uc002ddj.1及其体外检测的试剂、制剂或试剂盒、应用、检测方法
【专利摘要】本发明涉及生物工程心肌梗死相关基因技术领域，是一种lncRNA uc002ddj.1及其体外检测的试剂、制剂或试剂盒、应用、检测方法，该长链非编码RNA uc002ddj.1，核酸序列如SEQ ID No：1所示。本发明所述的长链非编码RNA uc002ddj.1能够为急性心肌梗死的早期诊断和及预后监测提供新的血液生物标志物和治疗靶点，进一步丰富了急性心肌梗死发病机制的研究。
【专利说明】
uc002dd_j. 1及其体外检测的试剂、制剂或试剂盒、应用、检测 方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物工程心肌梗死相关基因技术领域，是一种uc002ddj.l及其体外检 测的试剂、制剂或试剂盒、应用、检测方法即IncRNA uc002ddj.l及其体外检测的试剂、制剂 或试剂盒、应用、检测方法。
【背景技术】
[0002] 急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)是一种严重威胁人类健康的 心血管疾病，其发病率及死亡率近年来一直处于显著的上升趋势，严重威胁人们的生命及 生活质量。我国每年新发至少50万，现患至少200万。急性心肌梗死(AMI)是由于持续的严重 缺血导致的心肌组织急性坏死，早期诊断可以提高心肌梗死患者的生存率并能够改善长期 预后。目前肌钙蛋白I(cTnl)是在临床广泛使用的诊断急性心肌梗死的生物学标志物，但血 浆cTnl浓度可能在某些心脏和非心脏疾病，如严重的心力衰竭、心房颤动、慢性肾脏病、严 重败血症和感染性休克等情况下出现假性升高现象。因此，寻找能够早期诊断AMI并有较高 敏感性及特异性的新的生物标志物显得尤为必要。
[0003] 长链非编码RNA(long non-coding RNAs，IncRNA)是一类转录本长度超过200nt的 RNA分子，一般不编码蛋白，由RNA聚合酶II转录并经可变剪切形成，转录水平低于蛋白质编 码基因，曾一度被认为是基因组转录的"噪音"。已证实，IncRNA在表观遗传学、转录调控和 转录后调控等多种层面调控基因表达，在多种生物学进程中发挥重要作用，包括脂肪代谢、 动脉粥样硬化形成、胚胎发育及肿瘤的发生等，其表达或功能异常与人类心血管疾病的发 生和发展密切相关。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种IncRNA uc002ddj.l及其体外检测的试剂、制剂或试剂盒、应 用、检测方法，本发明所述的长链非编码RNA uc002ddj.l能够为急性心肌梗死的早期诊断 和及预后监测提供新的血液生物标志物和治疗靶点，进一步丰富了急性心肌梗死发病机制 的研究。
[0005] 本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种长链非编码RNA uc002ddj.l，该基因的核酸序列如SEQ ID No:l所示。
[0006] 下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：
[0007] 上述该急性心肌梗死相关基因为长链非编码RNA uc002ddj.l的全长。
[0008]本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种体外检测长链非编码RNA uc002ddj.l的试剂，包括用于扩增长链非编码RNA uc002ddj.l的特异性引物对，特异性引 物对包括上游引物和下游引物，上游引物的序列如SEQ ID N〇:2所示，下游引物的序列如 SEQIDNo:3**。
[0009]本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种体外检测长链非编码RNA uc002ddj . 1的试剂盒，包括用于扩增长链非编码RNA uc002ddj . 1的特异性引物对、标准DNA 模板和PCR反应液，特异性引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的序列如SEQ ID No: 2所示，下游引物的序列如SEQ ID N〇:3所示。
