间充质干细胞的三维共培养诱导方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞工程技术领域，特别涉及一种间充质干细胞的三维共培养诱导方 法。
【背景技术】
[0002] 间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，它能够定向诱导为胰岛样细胞、 软骨细胞等多种细胞。且间充质细胞存在于人体多种组织中，尤其是脐带、胎盘、骨髓、脂肪 组织来源的间充质干细胞，具有来源广泛、易于采集、无伦理问题等优势，可规模化诱导分 化为临床治疗所需要的目的细胞，如软骨细胞、胰岛细胞等。但目前多采用静态二维共培养 间充质干细胞和目的细胞的方式使间充质干细胞转化为目的细胞，虽然通过这种共培养方 式，软骨细胞可以通过近分泌和旁分泌作用更加迅速地影响周边的间充质干细胞分化，但 这种诱导方式很难有效辨别培养体系中目的细胞的来源，也无法有效分离两种细胞；并且 诱导周期长，诱导转化率低，细胞活性低。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中二维共培养间充质干细胞的诱导 方式存在诱导周期长，诱导率低，细胞活性差，分离两种共培养细胞困难等缺陷，提供一种 能够提高间充质干细胞的诱导转化率，增强细胞活性且易分离共培养细胞的间充质干细胞 的三维共培养诱导方法。
[0004] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0005] 提供一种间充质干细胞的三维共培养诱导方法，包括以下步骤：
[0006] 分别获取间充质干细胞和目的细胞源；
[0007] 将间充质干细胞与含有磁性氧化物颗粒的可溶性的海藻酸盐A混合后，再与除镁 离子以外的二价金属离子盐溶液A混合，至形成凝胶球A ;
[0008] 将目的细胞源与可溶性的海藻酸盐B混合后，再与除镁离子以外的二价金属离子 盐溶液B混合，至形成凝胶球B ;
[0009] 用诱导剂凝胶球A内的间充质干细胞和凝胶球B中的目的细胞源进行共培养至间 充质干细胞转化为目的细胞，然后将凝胶球A和凝胶球B置于磁场中进行分离；
[0010] 其中，磁性氧化物颗粒的直径为l-100nm。
[0011] 在本发明提供的间充质干细胞的三维共培养诱导方法中，所述凝胶球A的形成过 程为：将所述间充质干细胞与含有磁性氧化物颗粒的可溶性的海藻酸盐A混合后，匀速加 入除镁离子以外的二价金属离子盐溶液中。
[0012] 在本发明提供的间充质干细胞的三维共培养诱导方法中，所述凝胶球A内的间充 质干细胞与凝胶球B中的目的细胞源进行共培养之前，还包括采用培养液清洗凝胶球A和 凝胶球B的步骤。
[0013] 在本发明提供的间充质干细胞的三维共培养诱导方法中，所述磁场的最大磁能积 为 35MG0e。
[0014] 在本发明提供的间充质干细胞的三维共培养诱导方法中，所述磁性氧化物颗粒为 Fe30 4或Co 304颗粒，且所述海藻酸盐A中，磁性氧化物的浓度为2-10mg/ml。
[0015] 在本发明提供的间充质干细胞的三维共培养诱导方法中，所述海藻酸盐A和海藻 酸盐B均为海藻酸钠或海藻酸钙；与间充质干细胞混合后，海藻酸盐A的浓度为2% -10% W/V ;与目的细胞源混合后，海藻酸盐B的浓度为2% -10% W/V。
[0016] 在本发明提供的间充质干细胞的三维共培养诱导方法中，所述二价金属离子盐溶 液A和二价金属离子盐溶液B均为氯化妈溶液，且氯化妈的浓度均为1 % -5 % W/V。
[0017] 在本发明提供的间充质干细胞的三维共培养诱导方法中，所述目的细胞源为软骨 细胞源；且对所述凝胶球A内的间充质干细胞和凝胶球B中的目的细胞源进行共培养的步 骤中，所述间充质干细胞与所述软骨细胞源的浓度比为1:1-3:1。
[0018] 在本发明提供的间充质干细胞的三维共培养诱导方法中，所述诱导培养过程中所 采用的诱导剂包括5_15ng/ml的TGF-0、7_10mmol/l地塞米松、50-100ug/ml抗坏血酸、 5-15mmol/l 甘油磷酸钠和 50_150ng/ml 的 ITS+Premix。
[0019] 在本发明提供的间充质干细胞的三维共培养诱导方法中，对所述凝胶球A中的间 充质干细胞和凝胶球B中的目的细胞源共培养的过程是在生物反应器中进行的。
