专利名称：Il－15拮抗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及由野生型IL-15和IgG Fc片段组成的融合蛋白，涉及其制备并用于抑制免疫反应以及预防和/或治疗移植后遗症和/或自身免疫性疾病。
有效的免疫反应是由被激活的免疫系统T细胞启动的，该激活是由抗原或有丝分裂原诱导的。T细胞的活化需要大量的细胞变化，包括例如细胞因子及其受体的表达。在这些细胞因子中包括IL-15和IL-2。
IL-15和IL-2已知为生长因子，它在人和鼠T细胞、巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒T细胞(CTL)和淋巴细胞激活杀伤(LAK)细胞的增殖和分化中起显著的作用，同时在被例如抗免疫球蛋白(抗-IgM)或佛波醇酯激活的B细胞共刺激中起作用。这些细胞的增殖扩大了机体的免疫反应。
IL-15第一次被描述为诱导IL-2依赖的鼠细胞毒T细胞(CTLL-2)增殖的分泌性细胞因子。IL-15的特征是前体蛋白长度162个氨基酸并具有48个氨基酸前导序列，其成熟蛋白长度为114个氨基酸(Grabstein等人，(1994)Science 264(5161)965-8)。
IL-15在上皮和成纤维细胞系以及外周血单核细胞中形成。其特异性mRNA也在胎盘、骨骼肌和肾中被发现(Grabstein等人，见上)。
除生物学特性相同以外，IL-15和IL-2也具有类似的结构。两个分子均与T细胞膜上至少3个独立的受体亚单位结合，通过β和γ亚单位复合物发生的信号传导是相同的，而α亚单位对IL-15或IL-2的结合是特异的。已经发现，直接抗IL-2受体α亚单位的抗体对IL-15与其特异性α亚单位的结合没有任何影响(Grabstein等人，见上)，而直接抗IL-2受体β亚单位的抗体阻断IL-15的活性(Giri等人，(1994)EMBO J.，132822)。通过IL-15β和γ亚单位发生信号传导。
在很多疾病中，为了治疗有必要抑制患者免疫系统的反应。这些疾病包括，例如自身免疫性疾病特别是I型糖尿病(Botazzo，G.F.等人，(1985)N Engl J Med 113353)、风湿性关节炎、多发性硬化、慢性肝病、炎症性肠病、移植物抗宿主疾病[GVHD]和移植物排斥(Sakai等人，(1998)Gastroenterology，114(6)1237-1243；Kivisakk等人，(1998)Clin Exp Immunol，111(1)193197)。
假如免疫活性细胞从遗传学不同的机体中移出，那么这些细胞就与受体进行反应(GVHD)(Janeway C.A.和Travers P.，Spektrum-Verlag，德文版，1995，467页)。
器官或组织移植已经成为许多威胁生命疾病情况下的标准方法，在许多情况下已成为唯一的挽救生命治疗。但是，关于受体中的排斥反应存在着困难，这些反应被针对移植物外源细胞表面抗原的免疫应答激发。
与移植相关的移植物排斥程度依赖于供体和受体间组织原差异的大小(组织相容性)。供体和受体间存在的抗原型的差异引起后来的免疫反应，导致了直接抗移植物的排斥反应。体液和细胞反应的结果是移植物被排斥。体液效应器是不同特异性的抗体，如抗体依赖的细胞介导细胞毒，和直接抗供体HLA系统中结构的抗体。在细胞效应器中特别是细胞毒T细胞联合巨噬细胞(Immunologie[Immunology]，JanewayC.A.和Travers P.，Spektrum-Verlag，德文版，1995，522-8页)。
一个治疗方法是应用免疫抑制剂，特别是拮抗性IL-15或IL-2抗体，或IL-15或IL-2拮抗剂，来抑制体液或细胞免疫应答。
采用直接抗IL-15或IL-2分子抗体的各种治疗已被叙述。因此，例如，通过给予抗IL-2β的单克隆抗体(Mik.β-1)有可能延长同种异体移植的灵长类心脏的存活期(Tinubu等人，(1994)JImmunol.1534330)。采用直接抗T细胞特异性抗原CD3的单克隆抗体以阻断移植物排斥也有叙述(Mackie等人，(1990)TransPlantation491150)。
此外，许多改变IL-15与其受体结合行为的IL-15拮抗剂已有叙述。通过在野生型IL-15序列中导入突变而获得这些拮抗剂。因此，例如，叙述了56位[前导序列被删除后的位置8]氨基酸(天门冬氨酸)的突变(WO 96/26274)，导致与IL-15受体α亚单位结合但阻止与β亚单位的结合。在另一个方法中，156位[前导序列被删除后的位置108]氨基酸(谷氨酰胺)的突变抑制与γ亚单位的相互作用(WO 96/26274；WO 97/41232)。进而，因空间原因，当PEG化的IL-15允许与α亚单位结合时就不再可能与β亚单位结合(Pettit等人，(1997)J BiolChem，27242312-2318)。
上面叙述的IL-15拮抗剂是突变的IL-15(mut-IL-15)序列，对其自身或作为融合蛋白产生拮抗效果。这些融合蛋白是由N末端mut-IL-15片段和C末端Fc片段，特别是鼠IgG2a或人IgG1，组成的多肽(WO 97/41232；Kim等人，(1998)J Immunol.，1605742-5748)。
Fc(可结晶片段)片段被理解为不结合任何抗原的抗体片段。抗体的其它两个相同的Fab(抗原结合片段)片段具有抗原结合活性(Immunologie[Immunology]，Janeway C.A.和Travers P.，德文版(1995)，117ff页)。
但是，这些突变的IL-15分子的缺点是，同野生型IL-15相比，它们具有改变的一级、二级和三级结构，因而具有不同的降解点，导致在细胞中出现天然不存在的降解产物，可能在机体中显示毒性作用。这些和其它副作用的性质和程度是不能详细预见的。
另一个缺点是，携带移植物的患者通常终生保留这些移植物，这意味着他们需要在其整个生存期内摄取免疫抑制剂。特别地，由于我们对长期摄取这些免疫抑制剂的副作用的认识不充分，迫切需要去除这些副作用或至少限制它们。
已经显示，当给予免疫抑制成分如环孢霉素A、FK506和雷帕霉素时，这些物质抑制所有T细胞的增殖(Penn，(1991)TransplantProc，231101；Beveridge等人，(1984)Lancet 1788)。
严重的缺点是，通常的全身给予这些免疫抑制剂导致其后在整个机体的分布，而不能保证在移植的细胞、组织或器官局部存在。但是，整个机体T细胞增殖的抑制可以引起感染、毒性分解产物或甚而癌症。
因此，本发明的目的是生产在免疫应答被抑制的机体内不显示、或很少显示任何副作用的免疫抑制剂。
已知，突变的IL-15分子或含有mut-IL-15和Fc片段的融合蛋白，通过抑制或改变受体结合行为而对IL-15具有拮抗作用。
尽管本身可能期待拮抗作用，但是，含有N末端野生型IL-15和C末端Fc片段，特别是鼠IgG2a，的融合蛋白也显示拮抗作用还是完全令人吃惊的。仅仅通过在天然存在的通常免疫刺激性的IL-15分子上附着Fc片段，就可能逆转作用机制并获得免疫应答的抑制。
此发现令人吃惊地准确，因为假定融合蛋白的野生型IL-15片段自然地折叠，不可能设想附着的Fc片段本身能够改变受体结合行为而使整个野生型IL-15-Fc分子显示对野生型IL-15的拮抗作用。
因此，本发明的部分主题涉及融合蛋白，它一方面由野生型IL-15组成，另一方面包括IgG Fc片段，除鼠IgG2b Fc片段以外。
按照本发明，融合蛋白要理解为融合基因的表达产物。连接两个或多个基因或基因片段产生了融合基因，导致形成新的联合。
按照本发明，野生型IL-15被理解为天然存在的IL-15，例如Grabstein等人，(1994)Science 264(5161)965-8中所叙述的，或其等位变异体。
Fc(可结晶片段)片段被理解为不结合任何抗原的抗体片段，例如，缺少可变区或部分或完全缺少重链和轻链第一个恒定区的抗体分子。Fc片段可以是天然来源的、重组制备的和/或合成的。技术人员熟悉适合的方法。