[0010] 下面是对上述发明技术方案之三的进一步优化或/和改进：
[0011] 上述PCR反应液为荧光定量PCR反应液。
[0012] 上述荧光定量PCR反应液包括脱氧核糖核苷三磷酸、镁离子、Taq酶和荧光染料。 [0013]本发明的技术方案之四是通过以下措施来实现的：一种体外检测长链非编码RNA uc002ddj . 1的试剂作为制备体外检测急性心肌梗死相关基因的制剂或试剂盒中的应用。
[0014] 本发明的技术方案之五是通过以下措施来实现的：一种检测长链非编码RNA uc002dd j . 1的方法，其特征在于按下述步骤进行:第一步，提取血液总RNA;第二步，将第一 步得到的总RNA反转录成cRNA;第三步，以cRNA为模板进行扩增。
[0015] 本发明的技术方案之六是通过以下措施来实现的：一种长链非编码RNA uc002ddj . 1在制备用于检测急性心肌梗死的试剂盒或用作检测急性心肌梗死药物的新靶 点的应用。
[0016] 本发明所述的长链非编码RNA uc002ddj.l能够为急性心肌梗死的早期诊断和及 预后监测提供新的血液生物标志物和治疗靶点，进一步丰富了急性心肌梗死发病机制的研 究，同时，本发明所述的体外检测长链非编码RNA uc002dd j . 1的试剂以及本发明所述的体 外检测长链非编码RNA uc002ddj.l的试剂盒能够用于本发明所述的长链非编码RNA uc002ddj.l的表达水平的检测，通过本发明所述的长链非编码RNA uc002ddj.l的表达水平 的检测结果获知急性心肌梗死的筛查结果，为急性心肌梗死的诊断和治疗提供了新方向。
【附图说明】
[0017] 附图1为本发明中长链非编码RNA表达谱芯片检测长链非编码RNA uc002ddj.l在 健康对照组与急性心肌梗死组中的检测信号值。
[0018] 附图2为本发明中针对长链非编码RNA uc002ddj . 1的序列设计的一对特异性引物 PCR扩增后行琼脂糖凝胶电泳测试引物的效果。
[0019] 图3为本发明中qRT-PCR检测长链非编码RNA uc002ddj . 1在健康对照组与急性心 肌梗死组中的相对表达量。
【具体实施方式】
[0020] 本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体 的实施方式。
[0021] 下面结合实施例对本发明作进一步描述：
[0022] 实施例1:一种长链非编码RNA uc002ddj.l，该基因的核酸序列如SEQ ID No:l所 示。本实施例所述的长链非编码RNA uc002ddj . 1 (lncRNA uc002ddj . 1)的转录区域位于16 号染色体，起始位置为15，226，577-15，229，270，全长2694bp。本实施例所述的长链非编码 RNA uc002ddj . 1能够为急性心肌梗死的早期诊断和及预后监测提供新的血液生物标志物 和治疗靶点，进一步丰富了急性心肌梗死发病机制的研究。
[0023] 实施例2:作为上述实施例的优化，该急性心肌梗死相关基因为长链非编码RNA uc002ddj . 1的全长。
[0024] 实施例3:-种体外检测长链非编码RNA uc002ddj. 1的试剂，包括用于扩增长链非 编码RNA uc002ddj.l的特异性引物对，特异性引物对包括上游引物和下游引物，上游引物 的序列如SEQ ID No:2所示，下游引物的序列如SEQ ID No:3所示。结合本实施例的体外检 测长链非编码RNA uc002ddj . 1的试剂以及现有公知技术中的DNA模板以及PCR反应液可以 获得本发明所述的IncRNA uc002ddj . 1的表达水平，通过本发明所述的IncRNA uc002ddj . 1 的表达水平可以进行急性心肌梗死的筛查。本实施例所述的特异性引物对适用于SYBR Green、Taqman探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测。
