间充质干细胞的三维培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及组织工程技术领域，特别涉及间充质干细胞的三维培养方法。
【背景技术】
[0002] 间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，它能够定向诱导为胰岛样细胞、 软骨细胞等多种细胞。且间充质细胞存在于人体多种组织中，尤其是脐带、胎盘、脂肪组织 来源的间充质干细胞，具有来源广泛、易于采集、无伦理问题等优势，可规模化诱导分化为 胰岛样细胞，为临床治疗糖尿病提供新的技术方案。
[0003]因间充质干细胞有较强的贴壁性，因此，在二维培养体系中，间充质干细胞易聚集 成团，不利于细胞增殖培养，且细胞活性较低、活细胞比率低等问题。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中间充质干细胞在二维培养体系中 存在细胞活性低、增殖效果差等缺陷，提供一种能够提高细胞增殖率和活细胞比率的间充 质干细胞的三维培养方法。
[0005]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种间充质干细胞的三维培养 方法，包括以下步骤：获取间充质干细胞，将间充质干细胞与PM多肽水凝胶混合后进行培 养。
[0006]在本发明提供的间充质干细胞的三维培养方法中，所述PM多肽水凝胶由PM多肽 溶解于去离子水所获得的。
[0007]在本发明提供的间充质干细胞的三维培养方法中，所述PM多肽水凝胶中，所述PM多肽水凝胶中，PM多肽的质量分数为0. 1% -0. 75%。
[0008]在本发明提供的间充质干细胞的三维培养方法中，所述PM多肽水凝胶中，所述PM多肽水凝胶与间充质干细胞混合前，还包括采用培养液反复浸润所述PM多肽水凝胶的步 骤。
[0009]在本发明提供的间充质干细胞的三维培养方法中，所述PM多肽水凝胶中，所述培 养液为基础培养液或完全培养液。
[0010] 在本发明提供的间充质干细胞的三维培养方法中，所述PM多肽水凝胶中，所述PM多肽水凝胶浸润次数为2-4次。
[0011] 在本发明提供的间充质干细胞的三维培养方法中，所述PM多肽水凝胶与间充质 干细胞混合前，还包括采用完全培养液重悬间充质干细胞的步骤，并使得间充质干细胞的 浓度为 1X104个 /mL-1X10 6个 /mL。
[0012] 实施本发明提供的间充质干细胞的三维培养方法，可以达到以下有益效果：利用 具有三维网状结构的PM多肽水凝胶为间充质干细胞提供一个模拟人体内细胞生长的环 境，为间充质干细胞提供充足的生长空间和营养需求，有利于间充质干细胞的扩增及提高 间充质干细胞的细胞活性。
【附图说明】
[0013] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0014] 图1为本发明检测实验二中，采用0%PM多肽水凝胶培养的间充质干细胞在培养 前，电镜观察到的的细胞生长状况图；
[0015] 图2为本发明检测实验二中，采用0%PM多肽水凝胶培养的间充质干细胞培养12 天后，电镜观察到的的细胞生长状况图；
[0016] 图3为本发明检测实验二中，采用0. 25%PM多肽水凝胶培养的间充质干细胞在培 养前，电镜观察到的的细胞生长状况图；
[0017] 图4为本发明检测实验二中，采用0. 25%PM多肽水凝胶培养的间充质干细胞在培 养12天后，电镜观察到的的细胞生长状况图；
[0018] 图5为本发明检测实验二中，采用0. 5%PM多肽水凝胶培养的间充质干细胞在培 养前，电镜观察到的的细胞生长状况图；
[0019] 图6为本发明检测实验二中，采用0. 5%PM多肽水凝胶培养的间充质干细胞培养 12天后，电镜观察到的的细胞生长状况图；