按照本发明，融合蛋白的Fc片段是免疫球蛋白G(IgG)，特别地，人或鼠IgG1、人IgG2、鼠IgG2a、人或鼠IgG3或人IgG4，优选人IgG1或鼠IgG2a，特别是IgG1。优先选择从铰链区和下游使用IgG。Ig分子中的可弯曲区被称为铰链区。
按照本发明，IgG被理解为例如以下叙述的IgG人IgG1(Paterson，T.等人，(1998)，Immunotechnology 4(1)37-47，鼠IgG2a(Sikorav，J.L.，(1980)，Nucleic Acids Res.8(14)3143-3155)，鼠IgG1(French等人，(1991)，J.Immunol.146(6)2010-2016，人IgG2(Krawinkel，U.和Rabbitts，T.H.，(1982)，EMBO J.1(4)403-407；Wang等人，(1980)，J.Immunol.125(3)1048-1054)，鼠IgG2b(Schlomchik，M.J.，(1987)，Nature328，805-811)，人IgG3(Huck，S.等人，(1986)，Nucleic AcidsRes.14(4)1779-1789)，鼠IgG3(Wels等人，(1984)，EMBO J.，3(9)2041-2046)和已被叙述的人IgG4(Pink等人，(1970)，Biochem.J.，117(1)33-47)。
按照本发明，融合蛋白优选地是嵌合的融合蛋白，例如含野生型IL-15和异种的IgG1 Fc片段或异种的IgG2a Fc片段。
在优选的实施例中，按照本发明的融合蛋白含以下氨基酸序列SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4或SEQ IDNO5。
本发明主题更进一步的部分涉及编码融合蛋白的核酸，融合蛋白一方面含野生型IL-15，另一方面含除鼠IgG2b Fc片段以外的IgG Fc片段。
按照本发明，核酸优选地编码野生型IL-15和人或鼠IgG1、人IgG2、鼠IgG2a、人或鼠IgG3或人IgG4，特别优选地人IgG1或鼠IgG2a，最优选地IgG1。
按照本发明，核酸优选地编码具有以下氨基酸序列之一的融合蛋白SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4或SEQ IDNO5。
在优选的实施例中，按照本发明的核酸含有以下DNA序列SEQID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9或SEQ ID NO10。
在本发明意义内，核酸被理解为是RNA或DNA，特别是基因组DNA、cDNA或合成的DNA，例如以磷酸酰胺化作用水平合成者。这些核酸的核苷酸的联合和/或修饰同样包括在内。此术语进一步包括单链和双链核酸。
还包括含功能性连接成分的核酸，例如一个或多个融合的基因或其活性部分，编码一个或多个按照本发明的融合蛋白，还包括定量地和/或以时间依赖方式影响基因表达的可调控结构和/或调节性核苷酸序列。
可调控元件的实例是结构性或细胞特异性或组织特异性表达的启动子。
调节性核苷酸序列包括，例如，前导子序列，聚腺苷化序列如SV40聚腺苷化信号，增强子序列，IRES序列和内含子。
下面列出的前导子序列是本发明优选前导子序列的实例
Igk前导子5`-ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGAC-3`，CD5前导子5`-ATGCCCATGGGGTCTCTGCAACCGCTGGCCACCTTGTACCTGCTGGGGATGCTGGTCGCTTCCTGCCTCGGA-3`，CD4前导子5`-ATGAACCGGGGAGTCCCTTTTAGGCACTTGCTTCTGGTGCTGCAACTGGCGCTCCTCCCAGCAGCCACTCAGGGA-3`，IL-2前导子5`-ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGT-3`，MCP前导子5`-TGAAAGTCTCTGCCGCCCTTCTGTGCCTGCTGCTCATAGCAGCCACCTTCATTCCCCAAGGGCTCGCT-3`，短天然IL-15前导子5`-ATGTCTTCATTTTGGGCTGTTTCAGTGCAGGGCTTCCTAA-3`长天然IL-15前导子ATGAGAATTTCGAAACCACATTTGAGAAGTATTTCCATCCAGTGCTACTTGTGTTTACTTCTAAACAGTCATTTTCTAACTGAAGCTGGCATTCATGTCTTCATTTTGGGCTGTTTCAGTGCAGGGCTTCCTAAAACAGAAGCC当组分的连接使存在的基因序列在转录调控影响下被翻译时，组分是功能性连接的。
本发明进一步涉及含至少一个按照本发明的核酸的载体。
在本发明意义内，载体可以是质粒，穿梭载体，吞噬型质粒(phagemids)，装配型质粒，腺病毒载体，逆转录酶病毒载体，表达载体和在基因治疗中有效的载体。
在本发明意义内，表达载体包括至少一个按照本发明的核酸，至少一个翻译启始信号，翻译终止信号和/或聚腺苷化信号以在真核细胞中表达。
可从商业获得的表达载体，特别是在哺乳动物细胞中表达者，例如pIRES(来自Clontech，Palo Alto，USA)、pCI-neo载体(来自Promega，Madison，USA)、pCMV-Script(来自Stratagene，La Jolla，USA)和pCDNA载体(来自Invitrogen，Paisley，UK)，适于结合按照本发明的NA。
按照本发明，在基因治疗中有效的载体是，例如，病毒载体如腺病毒载体、逆转录酶病毒载体或以RNA病毒复制子为基础的载体(Lindemann等人，1997，Mol.Med.3466-76；Springer等人，1998，Mol.Cell.2549-58；Khromykh，2000，Curr.Opin.Mol.Ther.；2555-69)。
在基因治疗中有效的载体也可以通过络合按照本发明的核酸片段与质粒而获得。在脂质体转染(lipofection)过程中，通过对脂质体悬液进行超声波降解制备由阳离子脂质组成的小单层囊泡。DNA离子地结合到脂质体表面上，特别地以保留正性净电荷且100％质粒DNA被脂质体络合的比例。除DOTMA(1，2-二油酸丙氧基-3-三甲铵溴化物)和DPOE(二油氧基磷脂酰乙醇胺)脂质混合物以外，现在已合成了许多新的脂质制剂并检测了它们在各种细胞系中的转染效力(Behr等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 866982-6986；Gao和Huang，1991，Biochem.Biophys.Acta 1189，195-203；Felgner等人，1994，J.Biol.Chem.269，2550-2561)。新的脂质制剂的实例是DOTAPN-[1-(2，3-二油氧)丙基]-N，N，N-三甲铵乙基硫酸酯或DOGS(TRANSFECTAM；二癸基氨基甘氨酰精胺)。增加核酸转运进细胞的辅助物质可以是，例如，结合到DNA或合成的肽-DNA分子上的蛋白或多肽，使核酸能够被转运进细胞核(Schwartz等人，1999，GeneTherapy 6282；Branden等人，1999，Nature Biotechs.17784)。辅助物质还包括能够使核酸释放进细胞浆的分子(Planck等人，1994，J.Biol.Chem.269，12918；Kichler等人，1997，Bioconi.Chem.8，213)或例如脂质体(Uhlmann和Peimann，1990，Chem.Rev.90，544)。
本发明的部分主题是含有至少一个按照本发明的核酸和/或至少一个按照本发明的载体的细胞。