[0025]实施例4: 一种体外检测长链非编码RNA uc002ddj . 1的试剂盒，包括用于扩增长链 非编码RNA uc002ddj . 1的特异性引物对、标准DNA模板和PCR反应液，特异性引物对包括上 游引物和下游引物，上游引物的序列如SEQ ID N〇:2所示，下游引物的序列如SEQ ID N〇:3 所示。本实施例所述的体外检测长链非编码RNA uc002ddj.l的试剂盒可以获得本发明所述 的IncRNA uc002dd j . 1的表达水平，通过本发明所述的IncRNA uc002dd j . 1的表达水平可以 进行急性心肌梗死的筛查。
[0026] 实施例5:作为实施例4的优化，PCR反应液为荧光定量PCR反应液。荧光定量PCR反 应液为现有公知技术。
[0027]实施例6:作为实施例4和实施例5的优化，荧光定量PCR反应液包括dNTP(脱氧核糖 核苷三磷酸）、镁离子、Taq酶和荧光染料。本实施例所述的体外检测长链非编码RNA uc002ddj . 1的试剂盒适合于目前市售的所有类型荧光定量基因扩增仪，具有灵敏度高和特 异性好的特点，具有良好的应用前景。
[0028]实施例7 :-种体外检测长链非编码RNA uc002ddj . 1的试剂作为制备体外检测急 性心肌梗死相关基因的制剂或试剂盒中的应用。
[0029]实施例8:-种检测长链非编码RNA uc002ddj. 1的方法，其特征在于按下述步骤进 行:第一步，提取血液总RNA;第二步，将第一步得到的总RNA反转录成cRNA;第三步，以cRNA 为模板进行扩增。
[0030] 实施例9: 一种长链非编码RNA uc002ddj . 1在制备用于检测急性心肌梗死的试剂 盒或用作检测急性心肌梗死药物的新靶点的应用。
[0031 ]实施例10:急性心肌梗死患者与健康人的血液中的IncRNA芯片的表达分析：
[0032] 一 ·材料
[0033] 血液样本来自于急性心肌梗死患者与健康人的血液样本，分别为急性心肌梗死组 与健康对照组，血液样本各3个。
[0034] 二·方法
[0035] 1.急性心肌梗死患者与健康人的血液样本的总RNA的提取:按照博奥生物技术有 限公司提供的"用于基因芯片分析的血液样品的准备步骤"提取急性心肌梗死患者与健康 人的血液样本的总RNA，具体实验材料包括:淋巴细胞分离液(天津TBD生物技术发展中心）、 灭菌生理盐水(普通0.9%生理盐水灭菌即可）、1'1^2〇1试剂（1]1￥；[1：1'08611公司）。
[0036] 2.1^flnCRNA+mRNA表达谱芯片检测以待检测样品（急性心肌梗死患者与健康人 的血液样本)的总RNA为起始，进行体外扩增和荧光标记，标记过程采用晶芯?生物芯片通用 标记试剂盒。主要包括如下步骤：
[0037] (1)反转录合成第一链cDNA:以Total RNA(总RNA)起始，含有T7启动子序列的 T701igo(dT)Primer和Τ7-随机引物，既可以结合带poly(A)的mRNA，也可以结合除rRNA以外 其它不带p〇ly(A)的RNA，使用第一链Enzyme Mix合成第一链cDNA;
[0038] (2)合成第二链DNA:用第二链Enzyme Mix将DNA-RNA杂合体中的RNA链转化为第二 链cDNA，合成双链DNA;
[0039] (3)体外转录合成cRNA:以第二链cDNA为模板，利用T7Enzyme Mix合成cRNA;
[0040] (4)cRNA纯化:使用RNA纯化柱纯化cRNA，除去反应中的盐、酶等试剂，并对cRNA进 行定量、质控；
[0041 ] (5)反转录：以cRNA为模板，Random Primer为引物，CbcScript Π 酶进行反转录，纯 化回收反转录得到的cDNA并定量；
[0042] ( 6 )标记：以反转录的cDNA产物为模板，Random Primer为引物，用K1 enow Fragment酶合成cDNA互补链并掺入带有荧光基团的dNTP(Cy3-dCTP、Cy5-dCTP)，纯化并定 量标记产物，带有荧光基团DNA即可用于芯片杂交；
