一种二化螟细胞的原代培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种二化螟细胞的原代培养方法。包括如下步骤：（1）将二化螟幼虫浸没在乙醇溶液中，表面消毒，清洗吹干虫体；（2）将虫体置于解剖蜡盘中，解剖二化螟，取出需要建立细胞系的组织或器官，清洗；（3）置于预先盛有细胞培养液的细胞培养瓶中，放入细胞培养箱中培养，过夜后，待组织或器官贴壁后，再加入细胞培养液；（4）每隔几天吸出和换入细胞培养液，直至扩展并增殖的细胞充满培养瓶；（5）把含有新增殖出的单个细胞，连同全部的细胞培养液吸出放入新培养瓶中，将两个培养瓶放入培养箱中培养至细胞系建立初步成功。本发明有助于在离体条件下研究二化螟，为其防治途径的研究和开发提供帮助。
【专利说明】一种二化螟细胞的原代培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及属于昆虫细胞培养【技术领域】，尤其涉及一种二化螟细胞的原代培养方法。
【背景技术】
[0002]随着生命科学的迅猛发展，在生物工程【技术领域】中，细胞工程已愈来愈受到重视。培养昆虫细胞作为研究材料，一直是细胞生物学、分子生物学和生物化学以及昆虫毒理学等科学研究的重要方面。
[0003]自从Grace在1962年首次建立天蚕蛾细胞系以来，昆虫细胞培养技术得到了迅速发展，目前已建立了 800多株昆虫细胞系，主要集中于鳞翅目、双翅目(潘李珍等，1980，1989 ;曾庆韬等，1998)、鞘翅目(Lynn et al., 1995; Iwabuchi, 1999; Stiles,1992)、直翅目(Heinandez-Crespo et al., 2000)、膜翅目、同翅目和半翅目等,其中大部分来自鳞翅目和双翅目，来源于其他目的昆虫细胞系仅占1/10左右(张寰等，2007 )。昆虫细胞系的建立，不但促进了昆虫生物学方面的基础研究，也大大促进了基于昆虫细胞的应用性研究。其中，昆虫细胞-杆状病毒表达系统(BEVS)是当今最具高效的真核表达系统，已广泛应用于干扰素等外源基因的表达。
[0004]在所建立的昆虫细胞系中，研究和应用最多的是黑腹果蝇iDrosophila
S2 细胞系、粉纹夜蛾/?i)的 BT1-Tn-5B1_4 (High Five)细胞系和草地贪夜蛾/r^§7>6?r￡/a)Sf21细胞系及其克隆株Sf9等。相对于已知的上百万种昆虫以及昆虫细胞系的广泛用途来`说，已经建立的细胞系还远远不够，仍需要建立更多的昆虫细胞系以满足实际需要。
[0005]二化螟suppressalis (Walker)属鳞翅目，螟蛾科,是我国水稻上危害最为严重的常发性害虫之一，在分蘖期受害造成枯鞘、枯心苗，在穗期受害造成虫伤株和白穗，一般年份减产3%~5%，严重时减产在3成以上。除危害水稻外，二化螟还危害玉米、甘蔗、粟、蚕豆、茭白、高粱、油菜、小麦、紫云英等作物。二化螟有很强的适应能力，能快速适应不利环境(如抗性品种和杀虫剂)，其致害性能快速变异。在二化螟的防治过程中，新型生物农药的筛选和鉴定日益成为研究重点。生物农药的活动生物测定需要大量发育一致的二化螟试虫，对饲养场地要严格的要求，工作量大，而若有离体培养的二化螟细胞，则可以在离体条件下研究生物农药对二化螟的作用，从而有助于在细胞水平研究杀虫剂对二化螟的作用机制，有助于当前杀虫剂的改进和新杀虫剂的发明。目前，关于二化螟细胞的体外培养技术及二化螟细胞系，还未见报道。因此，通过本发明，建立二化螟细胞系，不仅能增加我国新昆虫细胞系的数量及种类，还能为日后该类昆虫细胞系的建立提供借鉴经验。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种二化螟细胞的原代培养方法。
[0007]二化螟细胞的原代培养方法的步骤如下:(1)在无菌条件下，将二化螟幼虫浸没在70%或75%乙醇溶液中，进行表面消毒10~20分钟，用无菌蒸馏水清洗二化螟幼虫3~5次，用无菌滤纸吸干虫体或用吹风机吹干虫体；
(2)将虫体置于用70%或75%乙醇消毒过的解剖蜡盘中，用解剖针将头尾固定，解剖二化螟，取出需要建立细胞系的组织或器官，将组织或器官放入盛有HBSS清洗液的培养皿中，清洗2~3次，然后再用细胞培养液清洗组织或器官；
(3)将清洗过的组织或器官置于预先盛有0.5mL~ImL细胞培养液的T-25cm2细胞培养瓶中，放入27°C无光照的细胞培养箱中培养，过夜后，待组织或器官贴壁后，再加入2mL细胞培养液，使组织块完全或大部分浸没在该培养液中；
