特异性拮抗c?Rel的siRNA在治疗MS中的应用
【专利摘要】本发明提供特异性拮抗c?Rel的siRNA在治疗MS中的应用，其是指针对c?Rel的拮抗剂在制备用于预防和/或治疗由炎症引起的疾病的药物中的应用。本发明还提供拮抗c?Rel的siRNA以及相应的药物组合物，该siRNA具有如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列。本发明所述组合物包含有效剂量的所述siRNA，以及药学上可接受的载体。本发明所述siRNA可特异性拮抗c?Rel，从而减少c?Rel的表达，显著减少炎症细胞，使得本发明所述siRNA可预防和/或治疗由炎症引起的疾病，特别是包括多发性硬化症在内的自身免疫性疾病。
【专利说明】
特异性拮抗c-Re I的s i RNA在治疗MS中的应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及特异性拮抗C-Re 1的s iRNA在治疗MS (多发性硬化症）中的应用。
【背景技术】
[0002] 由炎症引发的疾病广泛存在，例如多发性硬化疾病（简称MS)，其在世界范围内患 病率为每10万人中有30到80名患者，最高地区甚至高达每10万人中200名患者。世界一共有 大约250万患者，其中美国有大约40万的患者。近年来国内多发性硬化症患者显著增多，保 守估计至少有2万名患者。即便接受治疗，也会经历一个慢性的反复的病程，有可能导致残 疾、甚至有些病患因心情低落而自杀陨命。因此，这类疾病又被称为"不死的癌症"，是公众 因病致贫、因病返贫的重要原因，不仅给患者带来了沉重的经济负担，同时也会对经济发展 造成严重负担。
[0003] 理想的抗炎药物应至少满足两个基本条件：（1)可提供最强大的消除炎症的效果； (2)没有或很少的副作用，例如有害或不受欢迎的不良反应等。目前还没有能治愈多发性硬 化症的药物，只有6种注射型的改变病情的药被美国药监局批准治疗多发性硬化症。这些药 包括醋酸格拉替雷（glatiramer acetate(GA)((?〇paxonc.1f))，米托蒽醌（mitoxantrone (ΜIT 0) (Novantrone?).)，那他珠单抗（natalizumab (Tysabri?))和三种干扰（IFN) β 1 ( :Avon_ex?，、Rebif?^PBe；tasero_n?)。作为一线用药的干扰素和GA仅能改善症状；由于毒性的 考量，米托蒽醌(mitoxantrone)和那他珠单抗注射液(natalizumab)仅能选择性用于经常 复发和积累性残疾的病人。这些药物只能帮助降低复发的频率和损伤的程度，病人的病情 还会逐渐的复发和加重。由于用于治疗多发性硬化症药物广泛的副作用，它们的临床应用 价值受到限制，例如糖皮质激素只能在短时间内控制病人的急性炎症反应。有效的减少药 物副作用的方法是只针对引起疾病的分子靶标开发相应的药物。
[0004] 核转录因子Rel/NF-κΒ家族代表了一种有效的治疗炎症性疾病的靶标。因为Rel/ NF-kB家族因子直接控制很多炎症基因的表达，而这些炎症因子在由炎症引起的疾病(如自 身免疫疾病）的发病中起到很重要的作用。因此如果能够阻止Rel/NF-κΒ家族因子的表达将 会有效的控制炎症反应。目前上市的蛋白酶体抑制剂(如美国FDA批准的PS-341)对Rel/NF-κΒ有抑制作用。另外，目前应用临床较多的糖皮质激素，也是因为可以抑制Rel/NF-κΒ家族 的表达而有效地控制炎症反应。但是因为这些药物不仅抑制Rel/NF-κΒ家族因子，并且作用 于其他很多不相关的分子，特异性差，因此这些药的共同缺点是副作用大，只能短期使用， 控制急性由炎症引起的疾病，例如过敏症状等。于此同时，没有一种药能有效的治疗原发-进展型和继发-进展型的多发性硬化症。因此仍然需要开发出有效治疗由炎症引起的疾病， 特别是多发性硬化症的药物，尽可能地减少药物的副作用，保障用药的安全性。
【发明内容】
[0005] 本发明的主要目的在于寻找预防和/或治疗由炎症引起的疾病的药物的新的靶 点，并以其为靶标，开发出特异性针对该靶点的药物，以期望能有效预防和/或治疗由炎症 引起的疾病，特别是多发性硬化症，降低毒副作用，保障用药的安全。
[0006] 鉴于c-Rel在炎症反应中的重要作用以及由炎症引起的疾病(如自身免疫性多发 性硬化症)的病理过程，本发明仅以NF-κΒ家族成员c-Re 1为靶点，通过抑制
[0007] c-Rel/IL-23/IL-17A炎症轴来治疗由炎症引起的疾病，特别是包括多发性硬化症 等的自身免疫性疾病。因而，本发明提供针对c-Rel的拮抗剂在制备用于预防和/或治疗由 炎症引起的疾病的药物中的应用。本发明所述由炎症引起的疾病包括自身免疫性疾病或移 植排斥反应，特别地，所述自身免疫性疾病为多发性硬化症(简称MS，脑脊髓炎）。