[0043] (7)芯片杂交及清洗：取lyL cDNA溶于杂交液，45°C杂交过夜，取出芯片在博奥 SIide Washer8芯片洗干仪进行清洗，清洗程序如下:洗液1:0.2% SDS，2 X SSC，42°C 120S清 洗2遍，洗液II:0.2%SDS，2 X SSC，42°C80S清洗3遍，清洗程序完成后，离心甩干，待扫描； [0044] (8)芯片扫描，数据分析，差异基因筛选:使用Agi lent芯片扫描仪(G2565CA)对清 洗后的芯片进行扫描，得到杂交图片，使用Agilent Feature Extraction!；vlO.7)软件对杂 交图片进行分析并提取数据，然后使用Agilent GeneSpring软件对数据进行归一化和差异 分析，并用GeneSpring GX软件进行差异基因筛选。本发明中长链非编码RNA表达谱芯片检 测长链非编码RNA uc002ddj.l在健康对照组与急性心肌梗死组中的检测信号值如图1所 不。
[0045]三、结果
[0046]通过图1可以看出，有多条表达上调和表达下调的IncRNAs，其中，相对于健康人的 血液中的本发明所述的IncRNA uc002dd j . 1的表达水平而言，本发明所述的IncRNA uc002ddj.l显示出在急性心肌梗死患者的血液中的表达显著下调，其Fc值为健康人的Fc值 的2.511倍，鉴于其可能在急性心肌梗死患者中存在特异性表达，本发明通过实施例11采用 与实施例10相同的血液样本进行指标的重复验证。
[0047] 实施例11 :qRT_PCR重复验证本发明所述的IncRNA uc002ddj . 1在急性心肌梗死患 者和健康人的血液中的差异表达：
[0048] 一、实验材料
[0049] 选取与实施例10相同的血液样本，对本发明所述的IncRNA uc002ddj.l的表达差 异进彳TqRT-PCR验证。
[0050] 二、实验方法和结果
[0051 ] 1.引物特异性鉴定
[0052] (1)特异性引物的设计:从UCSC数据库提取本发明所述的IncRNA uc002ddj. 1相关 的转录本序列，并用根据转录本的序列通过NCBI的引物设计工具(Primer BLAST)设计引 物，设计后的引物序列如下：
[0053] 上游引物：如SEQ ID No:2所示，
[0054] 下游引物：如SEQ ID No:3所示；
[0055] (2)将急性心肌梗死患者与健康人的血液按照ABI公司的Trizol试剂(货号15596-026)所需试剂及步骤提取总RNA，再用7300real time PCR system核酸定量仪(Applied Biosystems AB)定量所提取的的纯度和浓度，采用北京天根生化科技公司FastQuant cDNA 第一链合成试剂盒(货号KR106)对提取的总RNA反转录合成cDNA，总RNA反转录合成cDNA按 下述步骤进行：
[0056] 第一步，将模板RNA(总RNA)在冰上解冻；5XgDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10 XFast RT Buffer和RNase-Free ddH20在室温（15-25°C)解冻，解冻后迅速置于冰上，使用 前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体；
[0057] 第二步，打开二级结构，反应体系及条件如表1所示，将表1中的基因组DNA的去除 体系配制混合液，彻底混匀，简短离心，并置于42°C的温度下孵育3min，然后置于冰上放置；
[0058] 第三步，反转录反应，反应体系及条件如表2所示，将反转录反应中的RT Enzyme Mix和FQ-RT Primer Mix加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀，42°C的温度下孵育 15min，95°C的温度下孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA;
[0059] (3)扩增本发明所述的IncRNA uc002ddj · 1:米用ABI公司的Power SYBR Green PCR Master Mix荧光定量试剂盒(货号4367659)，以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR 扩增，荧光定量PCR体系如表3所示，焚光定量PCR程序:第一步95°C 10分钟;第2步，95°C 15S， 60 °C 1分钟；第三步，95 °C 15S，60 °C 1分钟，95 °C 15S，共40个循环。将扩增后的本发明所述的 IncRNA uc002ddj.l进行电泳检测(0120000Marker (北京康为世纪生物科技有限公司，货号 CW0632))，本发明中针对长链非编码RNA uc002ddj . 1的序列设计的一对特异性引物PCR扩 增后行琼脂糖凝胶电泳测试引物的效果如图2所示。
