管疾病、血管发生依赖性疾病、呼吸系统疾病、皮肤疾病、神经变性疾病、过敏和自身免疫 疾病、胃肠疾病、癌症和与受损的代谢相关的疾病。最特别地，它们适用于治疗和/或预防 血管和心血管疾病、癌症疾病（例如结肠癌和皮肤癌）以及皮肤疾病、UV皮肤损伤、因衰老 导致的皮肤病症、ROS诱导的皮肤损伤、过早衰老和/或紫外线（UV A或UV B)暴露后的皮 肤肿瘤生成的方法中。
[0020] 根据第二实施方案，本发明涉及在有需要的受试者中降低活性氧簇（ROS)的水平 和/或抑制活性氧簇（ROS)的产生的方法，特别是选择性降低和/或抑制NADPH氧化酶 I (Noxl)活性的方法，其包括给予治疗有效量的新型Noxl抑制剂肽或组合物。
[0021] 根据第三实施方案，本发明涉及治疗和/或预防氧自由基介导的疾病一一更具体 而言是NADPH氧化酶1/Noxl相关疾病一一的方法，所述疾病包括心血管疾病、血管发生依 赖性疾病、呼吸系统疾病、皮肤疾病、神经变性疾病、过敏和自身免疫疾病、胃肠疾病、癌症 (例如结肠癌和皮肤癌）和与受损的代谢相关的疾病。本发明的方法还适用于治疗和/或 预防皮肤疾病、UV皮肤损伤、由衰老导致的皮肤病症、ROS诱导的皮肤损伤、过早衰老和/或 紫外线（UV A或UV B)暴露后的皮肤肿瘤生成。
[0022] 根据第四实施方案，本发明涉及制备所述新型肽以及任选地缀合至细胞穿透肽或 细胞载体的肽的方法。
【附图说明】
[0023] 图IA和IB :示出了使用台盼蓝拒染测定和MTT测定在正常的原代人角质形成 细胞上测试的每种肽的细胞毒性效应。如图IA和IB所示，采用不同浓度的肽A(SEQ ID N0:41)、肽B(SEQ ID N0:42)和肽C(SEQ ID N0:43)处理人角质形成细胞，并使用台盼蓝染 料（A)和MTT测定（B)来测量处理后24、48和72小时的生活力（viability)。相对于未处 理的细胞（NTC)，对经处理的角质形成细胞的生活力百分数进行归一化处理。
[0024] 图2A和2B :示出了使用CM-H2DCF-DA探针，在采用10或50 μ M肽抑制剂处理的 原代人角质形成细胞和ΗΤ29 (人结肠腺癌细胞系）中测量的相对ROS水平。采用10 μ M肽 A (SEQ ID NO: 41)、肽 B (SEQ ID NO: 42)和肽 C (SEQ ID NO: 43)处理细胞，并在处理后 24 小 时测量ROS水平。相对于未处理的细胞（NTC)，对ROS水平进行归一化处理（*P〈0. 05)。根 据图2A，在采用肽A (SEQ ID NO: 41)和肽B (SEQ ID NO: 42)处理的细胞中观察到ROS水平 显著降低。根据图2B，在HT29细胞中ROS水平的测量表明，采用肽A和B的处理导致ROS 水平显著降低，表明这些肽对Noxl活性的特异性抑制作用。
[0025] 图3A、3B和3C :示出了使用针对Noxl和Nox2的慢病毒介导的shRNA表达对内源 性Noxl和Nox2蛋白质表达的抑制。采用不同的shRNA(shNoxl、shNox2和对照shCtrl)转 导角质形成细胞。通过蛋白质印迹分析检查转导效率。图3A示出了 shNoxl和shNox2分 别稳定地抑制80%以上的Noxl和Nox2表达。通过蛋白质印迹分析检查转导效率。在采用 Noxl抑制剂肽A和对照肽C处理后24小时，测量相对ROS水平（3B)和Nox活性（3C)。相 对于对应的肽C处理的细胞，对ROS水平进行归一化处理。通过每微克蛋白质的相对发光 单位（RLU)测量NADPH氧化酶活性。*P〈0. 05。根据图3B，ROS水平的测量表明，在shNoxl 转导的细胞中采用抑制剂肽A的处理对ROS的稳态水平没有作用，表明肽A以非常高（接 近100% )的效率和特异性阻断了 Noxl依赖性的ROS生成。在图3C中，在使用或不使用 Noxl抑制剂肽A处理的shCtrl和shNoxl转导的细胞中测量NADPH氧化酶活性。
[0026] 图4A、4B和4C :示出了 Noxl抑制剂肽A对ROS产生和NADPH氧化酶活性的抑制， 以及因此对人和鼠角质形成细胞的光保护作用。采用10 μ MNoxl抑制剂肽A或对照乱序 肽（scramble peptide)C处理从人活组织检查样品（Ker人）和小鼠表皮（Ker小鼠）分离 的角质形成细胞。在处理后24小时测量ROS水平（4A)和NADPH氧化酶活性（4B)。强制将 采用对照乱序肽C处理的人和小鼠角质形成细胞中的NADPH氧化酶活性设定为100%。然 后评估采用Noxl抑制剂肽A处理后NADPH氧化酶活性的抑制百分数（4C)。
[0027] 图5A和5B :示出了在小鼠皮肤中肽A对Noxl活性的作用。采用以下不同剂量局部 处理SKH-I小鼠：0. 4、3和12mg/kg (每剂量3只小鼠）Noxl抑制剂肽A。在处理后2h、24h、 48h和72h采集皮肤活组织检查样品，并测量NADPH氧化酶活性（RLU/ μ g蛋白质）。相对 于未处理的（NT)小鼠对结果进行归一化处理并将其表示为Nox活性的抑制百分数（％ )。 (B)采用3和12mg/kg肽A(每剂量2只小鼠）局部处理小鼠。处理后lOmin，使小鼠暴露 于UVB(150mJ/cm 2)。在2h、24h采集皮肤活组织检查样品。在初次处理后46h，采用相同浓 度的肽A再次处理小鼠并在处理后IOmin使小鼠暴露于UVB。然后在2h、24h(即分别