日本短体线虫的pcr检测试剂及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了日本短体线虫的PCR检测试剂及试剂盒，包括一对特异性引物，上游引物的核苷酸序列：GGCAACGGGCCTAGTTATGA，下游引物的核苷酸序列：GACTCGCGCACACGATAAAC。该特异性引物对苹果根结线虫特异、灵敏，扩增的特异性片段大小为176bp，对其它短体线虫无特异性条带片段；应用本发明的特异性引物及试剂盒，可在4小时内完成测试，灵敏度高，实用性强。
【专利说明】日本短体线虫的PCR检测试剂及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及短体属线虫的检测技术，具体涉及日本短体线虫的PCR检测试剂及试剂盒。
【背景技术】
[0002]短体属线虫(Pratylenchus Filipjev, 1936)为植物根系专性内寄生线虫,是植物病原线虫中种类最多、分布最广、为害最严重的类群之一，具有十分重要的经济意义。我国于2007年将短体线虫(非中国种)列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，在口岸实施严格检疫，以保护我国农业和生态安全。日本短体线虫Pratylenchus japonicusRyss, 1988为宁波口岸首次从来自日本的鸡爪槭中截获。国内尚无分布，为非中国种，是我国进境植物检疫性有害生物。日本短体线虫在1963年首次由日本的Gotoh和Ohshima提到，当时只鉴定到短体属，1974年Gotoh又将这个种归于穿孔属，1982年Minagawa将该种鉴定为大针短体线虫Pratylenchus macrostylus Wu, 1971。1988年,俄罗斯学者Ryss将在日本发现的该种线虫与加拿大发现的大针短体线虫进行区分，把它描述为新的亚种P.macrostylus japonicus, Ryss, 1988。直到 1997 年，日本的 Mizukubo 等根据形态学特征、测计值及分子生物学特征，将其与大针短体线虫区分开来，并将其从亚种提升到种，命名为日本短体线虫。日本短体线虫仅发现于日本，我国尚未有相关报道。其寄主包括栎属的扁果麻栎、槲树、抱栎以及苹果、枇杷、矮樱桃等几种果树，可以对寄主造成侵染，影响寄主植物的生长。
[0003]我国口岸出入境 检疫实验室或其他相关部门，都面临着对短体线虫进行快速、准确的鉴定这一难题。近年来，虽然在形态学鉴定的基础上，PCR - RFLP、荧光PCR、特异性PCR、序列测定、LAMP技术等已在线虫鉴定上广泛应用，但在短体线虫上应用很少。目前还未
【公开日】本短体线虫的分子生物学方面的检测报道。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、特异、准确的日本短体线虫的PCR检测试剂及试剂盒。
[0005]本发明系选择参考GenBank中日本短体线虫的核糖体28S基因(InternalTranscribed Spacer),使用 Primer Explorer V4 (http://primerexplorer.jp)设计了特异性引物，经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，并经过大量实际样品的检测应用评估(以日本短体线虫的DNA为模板，穿刺短体线虫、咖啡短体线虫、伤残短体线虫、卢斯短体线虫为阴性对照，水为空白对照，利用引物进行PCR检测。通过观察扩增产物的保守性和特异性，筛选最适引物)，筛选得到扩增效率和特异性好的一对特异性引物。引物均由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。
[0006]本发明的日本短体线虫的PCR检测试剂，包括一对特异性引物，所述一对特异性引物的核苷酸序列分别为:[0007]上游引物:5’-GGCAACGGGC CTAGTTATGA-3’
[0008]下游引物:5’ -GACTCGCGCA CACGATAAAC-3 ’。
[0009]日本短体线虫的PCR检测试剂盒，由无Mg2+的10XPCR缓冲液，浓度为25mM的MgCl2溶液，浓度为0.1mM的dNTP溶液，浓度5U/ y L的Taq酶溶液，浓度都为IOyM的上游引物溶液和下游引物溶液组成。