此细胞优选地是前体细胞，永生细胞或干细胞，特别是多能或重能的胚胎、胎儿、新生儿或成人干细胞。这种多能胚胎干细胞或细胞系可以分离自成纤维细胞的内细胞群(Robertson，胚胎来源的干细胞系，在Teratocarcinomas and embryonic stem cellsa practical approach中，Robertson主编，IRL Press，Washington DC，1987)。特别优选的源自成人组织的干细胞包括，例如，神经元干细胞、来自骨髓的干细胞、间叶干细胞、造血干细胞、上皮干细胞、来自消化道的干细胞和导管干细胞。
按照本发明的细胞实例是上皮细胞、血管细胞、肝细胞、心脏细胞、皮肤细胞、肌肉细胞、神经细胞、骨髓细胞、CHO细胞(卵巢细胞)和来自胰腺、肾脏、眼或肺的细胞。
按照本发明的细胞特别是哺乳动物细胞，包括人细胞。此细胞可以源自例如，人、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、牛、山羊、绵羊、马、猪、狗、猫或猴，优选源自人。
按照本发明的细胞还可以被用来表达杂合基因。
按照本发明的细胞优选地以细胞系的形式存在。按照本发明的细胞系可以用按照本发明的核酸或按照本发明的载体通过转染、转化或感染细胞系而制备，采用技术人员熟悉的方法例如，转染、转化、电穿孔、微注射或感染。
本发明的另一部分主题是药物，含有至少一个按照本发明的融合蛋白、至少一个按照本发明的核酸、至少一个按照本发明的载体和/或至少一个按照本发明的细胞，以及适当情况下，含有适合的辅助物质和/或添加剂。
用于例如稳定或保存药物或诊断试剂的适合的辅助物质和/或添加剂是技术人员熟知的。这些辅助物质和/或添加剂的实例是生理性氯化钠溶液、林格氏葡萄糖溶液、葡萄糖、林格氏乳酸溶液、软化水、稳定剂、抗氧化剂、络合剂、抗菌化合物、蛋白酶抑制剂和/或惰性气体。
按照本发明的药物可以用于，例如，预防、治疗或诊断疾病。这些疾病包括例如●风湿性疾病如，风湿性关节炎、Sjgren’s综合症、硬皮症、皮肌炎、多发性肌炎、莱特尔综合征或贝堤特氏病，●I型或II型糖尿病，●甲状腺的自身免疫性疾病如，巴西多氏病、Hashimoto’s甲状腺炎，●中枢神经系统的自身免疫性疾病如多发性硬化，●皮肤病如牛皮癣、神经性皮炎，
●炎症性肠病如克隆氏病，●免疫缺陷疾病如AIDS，●血管性疾病，●移植后遗症如移植物排斥反应，和●肿瘤疾病。
按照本发明的药物采用技术人员熟悉的方法给药，例如，静脉内、腹腔内、肌肉内、皮下、颅内、眼眶内、包膜内、脊柱内、经肌肉、局部或口服。其它给药方法是例如，全身或局部注射、灌注或导管为基础的给药。
按照本发明的药物可以如下给药，例如，以口服制剂的形式如片剂和胶囊，通过粘膜如鼻或口腔，以喷雾剂形式进入肺或以dispositories形式植入皮下。例如，在EP 0 944 398-A1、EP 0 916 336-A1、EP 0 889723-A1或EP 0 852 493-A1中公开了透皮治疗系统(TTSs)。
药物可以采用体外或体内方法导入机体，前者将细胞移出患者体内，通过如DNA转染进行基因工程修饰，然后再次导入患者体内，后者将基因治疗中有效的按照本发明的载体作为裸DNA或采用按照本发明的病毒或非病毒载体或按照本发明的细胞导入患者体内。
在现有技术中已知，药物剂量取决于几个因素，例如体重、整体健康状态、体表范围、患者年龄以及与其它药物的相互作用。剂量还取决于制剂类型。因此，剂量必须由技术人员根据每个患者的个体情况确定。药物可一天一次或数次给予，且可在数天时间内用药；这也可由技术人员决定。
本发明的另一部分主题涉及人或动物器官特异的组织和/或人或哺乳动物器官，它们含有至少一个融合蛋白，至少一个编码所述融合蛋白的核酸，至少一个含至少一个所述核酸的载体，和/或至少一个含至少一个所述核酸和/或至少一个所述载体的细胞，其融合蛋白含有野生型IL-15和Fc片段。
按照本发明的人或动物器官特异的组织和/或按照本发明的人或哺乳动物器官的融合蛋白，优选地一方面含有野生型IL-15，另一方面含有人或鼠IgG1、人IgG2、鼠IgG2a、鼠IgG2b、人或鼠IgG3或人IgG4，优选人IgG1或鼠IgG2a，特别是IgG1，特别地优选非鼠IgG2b。
本发明的人或动物器官特异性组织可以是，例如来自胰腺的组织包括如胰岛细胞，以及心脏、心肌、肾、肝、肺、脾、软骨、韧带、视网膜、角膜、骨髓、皮肤、神经和/或肌肉组织。
本发明的人或哺乳动物器官可以是，例如胰腺、心脏、胰腺、肾脏、肝脏、肺脏、脾脏、眼睛和/或皮肤。
本发明的另一部分主题是转基因非人哺乳动物，具有至少一个融合蛋白、至少一个编码所述融合蛋白的核酸、至少一个含至少一个所述核酸的载体、和/或至少一个含至少一个所述核酸和/或至少一个所述载体的细胞，其融合蛋白含有野生型IL-15和Fc片段。
按照本发明的转基因非人哺乳动物的融合蛋白，优选地一方面含有野生型IL-15，另一方面含有人或鼠IgG1、人IgG2、鼠IgG2a、鼠IgG2b、人或鼠IgG3或人IgG4，优选人IgG1或鼠IgG2a，特别是IgG1，特别地优选非鼠IgG2b。
一般地，转基因动物显示组织特异地增加核酸表达，因此，非常适于例如分析免疫反应。优选使用转基因小鼠。
按照本发明，非人哺乳动物的实例是小鼠、大鼠、豚鼠、兔、牛、山羊、绵羊、马、猪、狗、猫或猴。
本发明的另一部分主题是将含野生型IL-15和Fc片段的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸、含至少一个所述核酸的载体、和/或含至少一个所述核酸和/或至少一个所述载体的细胞、或按照本发明的人或动物器官特异的组织和/或按照本发明的人或哺乳动物器官用于●抑制IL-15介导的细胞事件，●抑制IL-15与其受体的相互作用和/或●预防和/或治疗移植后遗症，特别是移植排斥反应，和/或自身免疫性疾病。
本发明的另一部分主题是将含野生型IL-15和Fc片段的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸、含至少一个所述核酸的载体、和/或含至少一个所述核酸和/或至少一个所述载体的细胞用于溶解表达IL-15受体的细胞。
按照本发明使用的融合蛋白优选地一方面含有野生型IL-15，另一方面含有人或鼠IgG1、人IgG2、鼠IgG2a、鼠IgG2b、人或鼠IgG3或人IgG4，优选人IgG1或鼠IgG2a，特别是IgG1，特别地优选非鼠IgG2b。
按照本发明的使用优选地在人或哺乳动物中起作用，或与其相关。在本发明的意义内，哺乳动物人被理解为人类，而在本发明意义内，哺乳动物被理解为例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、牛、山羊、绵羊、马、猪、狗、猫或猴。
本发明的另一部分主题是使用按照本发明的人或动物器官特异的组织和/或按照本发明的人或哺乳动物器官移植入人或哺乳动物体内。移植优选地是自体移植、同种异体移植或异种移植。
移植是采用技术人员熟知的方法将生物材料如细胞、组织或器官从身体的一部分转移到另一部分(自体移植)或从一个个体转移到另一个个体(同种异体、同基因和异基因移植)(Klein，J.S，(1991)Immunologie[Immunology]，第一版，VHCVerlagsgesellschaft，Weinheim，483页)。关于移植到另一个个体，区别在于●同基因移植中，供体和受者属于同一个种属且在基因型上完全或在很大程度上是一致的，●同种异体移植中，供体和受者属于同一个种属但在免疫基因型上不同，和●异种移植中，供体和受者不属于同一个种属，其结果在免疫基因型上完全不同。
制备按照本发明的融合蛋白的方法也是本发明的一个方面，含以下步骤a.将至少一个按照本发明的核酸和/或至少一个按照本发明的载体导入细胞中，和b.在适合的条件下表达核酸。
也是本发明的一个方面。
将核酸、载体和基因如鉴定标记基因或转染标记基因导入细胞的方法为技术人员所熟知，并包括以前技术中常例的方法，如电穿孔、注射、转染和/或转化。当导入物含有裸核酸，特别是DNA时，这些方法是特别优选的。
表达核酸的适合条件可以依例如表达载体而建立，例如依上面提到的表达载体和可调控结构如启动子或调节性核酸序列。一般地，表达载体也含有适合于指定细胞或适合于各自情况下要转录基因的启动子。