[0060] 通过图2可以看出，扩增片段大小与预期相同，本发明所述的IncRNA uc002ddj.l 的扩增产物只有一个条带，说明本实施例采用的设计引物对与本发明所述的特异性引物对 相符，上游引物的核酸序列见序列表SEQ ID N〇:2,下游引物的核酸序列见序列表SEQ ID No ： 3〇
[0061] 2.标准DNA模板的制备
[0062] 根据本发明所述的IncRNA uc002ddj.l碱基序列（其核酸序列如序列表SEQ ID No: 1所示），委托上海生工合成。
[0063]取样2ul合成产物，连接到Puc-T TA克隆载体(北京康为世纪生物科技有限公司， 货号CW0801)，随后转化到DH5a感受态细胞中，通过序列为SEQIDNo:2和SEQIDNo:3的特 异性引物筛选阳性克隆，提取质粒DNA，质粒DNA用7300real time PCR system核酸定量仪 定量，并做1 〇倍系列稀释作为标准曲线（标准DNA模板浓度范围在102拷贝/ul至106拷贝/ ul) 〇
[0064] 3.敏感性实验
[0065] 将标准DNA模板质粒按比例稀释为102拷贝/ul、103拷贝/ul、104拷贝/ul、105拷 贝/ul、106拷贝/ul，进行荧光定量PCR检测灵敏度，最低检出浓度为102拷贝/ul。
[0066] 4.合成cRNA模板
[0067] 取上述急性心肌梗死和健康人的总RNA各3个，采用北京天根生化科技公司 FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(货号KR 106)对提取的总RNA反转录合成cDNA，总RNA反 转录合成cDNA按下述步骤进行：第一步，将模板RNA在冰上解冻；5 X gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10XFast RT Buffer、RNase-Free ddH20在室温（15°C至25°C)解冻，解冻后迅 速置于冰上，使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体;第二 步，打开二级结构，反应体系及条件如表4所示，将表4中的基因组DNA的去除体系配制混合 液，彻底混匀，简短离心，并置于42°C下孵育3min，然后置于冰上放置；
[0068]第三步，反转录反应，反应体系及条件如表5所示，将反转录反应中的RT Enzyme Mix和FQ-RT Primer Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。42°C，孵育15min。95 。(：，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA;
[0069] 5.荧光定量PCR检测本发明所述的IncRNA uc002ddj.l
[0070] 米用ABI公司的Power SYBR Green PCR Master Mix焚光定量试剂盒（货号 4367659)，以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增；荧光定量PCR体系如表6所示，荧 光定量PCR程序:第一步，95 °C 10分钟;第二步，95 °C 15S，60 °C 1分钟;第三步，95 °C 15S，60 °C 1 分钟，95°C 15S，共40个循环。qRT-PCR检测长链非编码RNA uc002dd j . 1在健康对照组与急性 心肌梗死组中的相对表达量如图3所示。