(4)每隔7~10天吸出和换入50%~70%量的细胞培养液，直至扩展并增殖的细胞充满培养瓶；
(5)把含有新增殖出的单个细胞，连同全部的细胞培养液吸出放入新培养瓶中，加入新的细胞细胞培养液，而原含有组织块的培养瓶中再加入同吸出量同样多的新的细胞细胞培养液，将两个培养瓶放入培养箱中培养至细胞系建立初步成功。
[0008]所述的细胞培养液是昆虫细胞培养液与青霉素、链霉素、两性霉素B和动物血清的混合物，PH值为6.0-6.8。所述的昆虫细胞培养液选自TNM-FH，所述的动物血清为胎牛血清。所述的青霉素含量为200U/ml,链霉素含量为0.2 μ g /ml,两性霉素B含量为0.5 μ g/ml ο所述的动物血清体积比含量为10-20%。
[0009]本发明的有益效果是:采用上述方案，对二化螟多种组织进行了原代培养，取得了较好的培养效果。本发明快速、有效、重复性强，是对鳞翅目昆虫细胞培养的重要补充。二化螟为水稻重要害虫，本发明有 助于在离体条件下研究二化螟，为其防治途径的研究和新型生物农药的开发提供帮助。
[0010]【专利附图】
【附图说明】图1是培养24小时后脂肪体细胞的培养形态图；
图2是培养15天后脂肪体细胞的培养形态图；
图3是培养30天后脂肪体细胞的培养形态图；
图4是培养2天后血淋巴细胞的培养形态图；
图5是培养16天后血淋巴细胞的培养形态图；
图6是培养30天后血淋巴细胞的培养形态图。
【具体实施方式】
[0011]二化螟细胞的原代培养方法的步骤如下:
(1)在无菌条件下，将二化螟幼虫浸没在70%或75%乙醇溶液中，进行表面消毒10~20分钟，用无菌蒸馏水清洗二化螟幼虫3~5次，用无菌滤纸吸干虫体或用吹风机吹干虫体；
(2)将虫体置于用70%或75%乙醇消毒过的解剖蜡盘中，用解剖针将头尾固定，解剖二化螟，取出需要建立细胞系的组织或器官，将组织或器官放入盛有HBSS清洗液的培养皿中，清洗2~3次，然后再用细胞培养液清洗组织或器官；
(3)将清洗过的组织或器官置于预先盛有0.5mL~ImL细胞培养液的T-25cm2细胞培养瓶中，放入27°C无光照的细胞培养箱中培养，过夜后，待组织或器官贴壁后，再加入2mL细胞培养液，使组织块完全或大部分浸没在该培养液中；
(4)每隔7~10天吸出和换入50%~70%量的细胞培养液，直至扩展并增殖的细胞充满培养瓶；
(5)把含有新增殖出的单个细胞，连同全部的细胞培养液吸出放入新培养瓶中，加入新的细胞细胞培养液，而原含有组织块的培养瓶中再加入同吸出量同样多的新的细胞细胞培养液，将两个培养瓶放入培养箱中培养至细胞系建立初步成功。
[0012]所述的细胞培养液是昆虫细胞培养液与青霉素、链霉素、两性霉素B和动物血清的混合物，PH值为6.0-6.8。所述的昆虫细胞培养液选自TNM-FH，所述的动物血清为胎牛血清。所述的青霉素含量为200U/ml,链霉素含量为0.2 μ g /ml,两性霉素B含量为0.5 μ g/ml ο所述的动物血清体积比含量为10-20%。
[0013]以下结合实例对本发明作进一步的详细说明:
实施例1
二化螟幼虫脂肪体细胞的原代培养 经过下列步骤:
(1)在无菌操作台内(以下操作都在无菌条件下，所使用器具都要经过灭菌或消毒处理)将二化螟老熟幼虫I头浸没在70%的乙醇溶液中10分钟，进行表面消毒，用无菌蒸馏水清洗二化螟老熟幼虫3次，用无菌滤纸吸干二化螟老熟幼虫体或用吹风机吹干二化螟老熟幼虫体；
(2)将吹干二化螟老熟幼虫体置于用70%消毒过的解剖蜡盘中，用解剖针将头尾固定，用消毒解剖剪从背部剪开二化螟，再用解剖针将虫体固定住，用弯头镊子取出脂肪体组织，操作时尽量保持其完整，注意不能触破昆虫的消化道等同体外直接相连的部分；` (3)将脂肪体放入盛有HBSS清洗液(含200U/ml的青霉素，0.2 μ g /ml的链霉素，
0.5 μ g /ml的两性霉素B)的培养皿中，用HBSS清洗液清洗脂肪体2次，然后再用细胞培养液清洗脂肪体I次；
(4)将清洗过的脂肪体置于预先盛有0.5mL细胞培养液的T-25cm2细胞培养瓶中，放入27°C无光照的细胞培养箱中培养，过夜后，待脂肪体贴壁后，再加入2mL细胞培养液，使脂肪体大部分浸没在该培养液中，注意在加液的时候勿使脂肪体悬浮在细胞培养液中；