允许在真核细胞中结构性表达的可调控结构的实例是被RNA聚合酶II识别的启动子。这些在所有细胞和组织类型中结构性表达的启动子实例是，CD11c启动子，pGK(磷酸甘油酸激酶)启动子，CMV(巨细胞病毒)启动子，TK(胸苷激酶)启动子，EF1α(延伸因子1α)启动子，SV40(猿猴病毒)启动子，RSV(劳氏肉瘤病毒)启动子和pUB(泛素)启动子。
允许在真核细胞中细胞特异或组织特异表达的可调控结构的实例是，由基因启动子或增强子组成的启动子或激活子序列，所述基因编码仅在某种细胞类型中表达的蛋白。这些启动子的实例为胰腺β细胞的胰岛素启动子、神经细胞的Sox-2启动子、肝细胞的白蛋白启动子、肌肉细胞的肌球蛋白重链启动子、内皮细胞的VE-cadherin启动子和上皮细胞的角蛋白启动子。
允许在真核细胞中调节性表达的可调控结构的其它实例是，RU486-可诱导的启动子和四环素操纵子联合相应的抑制子(Gossen M.等人，(1994)Curr.Opin.Biotechnol.5，516-20)。
还可以通过定量地和/或以时间依赖方式影响表达的调节性核苷酸序列控制表达。这些序列包括例如增强子序列、前导子序列、聚腺苷化序列、IRES序列和内含子。
本发明的另一部分主题是制备按照本发明的人或动物器官特异的组织和/或按照本发明的人或哺乳动物器官的体外方法，该方法包括以下步骤a.在人或动物器官特异的组织和/或人或哺乳动物器官的至少一个干细胞、一个前体细胞和/或一个永生细胞中，在第一个部位导入至少一个编码融合蛋白的核酸和/或含至少一个所述核酸的至少一个载体，其融合蛋白含有野生型IL-15和Fc片段，和在第二个部位导入至少一个适合的鉴定标记基因，b.鉴定步骤a.中的细胞，c.从步骤b.中选择鉴定的细胞，和
d.将步骤c.中选择的细胞导入至少一个人或动物器官特异的组织和/或至少一个人或哺乳动物器官。
在优选的实施例中，上述按照本发明的方法中，至少一个适合的转染标记基因在步骤a.之后、之前或同时被导入，且在步骤a.后优先地选择步骤a.中转染的细胞。
鉴定细胞的适合条件可以通过例如添加启动所需细胞分化的生长因子而建立。
很多选择细胞的方法是技术人员已知的。
为了从其它细胞中选择分化的细胞，本发明的方法优选地包括阳性选择方案。就此，标记基因如传递抗生素抗性的基因在分化步骤之前、之中或之后被导入细胞，并在适合的条件下表达。这些条件可以包括例如，标记基因在启动子控制下表达，该启动子仅在所需细胞中起作用。
标记基因的表达给已经成功分化的细胞传递抗生素抗性。因此，可以通过例如将细胞与相应的抗生素接触而容易地实现分化后细胞的选择。不具有相应抗生素抗性的细胞死亡，如此只有分化的细胞存活。在本发明的意义内，接触到可以通过例如向细胞培养的营养基中添加活性物质而实现。
按照本发明的抗生素被理解为，用作本发明选择盒的抗生素抗性基因产生的抗性所针对的抗生素。当抗生素加入培养的干细胞后，仅存活和分化的干细胞基本上是带有报告子基因表达载体的细胞。
在细胞中优选导入第二个标记基因，从而有可能选择其中按照方法的步骤a.成功被导入核酸和/或载体的细胞。通过此双重选择，有可能获得近似90％，优选近似95-100％纯度的所需细胞群。
例如为这些选择，有可能使用鉴定标记基因和转染标记基因。介导对指定毒性物质如抗生素抗性的基因是主要地被用作此特性的基因。最经常被用于此范围的抗生素是新霉素、潮霉素(hph)、zeocin(Sh ble)和嘌呤霉素(pacA)。
适于选择，特别是选择干细胞的其它基因是，例如，调控表面分子或荧光标记表达的基因如GFP，它可以被用来通过细胞分类纯化要选择的细胞。其它实例是编码酶活性的基因，该酶的活动使毒性物质前体，即称为“前药”者，转化为毒性物质。在此情况下，选择可以是阴性的，即，仅有存活的细胞是不表达位于基因上游的启动子的细胞。
本发明的另一部分主题是产生按照本发明的转基因非人哺乳动物的方法，该方法包括以下步骤a.在非人哺乳动物的至少一个卵母细胞、一个干细胞、一个前体细胞和/或一个永生细胞中，一方面导入至少一个编码融合蛋白的核酸和/或含至少一个所述核酸的至少一个载体，其融合蛋白含有野生型IL-15和Fc片段，和另一方面导入至少一个适合的转染标记基因，b.选择步骤a.中转染的细胞，c.将按照步骤b.选择的细胞导入至少一个非人哺乳动物胚细胞中，d.将步骤c.的胚细胞导入非人，优选假孕的，哺乳动物代母中，和e.鉴定从所述胚细胞发育成的转基因非人哺乳动物。
导入胚细胞的方法是技术人员已知的。胚细胞可以通过例如注射被导入(Hogan，B.，Beddington，R.，Constantini，F.和Lacy，E.，实验室手册(1994)，Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
例如，可以通过从转基因非人哺乳动物，如小鼠尾，中提取基因组DNA来鉴定转基因非人哺乳动物。在随后的PCR(聚合酶链式反应)中，使用的引物特异地识别按照本发明的核酸的转基因。可以用此方式探测转基因的整合。
另一个实现鉴定的可能性是通过Southern印记法。在此方法中，基因组DNA被转移到膜上并用DNA探针检测，如对广受欢迎的转基因特异的放射性标记DNA探针。
再生非人干细胞、卵母细胞、前体细胞或永生细胞得以产生转基因非人动物，特别是转基因小鼠，技术人员从以下文献中知道依此产生按照本发明的转基因非人哺乳动物的方法DE 196 25 049和美国专利US 4,736,866；US 5,698,765；US 5,583,278和US 5,750,825，并包括例如通过直接注射按照本发明的表达载体进入胚细胞或精母细胞，或通过将表达载体转染进胚胎干细胞而产生的转基因动物(Polites和PinkertDNA微注射和转基因动物的产生，Pinkert，1994转基因动物技术实验室手册，Academic Press，San Diego，USA，15-68页；Houdebine1997，Harwood Academic Publishers，Amsterdam，The Netherlands；Doetschman胚胎干细胞中的基因传递，Pinkert，1994中115-146页，见上；Wood逆转录酶病毒介导的基因传递，Pinkert，1994中147-176页，见上；Monastersky基因传递技术可选技术和应用，Pinkert，1994中177-220页，见上)。
还可以通过将按照本发明的核酸直接注射进非人哺乳动物的原始核而制备转基因非人哺乳动物。
很多制备转基因动物特别是转基因小鼠的方法，技术人员也从以下文献中已知WO 98/36052，WO 01/32855，DE 196 25 049，US4,736,866，US 5,625,122，US 5,698,765，US 5,583,278和US 5,750,825，并包括例如通过直接注射按照本发明的表达载体进入胚细胞或精母细胞，或通过将载体或核酸转染进胚胎干细胞而产生的转基因动物(Polites和PinkertPinkert，(1994)转基因动物技术实验室手册，Academic Press，London，UK，15-68页；Doetschman，Pinkert，1994中115-146页，见上)。
本发明的另一部分主题涉及按照本发明上述方法产生的转基因非人哺乳动物及其后代。
在其它实施例中，在所述制备按照本发明的人或动物器官特异的组织和/或按照本发明的人或哺乳动物器官的按照本发明的体外方法中，以及在产生按照本发明的转基因非人哺乳动物中，使用的干细胞是多能或重能的胚胎、胎儿、新生儿或成人干细胞。
本发明的部分主题是用按照本发明的转基因非人动物来获取同种异体移植和/或异种移植的细胞、器官特异的组织和/或哺乳动物器官。
当移植细胞时，可以采用例如植入方法或通过导管经血管壁注射的方法来实现。
在本发明意义内，“获取”被理解为从按照本发明的转基因非人哺乳动物体内移出所述细胞、组织和/或器官。实现此移出的适合方法为技术人员所熟知。
本发明的部分主题还有，应用按照本发明的转基因非人哺乳动物、按照本发明的人或动物器官特异的组织、和/或按照本发明的人或哺乳动物器官，以发现药理学活性化合物和/或鉴定毒性物质。
