羊水间充质干细胞的原代分离培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及干细胞培养技术领域，尤其涉及羊水间充质干细胞的原代分离培养方 法。
【背景技术】
[0002] 干细胞是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的原始未分化细胞，处于未定向 分化状态并具有增殖能力。在特定条件下，干细胞可分化成不同类型的具有特征性形态、特 异分子标志和特殊功能的成熟细胞。根据干细胞来源的不同可分为胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC)和来源于出生后器官或成年个体组织的组织干细胞或成体干细胞（adult stem cell，ASC)。从来源看，要获取大量干细胞较困难。因此，寻找新的干细胞源成为热 点。
[0003] 近年研宄表明：羊水（amniotic fluid，AF)中存在干细胞，可以分化为多种成体 细胞，有望成为一种新的干细胞来源，且可避免ESC的伦理问题以及ASC的局限性。羊水干 细胞（amniotic fluid-derived stem cell，AFS)可通过AF穿刺获取，较ESC易获取。羊 水细胞比其它普通类型的细胞有着很多优点：首先，正常情况下羊水细胞在孕妇临产前就 能够被提取。其次，羊水混合物中所包含细胞的"年龄"都比较小，因此这些细胞遭受周围 环境引起的诱发突变的可能性就很小，从遗传学角度来说它们会更稳定。
[0004] 羊水中含有较多类型的细胞，如内皮细胞等，在分离和培养的过程中需要去除。目 前，对羊水干细胞的分选多采用免疫磁珠分选法，但该方法对细胞活性存在一定影响，且费 用较高。还有些方法采用机械分离，但人为刮除内皮细胞的方法操作十分繁琐且极易引起 污染，并且，极易造成细胞的损伤，导致细胞活性的降低。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供羊水间充质干细胞的原代分离培养 方法；本发明提供的方法利用差速贴壁原理，简化了操作，获得的干细胞纯度较高，活性良 好，经传代后仍保持良好的干性。
[0006] 本发明提供的羊水间充质干细胞的原代分离培养方法包括：
[0007] 步骤1 :明胶铺板后接种羊水组织细胞，培养llh~13h后转移培养液；
[0008] 步骤2 :将所述培养液培养至细胞融合率不低于85 %，获得初步纯化的细胞；
[0009] 步骤3 :将所述初步纯化的细胞重悬，培养3h~5h后，更新培养基，继续培养至细 胞贴壁，弃除培养液，获得羊水间充质干细胞。
[0010] 本发明提供的方法，利用差速贴壁原理，在适宜条件下，使内皮细胞先贴壁生长。 本发明准确控制培养时间，待内皮细胞贴壁完成后，转移包含羊水间充质干细胞的培养液。 对培养液进行传代培养后获得羊水间充质干细胞。本发明提供的方法操作简单，无需更多 的仪器，且无需人为刮除的操作，避免了细胞的损伤和污染。检测结果表明，步骤1中获得 的培养液中所包含的羊水间充质干细胞的活力不低于89. 28%，经传代3代，流式细胞检测 结果表明，其表面抗体仍符合干细胞特性，未见分化趋势。
[0011] 在本发明的实施例中，步骤1中接种的羊水组织细胞密度为5X105个/mL。
[0012] 在本发明的实施例中，步骤1中接种羊水组织细胞的量为2mL。
[0013] 步骤1中接种密度和细胞量直接影响细胞增殖速率和贴壁效果，密度过高则内皮 细胞不能完全贴壁，而密度过低则细胞贴壁速度过缓，影响细胞活力。
[0014] 在本发明的实施例中，步骤1中培养的培养基为Lonza完全培养基；步骤1中培养 的温度为37°C，5%C02、湿度为95%。
[0015]Lonza完全培养基包括：无血清培养基（LonzaUltra⑶LTURETM)、血清替代物 (PALLUltroserG)、谷氨酰胺和NEAA。
[0016] 其中，血清代替物的质量分数为10%。
[0017] 谷氨酰胺的质量分数为1%。
[0018] NEAA的质量分数为1 %。
[0019] 明胶可促进细胞贴壁，明胶铺板的方法为：向细胞培养板中加入质量分数为 〇. 1 %的明胶溶液，lmL/孔，常温下孵育30min，结束后弃去明胶溶液。
[0020] 在本发明的实施例中，步骤1中所述培养的时间为12h。
[0021] 在本发明的实施例中，步骤2中培养的时间为72h。
[0022] 在本发明的实施例中，步骤3中重悬至细胞密度为IX105个/mL。
[0023] 在本发明的是实施例中，步骤3重悬采用Lonza完全培养基；步骤3中所述培养的 温度为37°C，5%C02、湿度为95%。
[0024] 在一些实施例中，重悬具体为：将初步纯化的细胞经胰酶酶解后，以Lonza完全培 养基重悬。
[0025] 作为优选，胰酶酶解的酶解液中，胰酶的质量分数为0. 25%，EDTA的质量分数为 0? 02%〇
[0026] 在一些实施例中，步骤3中培养在平皿中进行，培养量为8mL。