[0020] 图7为本发明检测实验二中，采用0. 75%PM多肽水凝胶培养的间充质干细胞在培 养前，电镜观察到的的细胞生长状况图；
[0021] 图8为本发明检测实验二中，采用0. 75%PM多肽水凝胶培养的间充质干细胞培养 12天后，电镜观察到的的细胞生长状况图。
【具体实施方式】
[0022] 为解决现有技术中间充质干细胞在二维培养体系中，间充质干细胞扩增效果不 佳，活性不高等缺陷，本发明的创新点在于提供一种间充质干细胞的三维培养方法，通过在 培养基中加入具有三维网状结构的PM多肽水凝胶，能够模拟人体内细胞生长环境，为间充 质干细胞提供充足的生长空间和营养需求，从而实现了提高间充质干细胞活性及扩增倍数 的目的。
[0023] 本发明提供的一种间充质干细胞的三维培养方法，包括以下步骤：获取间充质干 细胞，将间充质干细胞与PM多肽水凝胶混合后进行培养。
[0024] PM多肽水凝胶具有三维网状结构，能够模拟人体内细胞生长环境，增大了间充质 干细胞与培养基和氧气的接触面积，同时，由于间充质干细胞为较强的贴壁细胞，PM多肽水 凝胶的三维网状结构，也为间充质干细胞提供更充足的生长空间，更有利于脐带间充质干 细胞的扩增，同时，PM多肽水凝胶含水量较高，也提高了间充质干细胞的活性。
[0025] 本发明所采用的PM多肽水凝胶，又称PM凝胶肽（PuraMatrix凝胶肽），购自于BD 公司；PuraMatrix多肽是由16个氨基酸残基组成的一种肽，没有包含明显的生长因子或细 胞因子，自组装形成纳米纤维结构，溶于水溶液中，疏水和离子氨基酸结合形成三维网状结 构的凝胶状，即PM多肽水凝胶，可以供间充质干细胞提供充足的生长空间，扩大间充质干 细胞与培养液的接触面积，有利于脐带间充质干细胞的扩增。目前PM多肽水凝胶公开的用 途为用于组织再生，如骨填充物，伤口愈合以及用于药物输送系统等，而本发明中将PM多 肽溶于水之后，利用其三维网状结构进行间充质干细胞的培养，能够获得较好的间充质干 细胞的培养效果。
[0026] 具体地，间充质干细胞的三维培养过程为：
[0027] 1、去离子水溶解PM多肽，获取PM多肽水凝胶；
[0028] 2、采用基础培养液反复浸润步骤1获得的PM多肽水凝胶，浸润次数为2-4次；
[0029] 3、获取间充质干细胞；
[0030] 4、将步骤3中获得的间充质干细胞与步骤2中获得的PM多肽水凝胶混合后进行 培养。
[0031 ] 步骤1中，将PM多肽放入超声波水浴锅超声振荡30min，其中，该水浴所采用的水 为去离子水；若振荡过程中产生气泡，转移至离心管离心（4000转/5min)去除。根据所需PM多肽水凝胶中PM多肽的终浓度，取1. 5mL的EP管（印pendorf管，标有相应浓度的离心 管），用去离子水稀释PM多肽原液配制所需浓度的PM多肽水凝胶，优选地，在PM多肽水凝 胶中，PM多肽的质量分数为0. 1 % -0. 75%，PM多肽水凝胶浓度过大，则PM多肽水凝胶形成 的网状结构过于致密，不利于细胞因子的传递和细胞之间信号的转导，或导致细胞的缺氧， 不利于细胞的增殖培养。
[0032] 由于电解质物质会影响PM多肽水凝胶在水中的溶解度，因此，该过程中采用去除 电解质物质的去离子水进行溶解稀释PM多肽水凝胶。另外，气泡的存在使得PM多肽水凝 胶在去离子水中分散不均匀，影响间充质干细胞的扩增密度，并且气泡结构不稳定，会随时 破裂，容易破坏附着在PM多肽水凝胶上的间充质干细胞，因此，在该过程中，要尽量避免产 生气泡。
[0033] 步骤2中，将步骤1中获得的PM多肽水凝胶接种于细胞培养容器中，如培养板中， 一次性从培养孔中心快速注入相应浓度PM多肽水凝胶50yL，尽量避免产生气泡，如有气 泡，用细针头刺破，并保证高浓度PM多肽水凝胶铺满孔底，将培养板置于37°C培养箱静置 15min〇
[0034] 然后，用200yL移液枪小心缓慢地沿着培养孔壁注入20