这种方法可以是，例如，在96孔微滴定板上接种本发明的细胞，然后添加要检测的药理学活性或毒性物质，随后通过测定细胞计数来分析该物质是否增加细胞死亡率。
在本发明意义内，术语药理学活性化合物和毒性物质被理解为，在适合条件下对动物或哺乳动物的特殊细胞、特殊组织、特殊器官或整体具有药理学作用或毒性作用的所有分子、化合物和/或组合物和物质混合物。可能的药理学活性化合物和毒性物质可以是简单的化学(有机或无机)分子或化合物、核酸或核酸类似物、核酸反义序列、肽、蛋白或复合物和抗体。实例是来自材料文库并被分析了其药理学或毒性活性的有机分子。
药理学活性化合物的实例是对以下具有影响的活性化合物●细胞分裂和/或存活的能力，●蛋白分泌，例如胰腺β细胞分泌胰岛素，或神经细胞分泌多巴胺，●肌肉细胞收缩，和/或●细胞的迁移行为。
当用于动物或哺乳动物整体时，被理解为对以下有影响，例如●心血管系统，●神经系统，还有●代谢活性。
毒性物质的实例是以下活性化合物●接到信号如应激后，刺激细胞发生凋亡，●对心血管系统具有影响，●对神经系统具有影响，和/或●对代谢活性具有影响。
在与适合的添加剂和/或辅助物质适当联合或加在一起的情况下，已被鉴定的药理学活性物质和毒性物质可被用于生产诊断试剂或药物以诊断、预防和/或治疗移植后遗症和/或自身免疫性疾病，如上面作为实例所列出的。
下面的附图和实施例是要阐明本发明，但不是限制它。
图1a描绘氨基酸序列WT-IL-15-hIgG1，图1b描绘氨基酸序列WT-IL-15-mIgG2a，图2a描绘氨基酸序列WT-IL-15，图2b描绘氨基酸序列hIgG1，图2c描绘氨基酸序列mIgG2a，图3a描绘氨基酸序列Igk8，图3b描绘氨基酸序列149-Fc，图4描绘核酸序列WT-IL-15-hIgG1，图5描绘核酸序列WT-IL-15-mIgG2a，图6a描绘核酸序列WT-IL-15，图6b描绘核酸序列hIgG1，图7描绘核酸序列mIgG2a，图8a描绘鼠IgK前导子的核酸序列，图8b描绘人CD5前导子的核酸序列，图8c描绘人CD4前导子的核酸序列，图8d描绘人IL-2前导子的核酸序列，图9a描绘人MCP前导子的核酸序列，图9b描绘短天然人IL-15前导子的核酸序列，图9c描绘长天然人IL-15前导子的核酸序列，图10描绘核酸序列Igk8，图11描绘核酸序列149-Fc，图12描绘不同的蛋白构建物对IL-15介导的CTLL-2细胞增殖的抑制或促进增殖效果。
注释hIgG1代表人IgG1，mIgG2a代表鼠IgG2a。
本发明的其它部分主题涉及(ii)由野生型IL-15片段和除鼠IgG2b片段外的IgG Fc片段组成的融合蛋白。
(iii)按照(i)的融合蛋白，其特征是IgG Fc片段是人或鼠IgG1、人IgG2、鼠IgG2a、人或鼠IgG3或人IgG4。
(iv)按照(i)或(ii)的融合蛋白含有氨基酸序列SEQ IDNO1或其等位基因变异体。
(v)按照(i)或(ii)的融合蛋白含有氨基酸序列SEQ IDNO2或其等位基因变异体。
(vi)按照(i)或(ii)的融合蛋白含有氨基酸序列SEQ IDNO3或其等位基因变异体。
(vii)按照(i)或(ii)的融合蛋白含有氨基酸序列SEQ IDNO4或其等位基因变异体。
(viii)按照(i)或(ii)的融合蛋白含有氨基酸序列SEQID NO5或其等位基因变异体。
(ix)编码按照(i)至(vii)中至少之一的融合蛋白的核酸。
(x)按照(viii)的核酸含有SEQ ID NO6的DNA序列或其等位基因变异体。
(xi)按照(viii)的核酸含有SEQ ID NO7的DNA序列或其等位基因变异体。
(xii)按照(viii)的核酸含有SEQ ID NO8的DNA序列或其等位基因变异体。
(xiii)按照(viii)的核酸含有SEQ ID NO9的DNA序列或其等位基因变异体。
(xiv)按照(viii)的核酸含有SEQ ID NO10的DNA序列或其等位基因变异体。
(xv)被按照(ix)-(xiii)之一的核酸编码的融合蛋白。
(xvi)含有至少一个按照(viii)-(xiv)中至少之一的核酸的载体。
(xvii)含有至少一个按照(xiii)-(xiv)中至少之一的核酸和/或含有至少一个按照(xv)的载体的细胞。
(xviii)按照(xvi)的细胞，其特征是干细胞、前体细胞和/或永生细胞。
(xix)按照(xvii)的细胞，其特征在于多能或重能的胚胎、胎儿、新生儿或成人干细胞。
(xx)细胞系形式的按照(xvi)至(xviii)中至少之一的细胞。
(xxi)含有以下成分的药物至少一个按照(i)至(vii)和(xiv)之一的融合蛋白，至少一个按照(viii)至(xiii)之一的核酸，至少一个按照(xv)的载体，和/或至少一个按照(xvi)至(xviii)之一的细胞，以及适合的辅助物质和/或添加剂。
(xxii)含有以下成分的人或动物器官特异的组织和/或人或哺乳动物器官至少一个融合蛋白，特别地按照(i)-(vii)和(xiv)之一；至少一个编码所述融合蛋白的核酸，特别地按照(viii)-(xiii)之一；含至少一个所述核酸的至少一个载体，特别按照(xv)；和/或至少一个细胞，特别地按照(xvi)-(xviii)之一，它含有至少一个所述核酸和/或至少一个所述载体，其融合蛋白含有野生型IL-15和Fc片段。
(xxiii)含有以下成分的转基因非人哺乳动物至少一个融合蛋白，特别地按照(i)-(vii)和(xiv)之一；至少一个编码所述融合蛋白的核酸，特别地按照(viii)-(xiii)之一；含至少一个所述核酸的至少一个载体，特别按照(xv)；和/或至少一个细胞，特别地按照(xvi)-(xviii)之一，它含有至少一个所述核酸和/或至少一个所述载体，其融合蛋白含有野生型IL-15和Fc片段。
(xxiv)应用以下成分制造药物抑制IL-15-介导的细胞活动融合蛋白，特别地按照(i)-(vii)和(xiv)之一；核酸，特别地按照(viii)-(xiii)之一；载体，特别按照(xv)；和/或细胞，特别地按照(xvi)-(xviii)之一，其融合蛋白含有野生型IL-15和Fc片段；或按照(xxi)的人或动物器官特异的组织和/或人或哺乳动物器官。
(xxv)应用以下成分制造药物抑制IL-15与其受体的相互作用融合蛋白，特别地按照(i)-(vii)和(xiv)之一；核酸，特别地按照(viii)-(xiii)之一；载体，特别按照(xv)；和/或细胞，特别地按照(xvi)-(xviii)之一，其融合蛋白含有野生型IL-15和Fc片段；或按照(xxi)的人或动物器官特异的组织和/或人或哺乳动物器官。
(xxvi)应用以下成分制造药物溶解表达IL-15受体的细胞融合蛋白，特别地按照(i)-(vii)和(xiv)之一；核酸，特别地按照(viii)-(xiii)之一；载体，特别按照(xv)；和/或细胞，特别地按照(xvi)-(xviii)之一，其融合蛋白含有野生型IL-15和Fc片段。
(xxvii)应用以下成分制造药物预防和/或治疗移植后遗症和/或自身免疫性疾病融合蛋白，特别地按照(i)-(vii)和(xiv)之一；核酸，特别地按照(viii)-(xiii)之一；载体，特别按照(xv)；和/或细胞，特别地按照(xvi)-(xviii)之一，其融合蛋白含有野生型IL-15和Fc片段；或按照(xxi)的人或动物器官特异的组织和/或人或哺乳动物器官。
(xxviii)采用按照(xxi)的人或动物器官特异的组织和/或人或哺乳动物器官移植到人或哺乳动物中。
(xxix)按照(xxvii)的应用，其特征在于自体移植、同种异体移植或异种移植。
(xxx)按照(i)至(vii)和(xiv)中至少之一的融合蛋白的制备方法，包括以下步骤a.将按照(viii)至(xiii)之一的至少一个核酸和/或按照(xv)的至少一个载体导入细胞中，和b.在适合的条件下表达核酸。