[0008] 在本发明的一【具体实施方式】中，发明人在研究中发现，利用特异性拮抗c-Rel的 siRNA能够降低c-Rel的表达，从而使得小鼠脑和脊髓内浸润的炎性细胞明显减少。因而，在 本发明前述应用的一【具体实施方式】中，所述针对c-Rel的拮抗剂为降低c-Rel的表达水平的 试剂，优选地，所述试剂为siRNA。更优选地，所述siRNA包含经修饰或未经修饰的如SEQ ID N0:1、SEQIDN0:2所示的序列，该修饰是指SEQIDN0:1或SEQIDN0 :2中带U或C碱基的核 苷的2'位羟基各自独立地被甲氧基取代，优选SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2中带U或C碱基的 核苷中的2 '位羟基均被甲氧基取代。
[0009] 本发明SEQ ID N0:1、SEQ IDN0:2序列如下所示：
[0010] SEQ ID N0:1:CAACCGGACAUACCCGUCU。
[0011] SEQIDN0:2:AGACGGGUAUGUCCG⑶UG(SEQIDN0:1的反义序列）。
[0012] 作为本发明的一【具体实施方式】，前述siRNA序列为经修饰或未经修饰的如SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4所示的序列；该修饰是指SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4中带U或C碱基的核 苷中的2'位羟基各自独立地被甲氧基取代，优选SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中带U或C碱基 的核苷中的2 '位羟基均被甲氧基取代。
[0013] 本发明SEQ ID N0:3、SEQ IDN0:4序列如下所示：
[0014] SEQ ID N0:3:CAACCGGACAUACCCGUCUTT。
[0015] SEQ ID N0:4:AGACGGGUAUGUCCG⑶UGTT(SEQ ID N0:3的反义序列）。
[0016] 本发明对SEQ ID NO: 1~4所示的序列进行修饰的目的在于增强其稳定性。另一方 面，本发明还提供一种拮抗c-Rel的siRNA，该siRNA包含经修饰或未经修饰的如SEQ ID N0: 1、SEQ ID NO: 2所示的序列，该修饰是指SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2中带U或C碱基的核苷 的2'位羟基各自独立地被甲氧基取代，优选SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2中带U或C碱基的核 苷中的2 '位羟基均被甲氧基取代。
[0017] 作为本发明的一【具体实施方式】，前述siRNA序列为经修饰或未经修饰的如SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4所示的序列；该修饰是指SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4中带U或C碱基的核 苷中的2'位羟基各自独立地被甲氧基取代，优选SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中带U或C碱基 的核苷中的2 '位羟基均被甲氧基取代。
[0018] 本发明所述s iRNA可按本领域常规的技术制备得到。
[0019] 由于本发明所述siRNA仅以c-Rel为靶点，能够诘抗c-Rel的表达，从而具有以下明 显优点：（a)与其他靶向于整个NF-kB家族相比的药物相比，本发明所述siRNA仅以c-Re 1为 靶点，特异性好，使得副作用小；（b)通过本发明所述siRNA靶向c-Rel，能抑制下游一系列炎 性因子的表达，如11^-6、几1-0、1?^丫、几-12、几-23、11^17等，因而，与仅以了陬-€[、几-12、 IL-23、IL-17A等单一炎性因子为靶点的抗体或其他药物相比，本发明所述siDNA能更有力 切断例如先天性免疫与适应性免疫间的恶性炎症等的回路，作用效果强；（C)现有技术表明 c-Rel敲除小鼠发育正常，并能抵抗自身免疫病的发生，因此，本发明以c-Rel为靶点的所述 siRNA安全性高；（d)由于c-Rel广泛表达于活化的淋巴细胞和单核细胞，因而本发明所述以 c-Rel为靶点的siRNA可成为广谱抗炎药，能应用于预防和/或治疗多种由炎症引发的疾病， 例如自身免疫性疾病、移植排斥反应，特别地，所述自身免疫性疾病为多发性硬化症。因此， 本发明以c-Rel为靶点的siRNA能安全、有效地用于预防和/或治疗由炎症引发的疾病，特别 是多发性硬化症等自身免疫性疾病。