[0010]与现有技术相比，本发明的优点是日本短体线虫的PCR检测试剂及试剂盒，包括一对特异性引物，上游引物的核苷酸序列:GGCAACGGGC CTAGTTATGA，下游引物的核苷酸序列:GACTCGCGCA CACGATAAAC。该特异性引物对日本短体线虫特异、灵敏，扩增的特异性片段大小为176bp，对其它短体线虫无特异性条带片段；应用本发明的特异性引物及试剂盒，可在4小时内完成检测，灵敏度高，实用性强。
【具体实施方式】
[0011]以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0012]实施例1、日本短体线虫的PCR检测试剂盒
[0013]100次或200次反应体系，50 ii L反应体系包括:无Mg2+的10 X PCR缓冲液5.0 y L，浓度为25mM的MgCl2溶液5.0 y L，浓度为0.1mM的dNTP溶液4.0 y L，浓度5U/ y L的Taq酶溶液0.6 ii L，浓度都为10 ii M的上游引物溶液和下游引物溶液各3.0 ii L。Taq酶液，dNTP液购于宝生物工程(大连)有限公司，其中上游引物溶液含有核苷酸序列为GGCAACGGGCCTAGTTATGA的引物，下游引物溶 液含有核苷酸序列为GACTCGCGCACACGATAAAC弓丨物。
[0014]实施例2、DNA提取方法
[0015]挑取单条线虫放入200 u L PCR管中[已加有10 ii L双蒸水和5 u LlO XPCR缓冲液(无Mg2+)]，液氮中放置Imin (或-70度放置0.5h)以上，取出后立即85°C加热2min。然后向PCR管中加入liiLlmg/mL蛋白酶K，56°C加热30min以上，95°C加热lOmin，得到DNA模板。
[0016]实施例3、PCR检测方法
[0017]用日本短体线虫的PCR检测试剂盒进行检测，PCR反应体系为:无Mg2+的IOXPCR缓冲液5.0uL,浓度为25mM的MgCl2溶液5.0 u L,浓度为0.1mM的dNTP溶液4.0 u L,浓度5U/ ii L的Taq酶溶液0.6 y L，浓度都为10 y M的上游引物溶液和下游引物溶液各3.0 y L，DNA 模板 1.0 ~5.0 ii L，ddH20 补齐 50 u L0 PCR 反应条件:94°C预变性 3min ;94°C变性 30S,55°C退火30S，72°C延伸30S，共35个循环；最后一个循环结束后，72°C延伸6min。电泳:将5uL PCR产物用1.0% (重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经DNA染料染色后于紫外凝胶成像系统下显像，出现特异性片段大小为176bp，则为日本短体线虫。
[0018]实施例4、日本短体线虫的特异性和敏感性试验
[0019]用实施例2的提取方法，实施例3的PCR检测方法，分别对日本短体线虫(采自日本进口的鸡爪槭)、卢斯短体线虫(采自日本进口的山茶)、咖啡短体线虫(采自宁波的大豆)、伤残短体线虫(采自日本进口的鸡爪槭)、朱顶红短体线虫(采自以色列进口的孤挺花)、玻利维亚短体线虫(采自新西兰进口的麻)、假草地短体线虫(采自俄罗斯进口的郁金香)和最短尾短体线虫(采自台湾进口的苗)进行检测，只有日本短体线虫能进行有效扩增，出现条带，且其特异性片段大小为176bp，说明本发明一对引物具有很好的特异性。对日本短体线虫的DNA模板进行10°、10_ 1、10_ 2、10_ 3、10_ 4、10_ 5、10_ 6稀释再PCR检测，结果显示PCR检测限为原液稀释10—1倍。
【权利要求】
1.日本短体线虫的PCR检测试剂，包括一对特异性引物，其特征在于一对特异性引物的核苷酸序列分别为: 上游引物:GGCAACGGGC CTAGTTATGA 下游引物:GACTCGCGCA CACGATAAAC。
2.如权利要求1所述的日本短体线虫的PCR检测试剂组成的检测试剂盒，其特征在于由无Mg2+的IOXPCR缓冲液，浓度为25mM的MgCl2溶液，浓度为0.1mM的dNTP溶液，浓度5U/ ii L的Taq酶溶液， 浓度都为10 y M的上游引物溶液和下游引物溶液组成。
【文档编号】C12Q1/68GK103789427SQ201410030404
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月23日 优先权日:2014年1月23日
【发明者】顾建锋, 何洁, 陈先锋 申请人:宁波检验检疫科学技术研究院