(xxxi)制备按照(xxi)的人或动物器官特异的组织和/或人或哺乳动物器官的体外方法，包括以下步骤a.在人或动物器官特异的组织和/或人或哺乳动物器官的至少一个干细胞、一个前体细胞和/或一个永生细胞中，在第一个部位导入至少一个编码含野生型IL-15和Fc片段的融合蛋白的核酸，和/或导入含至少一个所述核酸，特别是含按照(viii)-(xiii)之一的核酸的至少一个载体，在第二个部位导入至少一个适合的鉴定标记基因，b.鉴定步骤a.中的细胞，c.从步骤b.中选择鉴定的细胞，和d.将步骤c.中选择的细胞导入人或动物器官特异的组织和/或人或哺乳动物器官。
(xxxii)按照(xxx)的方法，其特征是在步骤a.之后、之前或同时，导入了至少一个适合的转染标记基因，并在步骤a.之后优先地选择步骤a.中转染的细胞。
(xxxiii)按照(xxx)或(xxxi)之一的方法，其特征是细胞为多能或重能的胚胎、胎儿、新生儿或成人干细胞。
(xxxiv)产生按照(xxii)的转基因非人哺乳动物的方法，包括以下步骤a.在非人哺乳动物的至少一个卵母细胞、一个干细胞、一个前体细胞和/或一个永生细胞中，一方面导入至少一个编码融合蛋白的核酸，特别是按照(vii)-(xiii)之一的核酸，和/或导入含至少一个所述核酸的至少一个载体，特别是按照(xv)的载体，其融合蛋白含有野生型IL-15和Fc片段，另一方面导入至少一个适合的转染标记基因，b.选择步骤a.中转染的细胞，c.将按照步骤b.选择的细胞导入至少一个非人哺乳动物胚细胞中，d.将步骤c.的胚细胞导入非人哺乳动物代母中，和e.鉴定从所述胚细胞发育成的转基因非人哺乳动物。
(xxxv)按照(xxxiii)的方法，其特征是细胞为多能或重能的胚胎、胎儿、新生儿或成人干细胞。
(xxxvi)转基因非人哺乳动物，其特征是采用按照(xxxiii)和(xxxiv)之一的方法产生的。
(xxxvii)转基因非人哺乳动物，其特征是按照(xxxv)的哺乳动物的子代。
(xxxviii)用按照至少(xxii)、(xxxv)和(xxxvi)之一的转基因非人哺乳动物来获取同种异体移植和/或异种移植的细胞、器官特异的组织和/或哺乳动物器官。
(xxxix)应用按照(xxii)、(xxxv)和(xxxvi)之一的转基因非人哺乳动物、按照(xxi)的人或动物器官特异的组织和/或人或哺乳动物器官，发现药理学活性化合物和/或鉴定毒性物质。
实施例试剂除非另有注释，诸如细胞培养基、酶等试剂获自Invitrogen(以前为Gibco BRL/Life Technologies)，Paisley，UK，而实验室化学药品获自Roth(Karlsruhe，Germany)。
实施例1替换信号序列该过程始于质粒，在载体pSecTagA(Invitrogen，Paisley，UK)中，它含有融合蛋白cDNA，融合蛋白由突变的人IL-15和鼠IgG2a Fc部分(铰链-C2-C3，Kim等人，1998，见上)组成。IL-15经BamHI裂解位点与Fc部分融合，导致另外的氨基酸(天门冬氨酸)被插入到连接处。
IL-15中149和156位置(相当于去除信号序列后的101和108位置)的两个谷氨酰胺残基被突变为天门冬氨酸，以使蛋白能够与IL-15受体的α亚单位结合，但阻止经β和γ亚单位的信号传导。不是特别有作用的天然信号序列被从人IL-15中去除，相对地，平截的cDNA经HindIII和XbaI裂解位点被克隆进pSecTagA载体，使得存在于质粒中的Igκ前导子能够被用作分泌信号。克隆的结果，10个另外的氨基酸被置于质粒中存在的Igκ前导子和IL-15序列起点之间。为去除这些氨基酸，且如果可能改善蛋白的分泌，Igκ前导子被各种其它蛋白的信号序列取代。就此，人IL-2、MCP-1、CD4和CD5的前导子序列作为原有Igκ前导子的替换物被克隆进来，从此仅去除了另外的氨基酸。
实施例2制备pSecTagA质粒由于信号序列的克隆要经位于前导子序列ATG启始密码子5’方向的独特NheI裂解位点和位于IL-15序列5’区内的BglII裂解位点，因此，另外的BglII裂解位点被首先从载体pSecTagA中去除。为此，用BglII(混合物9μg DNA，4μl 10×缓冲液2，26μl水和4μl BglII(40单位)，总共40μl，37℃孵育2小时)切割没有任何插入的载体pSecTagA。
经Pharmacia S400 Microspin柱(Amersham-Pharmacia，Freiburg)，从酶和缓冲液中纯化DNA。在40μl混合物中加入5μl 10×PCR缓冲液(Taq-Core试剂盒，Qiagen，Hilden)、2μl dNTPs(每个10mM，Taq-Core试剂盒，Qiagen)、2μl水和1μl(4单位)DNA聚合酶I(Klenow片段)，整体在37℃孵育1小时以替代BglII裂解位点。然后在1％琼脂糖凝胶上加载质粒，用Concert快速凝胶提取系统从凝胶上洗脱条带。整体混合物被溶解在100μl水中。7.5μl这后面的混合物和7.5μl水、4μl 5×T4连接酶缓冲液和1μl T4连接酶(1U)一起置于室温1小时，以进行连接。按照生产者(Stratagene，La Jolla，USA)的使用说明书，一半的连接混合物被转化进E.coli XLl Blue中。
上述质粒中的完整插入物，即Igκ前导子+10个另外的氨基酸-mutIL-15-mIgG2a，经NheI和XbaI裂解位点被再一次克隆进得到的质粒中。原有的Igκ前导子+10个氨基酸+5’-IL-15部分经NheI/BglII裂解被去除，并通过寡核苷酸克隆用上面提到的信号序列替换。
实施例3克隆Igκ前导子片段如下5’-NheI-前导子-IL-15-3’，在IL-15的5’部分有BglII裂解位点。由于此片段太长以致不能被单一的寡核苷酸覆盖，因而从MWG-Biotech(Ebersberg)获取了两个覆盖寡聚物及其互补链(总共4个寡核苷酸)(寡核苷酸序列见下)。选择单链的寡核苷酸，使克隆进相应限制性裂解位点(NheI和BglII)的悬垂端得以存在。寡核苷酸首先被磷酸化。为此，在含2μl 10×正向缓冲液和1μl T4多核苷酸激酶(10U)的20μl混合物中，各10μg的寡聚物在37℃孵育1小时。然后，在所有情况下，通过加热至95℃再缓慢冷却到室温对等克分子量的链型寡聚物和配对链寡聚物进行退火。在被克隆进载体之前，双链寡核苷酸过夜连接。在所有情况下，5μl的5’和3’双链寡聚物+4μl 5×T4连接酶缓冲液+5μl水+1μl T4连接酶(1U)在4℃过夜孵育。然后在2％琼脂糖凝胶上分离连接混合物，用Concert快速凝胶提取系统从凝胶上洗脱寡二聚物并溶解至终体积40μl。然后，寡二聚物被用于克隆12℃过夜实现连接(10μl寡二聚物，4μl 5×T4连接酶缓冲液，4μl水，1μl NheI/BglII切割质粒，1μl T4连接酶(1U)。20μl连接混合物中的5μl被用于转化E.coli-XL 10-Gold(Stratagene，按照生产者的使用说明书)。
Ig-κ寡核苷酸序列
5`-Ig-kappa fwdctagccaccatggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacaa互补的Ig-κrevccagttgtcaccagtggaacctggaacccagagcagcagtacccatagcaggagtgtgtctgtctccatggtgg第二个正向寡聚体3’-IL-15 fwd1.1ctgggtgaatgtaataagtgatttgaaaaaaattga互补的IL-15rev1.1gatcttcaatttttttcaaatcacttattacattcac退火和连接后，获得以下片段5’-Nhel-Ig-κ-前导子-IL-15-BglII-3’具有以下序列(双链)5′-CTAGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACAACTGGGTGAATGTAATAAGTGATTTGAAAAAAATTGAA-3′互补的3′-GGTGGTACCTCTGTCTGTGTGAGGAGCATACCCATGACGACGAGACCCAAGGTCCAAGGTGACCACTGAAGACCCACTTACATTATTCACTAAACTTTTTTTAACTTCTAG-5′注释斜体字+下划线分别是NhelII和BglII裂解位点；粗体字母Ig-κ前导子。