[0020] 另一方面，本发明提供一种拮抗C-Rel的药物组合物，所述组合物包含有效剂量的 本发明所述siRNA，以及药学上可接受的载体;优选地，所述药物组合物为包含有效剂量的 所述siRNA的纳米胶束。通过将本发明所述siRNA制备成纳米胶束，可提高siRNA的转染率， 避免或减少其在生物体内被酶降低，延长其半衰期。
[0021] 在本发明的一【具体实施方式】中，所述纳米胶束的载体为PEG-PLL-PLLeu三嵌段共 聚物。本发明所述PEG-PLL-PLLeu三嵌段共聚物为现有三嵌段共聚物（J. Deng，N. Gao， Y.ffang,H.Yi,S.Fang,Y.Ma,et al.,Self-assembled cationic micelles based on PEG-PLL-PLLeu hybrid polypeptides as highly effective gene vectors , Biomacromoleculesl3(2012)3795-3804.)，其制备过程亦可参照该文献。优选地，所述PEG-PLL-PLLeu三嵌段共聚物中PEG、PLL及PLLeu的摩尔比例为1:15~30:20~40;例如1:15: 20、 1:30:40、1:20:30、1:30:20或 1:20:20。
[0022] 优选地，所述三嵌段共聚物与所述siRNA的质量比为85~115:6~10。例如100yg的 PEG、PLL及PLLeu摩尔比为1:15: 20的前述三嵌段共聚物与8yg的所述siRNA进行混合，即可 得到所述药物组合物。采用所述PEG-PLL-PLLeu三嵌段共聚物胶束来携载本发明所述 siRNA，可将其转运至细胞质中。本发明所采用的这种三嵌段共聚物胶束生物可降解、转染 效率高，最重要的是，这种PEG-PLL-PLLeu三嵌段共聚物胶束主要富集于脾脏中并被其中树 突状细胞摄取。
[0023]再一方面，本发明提供所述的拮抗c-Rel的siRNA或所述的药物组合物在制备预防 和/或治疗由炎症引起的疾病的药物中的应用。优选地，所述由炎症引起的疾病包括自身免 疫性疾病或移植排斥反应。特别地，所述自身免疫性疾病为多发性硬化症。
[0024]综合而言，本发明开发了特异性拮抗c-Rel的siRNA，该siRNA可减少c-Rel的表达， 显著减少炎症细胞，使得本发明所述siRNA可预防和/或治疗由炎症引起的疾病，特别是包 括多发性硬化症在内的自身免疫性疾病。
【附图说明】
[0025]图1实施例1为纳米粒子携带s iRNA的体内摄取情况。
[0026] 图2实施例1siRNA的敲低效果验证实验结果。
[0027] 图3实施例1细胞质和细胞核裂解液分离检测c-Rel的表达实验结果图。
[0028] 图4实施例2脑(上行)和脊髓(下行)切片H&E染色图。
【具体实施方式】
[0029] 为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施 例及附图对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验 方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
[0030] 以下实施例中所采用的纳米粒子的载体均为PEG-PLL-PLLeu三嵌段共聚物，该共 聚物中PEG、PLL及PLLeu的摩尔比例为1:15:20。按现有技术制备得到（1.〇6叫，16 &〇， Y.Wang,H.Yi,S.Fang,Y.Ma,et al.,Self-assembled cationic micelles based on PEG-PLL-PLLeu hybrid polypeptides as highly effective gene vectors , Biomacromoleculesl3(2012)3795-3804.)〇
[0031] 实施例1体外验证实验
[0032] 本实施例首先合成cy5标记的c-Rel特异的双链siRNA(包含正义链SEQIDN0:3及 反义链SEQ ID N0:4，cy5标记在正义链5'端），该标记的序列如下所示：
[0033] cy5-CAACCGGACAUACC(XUCUTT(cy5-SEQ ID N0:3);
[0034] AGACGGGUAUGUCCGGUUGTT(SEQ ID NO:4)；
[0035] 将5μ1浓度为20μΜ的如上所得cy5标记的c-Rel特异的双链siRNA与浓度为lyg/μL 的20μ1纳米粒子(简称NPs)混合，室温静置20分钟，制备得到纳米粒子携带siRNA(纳米粒子 +siRNA)。向6孔板中接种5X10 5/孔个RAW264.7细胞，12小时后中分成四组，一组为未处理 组，另外三组分别加入单独纳米粒子、单独siRNA(前述cy5标记的c-Rel特异的双链siRNA) 和纳米粒子携带siRNA，体外摄取24小时后利用C6流式细胞仪检测摄取效率。本实施例结果 如图1中所示，从图1中可以看出纳米粒子携带的cy5-s iRNA能够较好的被细胞摄取。