(5)每隔7天吸出50%量的细胞培养液，并同时换入吸出量的新的培养液，在上述操作后24小时后可观察到组织块在离体并在上述培养条件下，很快从其周围游离出大量单个的细胞(见图1);第15天后见到细胞不断增值并逐渐充满整个培养瓶(见图2);第30天后，增殖细胞充满整个培养瓶(见图3)，把含有新增值的细胞，连同全部的细胞培养液吸出放入新培养瓶中，并加入2mL新的细胞培养液，而原含有组织块的培养瓶中再加入同吸出量同样多的新的细胞培养液。两个培养瓶放入培养箱中培养，标志着原代培养成功，细胞开始传代。二化螟幼虫脂肪体细胞系初步建立成功。
[0014]实施例2
二化螟幼虫血淋巴细胞的原代培养
(1)在无菌操作台内(以下操作都在无菌条件下，所使用器具都要经过灭菌或消毒处理)将二化螟老熟幼虫I头浸没在75%的乙醇溶液中20分钟，进行表面，用无菌蒸馏水清洗二化螟老熟幼虫5次，用无菌滤纸吸干二化螟老熟幼虫体或用吹风机吹干二化螟老熟幼虫体；
(2)将吹干二化螟老熟幼虫体置于用75%消毒过的解剖蜡盘中，用解剖针将头尾固定，用消毒解剖剪从背部剪开二化螟，用20 μ L移液器吸取血淋巴放入装有HBSS清洗液(含200U/ml的青霉素，0.2 μ g /ml的链霉素，0.5 μ g /ml的两性霉素B)的培养瓶中，拧紧盖子，静止放置15分钟。注意不能触破昆虫的消化道等同体外直接相连的部分；
(3)待血淋巴细胞贴壁后，用移液器吸除HBSS清洗液，加入新鲜的HBSS清洗液，重复3次，以防止黑化现象的发生，在第3次吸除HBSS清洗液后，加入2mL细胞培养液，拧紧瓶盖，将培养瓶放入27°C无光照的细胞培养箱中培养；
(4)每隔10天吸出70%量的细胞培养液，并同时换入吸出量的新的培养液。
[0015](5)在上述操作后2天后可观察到大量增殖的单个细胞(见图4)并逐渐向外围扩展；第16天后见到细胞不断拉丝生长，增值并充满整个培养瓶(见图5);第30天后见到增殖细胞充满整个培养瓶(见图6);把含有新增值的细胞，连同全部的细胞培养液吸出放入新培养瓶中，按照1:5 (细胞体积:最后培养液体积)进行传代培养。二化螟幼虫血淋巴细胞系初步建 立成功。
【权利要求】
1.一种二化螟细胞的原代培养方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)在无菌条件下，将二化螟幼虫浸没在70%或75%乙醇溶液中，进行表面消毒10~20分钟，用无菌蒸馏水清洗二化螟幼虫3~5次，用无菌滤纸吸干虫体或用吹风机吹干虫体； (2)将虫体置于用70%或75%乙醇消毒过的解剖蜡盘中，用解剖针将头尾固定，解剖二化螟，取出需要建立细胞系的组织或器官，将组织或器官放入盛有HBSS清洗液的培养皿中，清洗2~3次，然后再用细胞培养液清洗组织或器官； (3)将清洗过的组织或器官置于预先盛有0.5mL~ImL细胞培养液的T-25cm2细胞培养瓶中，放入27°C无光照的细胞培养箱中培养，过夜后，待组织或器官贴壁后，再加入2mL细胞培养液，使组织块完全或大部分浸没在该培养液中； (4)每隔7~10天吸出和换入50%~70%量的细胞培养液，直至扩展并增殖的细胞充满培养瓶； (5)把含有新增殖出的单个细胞，连同全部的细胞培养液吸出放入新培养瓶中，加入新的细胞细胞培养液，而原含有组织块的培养瓶中再加入同吸出量同样多的新的细胞细胞培养液，将两个培养瓶放入培养箱中培养至细胞系建立初步成功。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞培养液是昆虫细胞培养液与青霉素、链霉素、两性霉素B和动物血清的混合物，pH值为6.0-6.8。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的昆虫细胞培养液选自TNM-FH，所述的动物血清为胎牛血清。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的青霉素含量为200U/ml，链霉素含量为0.2 μ g /ml,两性霉素B含量为0.5 μ g /ml。
5.根据权利要求2所述的方法``，其特征在于，所述的动物血清体积比含量为10-20%。
【文档编号】C12N5/07GK103820381SQ201410030210
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年1月23日 优先权日:2014年1月23日
【发明者】俞晓平, 刘光富, 许益鹏 申请人:中国计量学院