在miniprep(QIAamp DNA Mini Kit，Qiagen，Hilden)中检测得到克隆的限制模式。为此，用NheI/BglII(直接切除插入的前导子的限制性酶)和XbaI(切割Fc部分的3’端)进行三倍消化。
按照生产者的使用说明书，用Qiagen Endofree Maxi Kit分离阳性DNA克隆，在GATC排序(恒定性)。用此方式获得的质粒(除掉Ig-κ前导子的mutIL-15 101/108)-mIgG2a)被命名为Igκ8。
其它前导子的处置与所描述的Ig-κ构建物完全相同。
实施例4制备构建物WT-Fc和149-Fc用上述质粒Igκ8开始，通过PCR制备单独的突变体，采用5’端具有BglII裂解位点的正向引物(IL-15fw3.15’-attgaagatcttattcaatctatgc-3’)和相应的3’反向引物(WT5’-ggatccgaagtgttgatgaacatttggacaatatgtacaaaactctgcaaaaattc-3’)，(1495’-gggatccgaagtgttgatgaacatttgga-3’)。
每25μl混合物使用10ng的mutIL-15(101，108)-鼠Fc质粒作为PCR反应的模板，在所有情况下，混合物还含有25pmoles质粒，0.5μldNTPs(Taq-Core试剂盒，Qiagen)和2.5μl 10×PCR缓冲液和0.9U Taq聚合酶(Expand High-Fidelity系统，Roche，Mannheim)。DNA在下述条件下扩增30个循环95℃ 45秒变性，60℃ 60秒退火，和72℃ 45秒合成，其后扩增物在琼脂糖凝胶上纯化，PCR条带被从凝胶上洗脱并溶解在50μl TE缓冲液中。用3μl 10×缓冲液3和所有情况下15U的BamHI和BglII处理25μl混合物，并在37℃孵育1小时。经PharmaciaMicrospin S400柱纯化DNA。同样地，通过双重BglII/BamHI消化，并用含单变异的IL-15部分或野生型序列替换，含双变异的IL-15部分被从质粒Igκ8中切除。通过测序确证质粒的特性。
实施例5制备蛋白通过短时地转染HEK293细胞(ATCC，Manassas，USA)制备单独突变体的蛋白为此，每150cm2平板，60μl Lipofectamine2000被稀释在2ml Optimem 1培养基中，同样地，30μg质粒DNA(Igκ8，WT-Fc和149-Fc)被稀释在2ml Optimem 1培养基中。混合两个溶液并在室温孵育30分钟。然后，在大约80％融合的150cm2HEK-293平板上，DNA/脂质体混合物被加入细胞培养基(Dulbecco’sMEM+Glutamax+10％FCS+1％Pen/Strep)。1天后，用Ultraculture培养基(Biowhittaker，Verviers，Belgium)替换培养基，然后细胞培养基留在细胞上4天。收集细胞培养上清并通过有凹槽的过滤器(Schleicher和Schüll，Dassel)以去除粗粒的细胞成分；然后经2μm的瓶顶过滤器(Nalgene-Nunc，Wiesbaden)过滤除菌，并经蛋白A-Sepharose通过纯化分离IL-15-Fc融合蛋白。为此，每升细胞培养上清添加0.4ml已在冲洗缓冲液(20mM Tris/HCl，pH8.5，130mM NaCl)中溶胀的蛋白A-Sepharose(Amersham-Pharmacia，在冲洗缓冲液中50％v/v)，在架空振荡器中，4℃过夜振荡混合物。蛋白A-Sepharose被收集在空的层析柱中，并用至少150ml冲洗缓冲液冲洗。用0.1M甘氨酸，pH2.5，在1ml馏分中，蛋白从柱上洗脱下来，并立即用60μl的1M Tris/HCl，pH9.5中和。蛋白用PBS缓冲液透析并过滤除菌。在BCA试验(Pierce，Rockford，USA)中测定蛋白的浓度，其纯度和同一性采用银凝胶和western印迹(一抗单克隆的鼠抗人IL-15，BD BiosciencesPharmingen，San Diego USA；二抗POD-山羊抗鼠，Dianova，Hamburg)检测。然后，在增殖试验中检查蛋白的功能活性。
实施例6增殖试验CTLL-2细胞(ATCC)是鼠细胞毒T细胞，其增殖依赖IL-15或IL-2，因此能够被用作拮抗性蛋白抑制增殖作用的指示物。细胞被培养在含以下成分的培养基中RPMI1640培养基+10％热灭活的胎牛血清(FCS)+1％Pen/Strep+20％大鼠T-stim with ConA(Becton DickinsonLabware，Bedford，USA)，各种生长因子的混合物。
为准备增殖试验，通过用细胞培养基(RPMI 1640+10％FCS+1％Pen/Strep)冲洗细胞两次使之离开细胞培养所需的残留生长因子，然后在此培养基中继续培养。为此，以349g离心细胞5分钟，其后弃去上清并再次在细胞培养基中继续培养沉淀。重复离心步骤。
在平底的96孔板中进行试验，每孔使用150μl培养基，含3×104细胞。作为阴性对照，给予细胞仅含10％FCS而没有任何添加因子的培养基。阳性对照另外含有重组的人IL-15(R&DSystems，Minneapolis，USA)，以允许细胞半极限增殖的浓度(如12.5pg/孔)。在所有情况下，设置6个阴性和阳性对照。
为检测上述新IL-15-Fc变异体的增殖抑制作用，细胞用重组IL-15处理，如被描述为阳性对照，并另外给予以下形式的纯化蛋白来自Igκ8的101/108双重突变体，野生型蛋白(WT-Fc)或单突变体(149-Fc)。就此，每孔使用的最高浓度为2μg，也使用所有情况下1∶2(1μg，0.5μg，0.25μg，0.125μg，等)稀释的浓度。作为对照，以相同的浓度使用以下相关的蛋白mIgG2a(BD BiosciencesPharmingen，San Diego USA)被用作非特异抗体，也使用含未突变细胞因子的IL-2-Fc，因而刺激细胞增殖，以及CTLA4-Fc也是结构相关的融合蛋白但对增殖没有任何作用。后两个蛋白获自Chimerigen(Allston，USA)。所有混合物重复设置3遍。
在CO2孵箱中37℃孵育细胞44±2小时，其后用XTT CellProliferation试剂盒(Roche)，按照生产者使用说明书测定增殖。为此，试剂盒的两个成分以1∶50的比例混合(即，75μl XTT标记试剂+1.5μl电子耦合剂)。每孔加入75μl混合物，CO2孵箱37℃孵育4小时后，在ELISA读数器中以490对690nm测量平板。
结果显示在图23中WT-Fc、149-Fc和来自双重突变体101/108(质粒Igκ8)的蛋白对IL-15介导的CTLL-2细胞增殖具有抑制作用。如果有什么不同的话，IL-2-Fc和IgG2a具有促进增殖的作用。
阴性细胞在没有重组人IL-15的情况下培养。
阳性每孔给予细胞12.5pg的重组人IL-15。
所有在其它混合物中的细胞被给予12.5pg重组人IL-15/孔+以下浓度的指定蛋白(从左至右)2μg，1μg，0.5μg，0.25μg，0.125μg和0.0625μg。
CTLA4-Fc没有任何作用；所有数值均在阳性对照范围内(数据未显示)。
权利要求
1.由野生型IL-15片段和除鼠IgG2b片段外的IgG Fc片段组成的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征是IgG Fc片段是人或鼠IgG1、人IgG2、鼠IgG2a、人或鼠IgG3或人IgG4。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其含有氨基酸序列SEQ ID NO1或其等位基因变异体。
4.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其含有氨基酸序列SEQ ID NO2或其等位基因变异体。