[0036]以5 X105/孔的密度将Raw264.7细胞种于6孔板中，12小时后将细胞分为三组，一 组不做处理，另外两组分别加入制备好的纳米粒子+阴性对照siRNA(记为纳米粒子+NC，该 阴性对照siRNA是上海吉玛公司提供的通用阴性对照），纳米粒子+c-Rel siRNA(记为纳米 粒子+si RNA，该siRNA的正义链的序列为CAACCGGACAUACCC GUCUTT，反义链的序列为 AGACGGGUAUGUCCG⑶UGTT，且该正义链及反义链中的所有带U或C碱基的核苷中的2 '位羟基 被甲氧基取代，该siRNA由上海吉玛基因公司按常规方法合成），48小时后通过Western Blot检测c-Rel siRNA的敲低效果，其中微管蛋白作为内参蛋白定量样品上样品量。
[0037] Western Blot具体实验步骤如下所述：
[0038] a.收集蛋白样品；用RIPA裂解液裂解贴壁细胞，然后4°C，13，000g离心15min.取上 清液作为样品。
[0039] b.电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。
[0040] c.转膜：电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min X 3次。（转膜 条件:300mA恒流;0 · 22um孔径PVDF膜，转膜时间75min。
[0041 ] 封闭:将膜完全浸没封闭液中室温轻摇60min。）
[0042] d.一抗孵育（c-Rel购自santa cruz)，核纤维蛋白抗体A/C购自santa cruz，微管 蛋白抗体购自abmart):用TBST稀释一抗，室温孵育1 Omin，放4°C过夜。第二天从4°C拿出膜， 在室温孵育30min。
[0043] 洗膜:TBST洗膜5次，每次1 Omin。
[0044] e.二抗孵育：用5 %脱脂奶粉-TBST稀释二抗（山羊抗兔I gG (H+L) HRP或山羊抗小鼠 IgG(H+L)HRP) 1:5000，室温轻摇 40min。洗膜:TBST洗膜6 次，每次 3min。
[0045] f.曝光:ECL(Thermo)加到膜上后反应2min，胶片曝光：10s-5min(曝光时间随不同 光强度而调整），显影2min，定影。晾片，扫描等后续分析。
[0046] 所得结果如图2所示，图2显示在RAW264.7细胞系中针对c-Rel的siRNA (简称 siRel)可显著降低c-Rel的表达量。
[0047]同时，本实施例采用试剂盒（碧云天的分离试剂，货号为P0028)分离上述已摄取 Cy5-siRNA的RAW264.7细胞的细胞质与细胞核，具体步骤参照试剂盒说明书进行，分离后的 蛋白组分通过Western Blot进行检测，其中微管蛋白作为细胞质组分的内参，核纤维蛋白 A/C作为细胞核组分的内参。
[0048] Western Blot具体实验步骤如前所述。
[0049] 所得结果如图3所示，从图3中可以看出细胞核内和细胞质内的c-Rel表达量都有 所降低。
[0050] 实施例2体内验证实验
[0051] 本实施例通过构建小鼠 EAE模型来进行体内治疗效果的评估。具体地步骤如下所 述：
[0052] a.动物准备:研究中用到的小鼠饲养和实验操作全部按照国家有关标准进行，所 有的外科操作都在无菌条件下进行；
[0053] b ·尾静脉注射PT( 100ng/200yl/只）；
[0054] c.小动物麻醉(腹腔注射戊巴比妥钠50mg/kg);
[0055] d.皮下注射M0G短肽（300yg/200ul/只）：背部皮下注射0.2mlM0G乳化液，分成2个 点注射（下背部左右各一个点），每个点〇 . lml。0.2mlM0G乳化液的成分为：0 . lmlMOG溶液 (0·15mg/ml)+0.lmlCFA(含4mg/ml M.tuberculosis);
[0056] e.尾静脉注射PT:皮下注射48小时之后，再次注射PT;
[0057] f.腹腔注射给药:将小鼠分为四组，未建模组不做处理，建模组一组作为对照，一 组注射纳米粒子携带阴性对照siRNA(记为EAE(纳米粒子+NC)，该阴性对照siRNA为上海吉 玛公司提供的通用阴性对照siRNA)，还有一组注射纳米粒子携带c-Rel siRNA组(记为EAE (纳米粒子+siRNA)，该siRNA的正义链的序列为CAACCGGACAUACCCGUCUTT，反义链的序列为 AGACGGGUAUGUCCG⑶UGTT，且该正义链及反义链中的所有带U或C碱基的核苷中的2 '位羟基 被甲氧基取代，该siRNA由上海吉玛基因公司按常规方法合成），从建模第4天开始隔天给 药，第15天将老鼠处死进行实验；