[0020] 实施本发明提供的间充质干细胞的三维共培养诱导方法，可以达到以下有益效 果：通过海藻酸凝胶球A将磁性氧化物与间充质干细胞包裹在一起，并将软骨细胞包裹在 海藻酸凝胶球B中，同时对凝胶球A中的间充质干细胞和凝胶球B中的软骨细胞进行共培 养，使得软骨细胞的旁分泌和近分泌能够促进间充质干细胞向软骨细胞分化；待诱导培养 结束，含有磁性氧化物的凝胶球A在外加磁场的作用下可聚集在一起，从而与凝胶球B分 离；因此，本发明不仅为间充质干细胞提供一个模拟体内细胞生长的微环境，扩大了间充质 干细胞的生长空间，以及与培养液及细胞间的物质信号交流，促进间充质干细胞的生长分 化，提高转化率，增强细胞活性；同时，也使得分离两种共培养细胞更加方便。
【附图说明】
[0021] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0022] 图1为本发明提供的检测实验三中，根据Chs标准样品工作液的浓度及其0D值所 制作的标准曲线图。
【具体实施方式】
[0023] 为解决现有技术中二维共培养间充质干细胞的诱导方式存在诱导周期长，转化率 低，细胞活性差，分离两种共培养细胞困难等缺陷，本发明的创新点在于提供一种间充质干 细胞三维共培养诱导方法，通过海藻酸凝胶球A将磁性氧化物与间充质干细胞包裹在一 起，并将软骨细胞包裹在海藻酸凝胶球B中，同时对凝胶球A中的间充质干细胞和凝胶球B 中的软骨细胞进行共培养，使得软骨细胞的旁分泌和近分泌能够促进间充质干细胞向软骨 细胞分化；待诱导培养结束，含有磁性氧化物的凝胶球A在外加磁场的作用下可聚集在一 起，从而与凝胶体B分离，解决了现有技术中分离细胞困难的目的；而海藻酸凝胶球的三维 孔隙结构为间充质干细胞提供一个三维生长空间，磁性氧化物以模拟细胞在体内的生存环 境，为间充质干细胞提供充足的生长空间，增加间充质干细胞与培养液的接触面积，从而实 现了提高间充质干细胞的转化率，增强细胞活性，增加软骨细胞的数量，并缩短诱导周期。
[0024] 本发明提供的间充质干细胞的三维共培养诱导方法，包括以下步骤：
[0025] -、分别获取间充质干细胞和目的细胞源；
[0026] 二、将间充质干细胞与含有磁性氧化物颗粒的可溶性的海藻酸盐A混合后，加入 除镁离子以外的二价金属离子盐溶液A中，至形成凝胶球A ;
[0027] 三、将目的细胞源与可溶性的海藻酸盐B混合后，加入除镁离子以外的二价金属 离子盐溶液B中，至形成凝胶球B ;
[0028] 四、分别清洗凝胶球A和凝胶球B后，将凝胶球A内的间充质干细胞和凝胶球B中 的软骨细胞置于细胞培养容器中进行共培养至间充质干细胞转化为软骨细胞，然后将凝胶 球A和凝胶球B置于磁场中进行分离。
[0029] 步骤一中，间充质干细胞可来源于脐带、胎盘、骨髓等，优选地，从骨髓中获取间充 质干细胞；优选地，间充质干细胞的密度为5-15 X 106个/ml。目的细胞源可根据具体需要 进行获取，下以软骨细胞源为例进行具体说明。软骨细胞源来源于动物软骨，软骨细胞源与 间充质干细胞的浓度比为1:1-3:1，优选地，软骨细胞源的密度为2. 5-5X 106个/ml。
[0030] 步骤二中，海藻酸盐高分子在除镁以外的二价金属离子的作用下交联而失去了流 变性后，水分子的流动受到了抑制，进而产生了含水量极高且具有通孔的凝胶体，并且海藻 酸盐的凝胶体不是热可逆的，具有很好的稳定性及生物相容性，因此，能够为间充质干细胞 提供稳定的三维生长空间，模拟细胞在体内的生长环境，扩大了间充质干细胞的生长空间， 并且增大了间充质干细胞与培养液的接触面积，有利于细胞的贴附、生长和分化。
[0031 ] 其中，单价阳离子和Mg2+与海藻酸盐不能形成凝胶，而Ba2+和Sr2+所形成的凝胶比 Ca2+形成的凝胶性能更强。其他多价阳离子，如Pb 2+、&12+、0(12+、(：〇2+、附2+、2112+和此2+等也可 以形成海藻酸钠交联凝胶，但因具有毒性其应用受限；由于Ca 2+来源较广，获取较易，优选 地，二价金属离子为钙离子，且二价金属离子盐溶液为CaCl2溶液，CaCl 2的浓度为1 % -5 % W/V，钙离子浓度越大，凝胶球直径越大，形成的孔隙结构越多，凝胶球的渗透能力也越强， 越有利于细胞附着生长、分化；海藻酸盐为海藻酸钠或海藻酸钙等，优选为海藻酸钠溶液， 且海藻酸钠的浓度为2% -10% W/V。本发明中单位W/V如无特别指出均为mg/ml。
[0032] 需要注意的是，由于二价金属离子和海藻酸盐的反应迅速，可通过提高凝胶化温 度，钙离子总量或降低海藻酸盐溶液浓度来加快胶化过程；而减慢固化速度、提高海藻酸盐 溶液浓度、钙离子总量以及使用分子质量较高的海藻酸盐，可以增强其力学性能，更有利于 间充质干细胞的分化。另外，海藻酸盐与金属离子盐溶液的滴加顺序及滴加速度会影响胶 体的性质，滴加速度过快，产生的胶体是小片状凝胶和间断的凝胶结构，间充质干细胞分布 不均匀；优选地，本发明采用将间充质干细胞与海藻酸盐