5.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其含有氨基酸序列SEQ ID NO3或其等位基因变异体。
6.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其含有氨基酸序列SEQ ID NO4或其等位基因变异体。
7.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其含有氨基酸序列SEQ ID NO5或其等位基因变异体。
8.编码根据权利要求1至7至少一项所述的融合蛋白的核酸。
9.根据权利要求8所述的核酸，其含有SEQ ID NO6的DNA序列或其等位基因变异体。
10.根据权利要求8所述的核酸，其含有SEQ ID NO7的DNA序列或其等位基因变异体。
11.根据权利要求8所述的核酸，其含有SEQ ID NO8的DNA序列或其等位基因变异体。
12.根据权利要求8所述的核酸，其含有SEQ ID NO9的DNA序列或其等位基因变异体。
13.根据权利要求8所述的核酸，其含有SEQ ID NO10的DNA序列或其等位基因变异体。
14.被根据权利要求9-13之一所述的核酸编码的融合蛋白。
15.含有至少一种根据权利要求8-14至少一项的核酸的载体。
16.含有至少一种根据权利要求8-14至少一项的核酸和/或含有至少一种根据权利要求15所述的载体的细胞。
17.根据权利要求16所述的细胞，其特征是所述细胞为干细胞、前体细胞和/或永生细胞。
18.根据权利要求17所述的细胞，其特征是所述细胞为多能或重能的胚胎、胎儿、新生儿或成人干细胞。
19.细胞系形式的根据权利要求16至18至少一项的细胞。
20.含有以下成分的药物至少一种权利要求1至7和14之一所述的融合蛋白，至少一种权利要求8至13之一所述的核酸，至少一种权利要求15所述的载体，和/或至少一种权利要求16至18之一所述的细胞，以及适合的辅助物质和/或添加剂。
21.含有以下成分的人或动物器官特异的组织和/或人或哺乳动物器官至少一种融合蛋白，特别地如权利要求1至7和14之一的融合蛋白；至少一种编码所述融合蛋白的核酸，特别地如权利要求8至13之一的核酸；含至少一种所述核酸的至少一种载体，特别如权利要求15所述的载体；和/或至少一种细胞，特别地如权利要求16-18之一所述的细胞，它含有至少一种所述核酸和/或至少一种所述载体，其融合蛋白含有野生型IL-15和Fc片段。
22.含有以下成分的转基因非人哺乳动物至少一种融合蛋白，特别地如权利要求1至7和14之一的融合蛋白；至少一种编码所述融合蛋白的核酸，特别地如权利要求8至13之一的核酸；含至少一种所述核酸的至少一种载体，特别如权利要求15所述的载体；和/或至少一种细胞，特别地如权利要求16-18之一的细胞，它含有至少一种所述核酸和/或至少一种所述载体，其融合蛋白含有野生型IL-15和Fc片段。
23.以下成分用于制备抑制IL-15-介导的细胞事件的药物中的用途融合蛋白，特别地如权利要求1至7和14之一所述的融合蛋白；核酸，特别地如权利要求8至13之一所述的核酸；载体，特别如权利要求15所述的载体；和/或细胞，特别地如权利要求16-18之一所述的细胞，其融合蛋白含有野生型IL-15和Fc片段；或如权利要求21所述的人或动物器官特异的组织和/或人或哺乳动物器官。
24.以下成分用于制备抑制IL-15与其受体的相互作用的药物中的用途融合蛋白，特别地如权利要求1至7和14之一所述的融合蛋白；核酸，特别地如权利要求8至13之一所述的核酸；载体，特别如权利要求15所述的载体；和/或细胞，特别地如根据权利要求16-18之一所述的细胞，其融合蛋白含有野生型IL-15和Fc片段；或如权利要求21所述的人或动物器官特异的组织和/或人或哺乳动物器官。
25.以下成分用于制备溶解表达IL-15受体的细胞的药物中的用途融合蛋白，特别地如权利要求1至7和14之一所述的融合蛋白；核酸，特别地如权利要求8至13之一所述的核酸；载体，特别如权利要求15所述的载体；和/或细胞，特别地如权利要求16-18之一所述的细胞，其融合蛋白含有野生型IL-15和Fc片段。
26.以下成分用于制备预防和/或治疗移植后遗症和/或自身免疫性疾病的药物中的用途融合蛋白，特别地如权利要求1至7和14之一所述的融合蛋白；核酸，特别地如权利要求8至13之一所述的核酸；载体，特别如权利要求15所述的载体；和/或细胞，特别地如权利要求16-18之一所述的细胞，其融合蛋白含有野生型IL-15和Fc片段；或如权利要求21所述的人或动物器官特异的组织和/或人或哺乳动物器官。
27.根据权利要求21所述的人或动物器官特异的组织和/或人或哺乳动物器官移植到人或哺乳动物中的用途。
28.根据权利要求27所述的用途，其特征在于所述移植是自体移植、同种异体移植或异种移植。
29.一种制备根据权利要求1至7和14中至少一项的融合蛋白的方法，包括以下步骤a.将根据权利要求8至13之一的至少一种核酸和/或根据权利要求15所述的至少一种载体导入细胞中，和b.在适合的条件下表达核酸。
30.一种体外制备根据权利要求21所述的人或动物器官特异的组织和/或人或哺乳动物器官的方法，包括以下步骤a.在人或动物器官特异的组织和/或人或哺乳动物器官的至少一种干细胞、一种前体细胞和/或一种永生细胞中，在第一个部位导入至少一种编码含野生型IL-15和Fc片段的融合蛋白的核酸，和/或导入含至少一种所述核酸，特别是含根据权利要求8-13之一所述的核酸的至少一种载体，在第二个部位导入至少一种适合的鉴定标记基因，b.鉴定步骤a.所述的细胞，c.从步骤b.中筛选鉴定的细胞，和d.将步骤c.中选择的细胞导入人或动物器官特异的组织和/或人或哺乳动物器官。
31.根据权利要求30所述的方法，其特征是在步骤a.之后、之前或同时，导入至少一种适合的转染标记基因，来自步骤a.转染的细胞优选在步骤a.之后筛选。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其特征是所述细胞为多能或重能的胚胎、胎儿、新生儿或成人干细胞。
33.产生根据权利要求22所述的转基因非人哺乳动物的方法，包括以下步骤a.在非人哺乳动物的至少一种卵母细胞、一种干细胞、一种前体细胞和/或一种永生细胞中，一方面导入至少一种编码融合蛋白的核酸，特别是根据权利要求8-13之一的核酸，和/或导入含至少一种所述核酸的至少一种载体，特别是根据权利要求15所述的载体，其融合蛋白含有野生型IL-15和Fc片段，另一方面导入至少一种适合的转染标记基因，b.筛选步骤a.中转染的细胞，c.将按照步骤b.选择的细胞导入至少一种非人哺乳动物胚细胞中，d.将步骤c.的胚细胞导入非人哺乳动物代母中，和e.鉴定从所述胚细胞发育成的转基因非人哺乳动物。
34.根据权利要求33所述的方法，其特征在于所述细胞是多能或重能的胚胎、胎儿、新生儿或成人干细胞。
35.转基因非人哺乳动物，其特征在于其是采用根据权利要求33或34所述的方法产生的。
36.转基因非人哺乳动物，其特征在于其是根据权利要求35所述的哺乳动物的子代。
37.根据权利要求22、35和36中至少一项的转基因非人哺乳动物用于获取同种异体移植和/或异种移植的细胞、器官特异的组织和/或哺乳动物器官中的用途。
38.根据权利要求22、35和36之一的转基因非人哺乳动物、或根据权利要求21所述的人或动物器官特异的组织和/或人或哺乳动物器官用于发现药理学活性化合物和/或鉴定毒性物质中的用途。
全文摘要
本发明涉及由野生型IL－15片段和除鼠IgG2b片段外的IgG－Fc片段组成的融合蛋白、编码所述蛋白的核酸、载体、修饰的细胞，还涉及使用它们制备用于例如预防和/或治疗移植和/或自身免疫性疾病所致紊乱的药物。
文档编号C07K14/54GK1703423SQ200380101333
公开日2005年11月30日 申请日期2003年10月13日 优先权日2002年10月14日
发明者I·德雷埃尔, T·默尔 申请人:豪夫迈－罗氏公司