[0058]对步骤f中的脑和脊髓组织切片进行常规的H&E染色，染色结果如图4所示，图4中 上一行是脑组织切片，下一行是脊髓组织切片，从图4中可以看出治疗组小鼠脑和脊髓内浸 润的炎性细胞明显减少。
[0059]最后说明的是：以上实施例仅用于说明本发明的实施过程和特点，而非限制本发 明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应 当理解:依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何 修改或局部替换，均应涵盖在本发明的保护范围当中。
【主权项】
1. 针对C-Rel的拮抗剂在制备用于预防和/或治疗由炎症引起的疾病的药物中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其中，所述由炎症引起的疾病包括自身免疫性疾病或移 植排斥反应，优选地，所述自身免疫性疾病为多发性硬化症。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述针对c-Rel的拮抗剂为降低c-Rel表达水 平的试剂，优选地，所述试剂为siRNA。4. 根据权利要求3所述的应用，其中，所述siRNA包含经修饰或未经修饰的如SEQ ID N0:1、SEQIDN0:2所示的序列，该修饰是指SEQIDN0:1或SEQIDN0 :2中带U或C碱基的核 苷的2'位羟基各自独立地被甲氧基取代，优选SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2中带U或C碱基的 核苷中的2 '位羟基均被甲氧基取代； 优选地，所述siRNA序列为经修饰或未经修饰的如SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4所示的序 列；该修饰是指SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中带U或C碱基的核苷中的2'位羟基各自独立地 被甲氧基取代，优选SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4中带U或C碱基的核苷中的2'位羟基均被甲 氧基取代。5. -种拮抗c-Rel的siRNA，该siRNA包含经修饰或未经修饰的如SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2所示的序列，该修饰是指SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2中带U或C碱基的核苷的2'位羟基 各自独立地被甲氧基取代;优选SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2中带U或C碱基的核苷中的2'位 羟基均被甲氧基取代； 优选地，所述siRNA序列为经修饰或未经修饰的如SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4所示的序 列，该修饰是指SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中带U或C碱基的核苷中的2'位羟基各自独立地 被甲氧基取代，优选地，SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4中带U或C碱基的核苷中的2'位羟基均 被甲氧基取代。6. -种拮抗c-Rel的药物组合物，所述组合物包含有效剂量的权利要求5所述的拮抗c-Rel的siRNA，以及药学上可接受的载体;优选地，所述药物组合物为包含有效剂量的所述 siRNA的纳米胶束。7. 根据权利要求6所述的拮抗c-Rel的药物组合物，其中，所述纳米胶束的载体为PEG-PLL-PLLeu三嵌段共聚物；优选地，所述PEG-PLL-PLLeu三嵌段共聚物中PEG、PLL及PLLeu的 摩尔比例为 1:15 ~30:20 ~40;例如 1:15:20、1:30:40、1:20:30、1:30:20或 1:20:20。8. 根据权利要求7所述的药物组合物，其中，所述三嵌段共聚物与所述siRNA的质量比 为85~115:6~10。9. 权利要求5所述的拮抗c-Re 1的s i RNA或权利要求6~8中任一项所述的药物组合物在 制备预防和/或治疗由炎症引起的疾病的药物中的应用。10. 根据权利要求9所述的应用，其中，所述由炎症引起的疾病包括自身免疫性疾病或 移植排斥反应，优选地，所述自身免疫性疾病为多发性硬化症。
【文档编号】C12N15/113GK106086021SQ201610405099
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】万晓春, 阮庆国, 张宏玲, 毕嘉成, 蔡林涛, 陈有海
【申请人】深圳先进技术研究院