[0027] 在一些实施例中，步骤3所述培养的时间为4h，继续培养的时间为120h。
[0028] 在一些实施例中，步骤3中更新培养基具体为，弃除平皿中的上清液，加入新的 Lonza完全培养基。
[0029] 加入新的Lonza完全培养基的量为8mL。
[0030] 在一些实施例中，羊水组织细胞的获取方法为：将羊水离心后取沉淀，以PBS缓冲 液洗涤，获得羊水组织细胞。
[0031] 优选的，羊水为剖腹产产妇的羊水。
[0032] 优选的，离心的速度为2000rpm，时间为5min。
[0033] PBS缓冲液洗涤的体积为40mL。
[0034] 在本发明的实施例中，本发明分离培养的羊水组织细胞为人羊水组织细胞。
[0035] 本发明提供的方法，利用差速贴壁原理，在适宜条件下，使内皮细胞先贴壁生长， 而此时间充质干细胞尚未贴壁。本发明准确控制培养时间，待内皮细胞贴壁完成后，转移 包含羊水间充质干细胞的培养液。对培养液进行传代培养后获得羊水间充质干细胞。本 发明提供的方法操作简单，无需更多的仪器，且无需人为刮除的操作，避免了细胞的损伤和 污染。检测结果表明，步骤1中获得的培养液中所包含的羊水间充质干细胞的活力不低于 89. 28%，经传代3代，流式细胞检测结果表明，其表面抗体仍符合干细胞特性，未见分化趋 势。
【附图说明】
[0036] 图l_a示实施例1经原代培养（24h)后的贴壁细胞形态，放大4倍；
[0037] 图l_b示实施例1经原代培养（72h)后的贴壁细胞形态，放大4倍；
[0038] 图2示实施例1和对比例1~2细胞增殖曲线；其中，线1示实施例1的细胞增殖 曲线；线2示对比例1的细胞增殖曲线，线3示对比例2的细胞增长曲线；
[0039] 图3-a示同型对照抗体检测实施例1制得的第3代羊水间充质干细胞的结果；分 别表示了所检测的细胞数量；以及根据对照组细胞所设定抗体⑶73、⑶90、⑶105、HLA-DR、 CD45、CD34 的门；
[0040]图3-b示实施例1制得的第3代示羊水间充质干细胞的流式检测结果；分别表达CD73、CD90、CD105、HLA-DR、CD45、CD34 的细胞含量。
【具体实施方式】
[0041] 本发明提供了羊水间充质干细胞的原代分离培养方法，本领域技术人员可以借鉴 本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技 术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较 佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文的方法 和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0042] 本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0043] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0044] 实施例1
[0045] 本发明提供的羊水间充质干细胞的纯化过程具体为：
[0046] -、原代培养：
[0047] 1、取剖腹产产妇的羊水，用无菌容器盛装后，放入超净台中。
[0048] 2、把羊水分装至50mL离心管中，2000rpm离心5min，弃上清。
[0049] 3、每个50mL离心管中加入40mLPBS进行重悬，2000rpm离心5min，弃上清。
[0050] 4、往六孔板中加入0. 1 %明胶，lmL/孔，常温下孵育30min，结束后弃去明胶溶液。
[0051] 5、用lonza完全培养基重悬沉淀，调整细胞密度为5X105cell/mL，接种至孵育过 明胶的六孔板中，2mL/孔；转移至细胞培养箱进行培养。
[0052] 6、培养12h后，将培养液转移至新的六孔板中（切勿吹打，贴壁的均为内皮细胞）， 转移至细胞培养箱进行培养。
[0053] 7、24h后观察到贴壁的细胞多为间充质干细胞（倒置显微镜观察细胞形态，图 l_a)，共培养72h(倒置显微镜观察细胞形态，图1-b)。
[0054] 二、传代培养：
[0055] 待原代细胞融合率达85 %时，用0.25 %胰酶-0.02%EDTA进行酶解传代。
[0056] 调整细胞密度为lX105cell/mL，接种8mL至9cm平皿中，转移至细胞培养箱进行 培养4h。
[0057] 4h后，取出平皿，吸弃上清，加入新lonza完全培养基进行培养。
[0058] 继续培养4h至细胞贴壁，弃除培养液，贴壁的细胞为进一步纯化的间充质干细 胞。
[0059] 经检测，间充质干细胞纯度为99. 3%。
[0060] 实施例2
[0061] 本发明提供的羊水间充质干细胞的纯化过程具体为：
[0062] -、原代培养：
[0063] 1、取剖腹产产妇的羊水，用无菌容器盛装后，放入超净台中。
[0064] 2、把羊水分装至50mL离心管中，2000rpm离心5min，弃上清。
[0065] 3、每个50mL离心管中加入