[0071] 根据qRT-PCR的相对定量公式:2^Aet(表达水平比率），分别计算出本发明所述的 IncRNA uc002ddj.l在急性心肌梗死患者(AMI)和健康人(Contral)中的表达水平，计算结 果显示，急性心肌梗死患者(AMI)与健康人(Contral)的本发明所述的IncRNA uc002ddj . 1 表达水平进行比较，2-^。*值分别为0.2633、0.2121、0.2863,其平均值为0.2539。计算结果 说明，本发明所述的IncRNA uc002ddj . 1在急性心肌梗死患者的血液中普遍低表达，这与实 施例10所述的IncRNA芯片表达分析结果中的本发明所述的IncRNA uc002ddj.l下调2.511 倍的结果相一致。通过图3可以看出，P<0.5,说明结果具有统计学意义。由此说明本发明所 述的IncRNA uc002ddj . 1可以作为急性心肌梗死诊断的新的血液生物标志物，便于急性心 肌梗死的筛查。
[0072]综上所述，本发明所述的长链非编码RNA uc002ddj.l能够为急性心肌梗死的早期 诊断和及预后监测提供新的血液生物标志物和治疗靶点，进一步丰富了急性心肌梗死发病 机制的研究，同时，本发明所述的体外检测长链非编码RNA uc002ddj.l的试剂以及本发明 所述的体外检测长链非编码RNA uc002ddj . 1的试剂盒能够用于本发明所述的长链非编码 RNA uc002ddj.l的表达水平的检测，通过本发明所述的长链非编码RNA uc002ddj.l的表达 水平的检测结果获知急性心肌梗死的筛查结果，为急性心肌梗死的诊断和治疗提供了新方 向。
[0073] 以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据 实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。
[0074] 表 1
[0075]
[0076] 表 2
[0077]
[0078] 表 3
[0079]
[0080] 表 4
[0081]
[0082] 表 5
[0083]
[0084] 表 6
[0085]
【主权项】
1. 一种长链非编码RNAuc002ddj.l，其特征在于该基因的核酸序列如SEQIDNo:l所 不。2. 根据权利要求1所述的长链非编码RNA uc002dd j . 1，其特征在于该急性心肌梗死相 关基因为长链非编码RNA uc002ddj.l的全长。3. -种体外检测根据权利要求1或2所述的长链非编码RNA uc002dd j . 1的试剂，其特征 在于包括用于扩增长链非编码RNA uc002ddj . 1的特异性引物对，特异性引物对包括上游引 物和下游引物，上游引物的序列如SEQ ID N〇:2所示，下游引物的序列如SEQ ID N〇:3所示。4. 一种有根据权利要求3所述的体外检测长链非编码RNA uc002ddj.l的试剂的试剂 盒，其特征在于包括用于扩增长链非编码RNA uc002dd j . 1的特异性引物对、标准DNA模板和 PCR反应液，特异性引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的序列如SEQ ID No: 2所示， 下游引物的序列如SEQ ID No:3所不。5. 根据权利要求4所述的体外检测长链非编码RNA uc002ddj . 1的试剂盒，其特征在于 PCR反应液为荧光定量PCR反应液。6. 根据权利要求5所述的体外检测长链非编码RNA uc002ddj . 1的试剂盒，其特征在于 荧光定量PCR反应液包括脱氧核糖核苷三磷酸、镁离子、Taq酶和荧光染料。7. -种根据权利要求3所述的体外检测长链非编码RNA uc002ddj.l的试剂作为制备体 外检测急性心肌梗死相关基因的制剂或试剂盒中的应用。8. -种检测根据权利要求1或2所述的长链非编码RNA uc002dd j . 1的方法，其特征在于 按下述步骤进行:第一步，提取血液总RNA;第二步，将第一步得到的总RNA反转录成cRNA;第 三步，以cRNA为模板进行扩增。9. 一种根据权利要求1或2所述的长链非编码RNA uc002ddj . 1在制备用于检测急性心 肌梗死的试剂盒或用作检测急性心肌梗死药物的新靶点的应用。
【文档编号】C12N15/113GK106086019SQ201610306213
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】杨毅宁, 翟慧, 马依彤, 李晓梅, 刘芬, 陈邦党, 谢翔, 罗俊, 罗俊一, 赵强
【申请人】新疆医科大学第附属医院, 新疆医科大学第一附属医院