40mLPBS进行重悬，2000rpm离心5min，弃上清。
[0066] 4、往六孔板中加入0. 1 %明胶，lmL/孔，常温下孵育30min，结束后弃去明胶溶液。
[0067] 5、用lonza完全培养基重悬沉淀，调整细胞密度为IX105cell/mL，接种至孵育过 明胶的六孔板中，2mL/孔；转移至细胞培养箱进行培养。
[0068]6、培养13h后，将培养液转移至新的六孔板中（切勿吹打，贴壁的均为内皮细胞）， 转移至细胞培养箱进行培养。
[0069] 7、24h后观察到贴壁的细胞多为间充质干细胞，共培养72h。
[0070] 二、传代培养：
[0071] 待原代细胞融合率达85 %时，用0.25 %胰酶-0.02%EDTA进行酶解传代。
[0072] 调整细胞密度为lX105cell/mL，接种8mL至9cm平皿中，转移至细胞培养箱进行 培养5h。
[0073]5h后，取出平皿，吸弃上清，加入新lonza完全培养基进行培养。
[0074] 继续培养4h至细胞贴壁，弃除培养液，贴壁的细胞为进一步纯化的间充质干细 胞。
[0075] 经检测，间充质干细胞纯度为99. 5%。
[0076] 实施例3
[0077] 本发明提供的羊水间充质干细胞的纯化过程具体为：
[0078] -、原代培养：
[0079] 1、取剖腹产产妇的羊水，用无菌容器盛装后，放入超净台中。
[0080] 2、把羊水分装至50mL离心管中，2000rpm离心5min，弃上清。
[0081] 3、每个50mL离心管中加入40mLPBS进行重悬，2000rpm离心5min，弃上清。
[0082] 4、往六孔板中加入0. 1 %明胶，lmL/孔，常温下孵育30min，结束后弃去明胶溶液。
[0083] 5、用lonza完全培养基重悬沉淀，调整细胞密度为IX106cell/mL，接种至孵育过 明胶的六孔板中，2mL/孔；转移至细胞培养箱进行培养。
[0084] 6、培养llh后，将培养液转移至新的六孔板中（切勿吹打，贴壁的均为内皮细胞）， 转移至细胞培养箱进行培养。
[0085] 7、24h后观察到贴壁的细胞多为间充质干细胞，共培养72h。
[0086] 二、传代培养：
[0087] 待原代细胞融合率达85 %时，用0.25 %胰酶-0.02%EDTA进行酶解传代。
[0088] 调整细胞密度为lX105cell/mL，接种8mL至9cm平皿中，转移至细胞培养箱进行 培养3h。
[0089] 3h后，取出平皿，吸弃上清，加入新lonza完全培养基进行培养。
[0090] 继续培养4h至细胞贴壁，弃除培养液，贴壁的细胞为进一步纯化的间充质干细 胞。
[0091] 经检测，间充质干细胞纯度为92. 5%。
[0092] 对比例1
[0093] 本发明提供的羊水间充质干细胞的纯化过程具体为：
[0094] -、原代培养：
[0095] 1、取剖腹产产妇的羊水，用无菌容器盛装后，放入超净台中。
[0096] 2、把羊水分装至50mL离心管中，2000rpm离心5min，弃上清。
[0097] 3、每个50mL离心管中加入40mLPBS进行重悬，2000rpm离心5min，弃上清。
[0098] 4、往六孔板中加入0. 1 %明胶，lmL/孔，常温下孵育30min，结束后弃去明胶溶液。
[0099] 5、用F12/DMEM+10%FBS培养基重悬沉淀，调整细胞密度为5X105cell/mL，接种 至孵育过明胶的六孔板中，2mL/孔；转移至细胞培养箱进行培养。
[0100] 6、培养12h后，将培养液转移至新的六孔板中（切勿吹打，贴壁的均为内皮细胞）， 转移至细胞培养箱进行培养。
[0101] 7、24h后观察到贴壁的细胞多为间充质干细胞，共培养72h。
[0102] 二、传代培养：
[0103] 待原代细胞融合率达85 %时，用0. 25 %胰酶-0. 02%EDTA进行酶解传代。
[0104] 调整细胞密度为lX105cell/mL，接种8mL至9cm平皿中，转移至细胞培养箱进行 培养4h。
[0105] 4h后，取出平皿，吸弃上清，加入新F12/DMEM+10%FBS培养基进行培养。
[0106] 继续培养4h至细胞贴壁，弃除培养液，贴壁的细胞为进一步纯化的间充质干细 胞。
[0107] 经检测，间充质干细胞纯度为85. 6%。
[0108] 对比例2
[0109] 本发明提供的羊水间充质干细胞的纯化过程具体为：
[0110] 一、原代培养：
[0111] 1、取剖腹产产妇的羊水，用无菌容器盛装后，放入超净台中。
[0112] 2、把羊水分装至50mL离心管中，2000rpm离心5min，弃上清。
[0113] 3、每个50mL离心管中加入40mLPBS进行重悬，2000rpm离心5min，弃上清。
[0114] 4、往六孔板中加入0. 1%明胶，lmL/孔，常温下孵育30min，结束后弃去明胶溶液。
[0115] 5、用DMEM高糖+10%FBS培养基重悬沉淀，调整细胞密度为5X105cell/mL，接种 至孵育过明胶的六孔板中，2mL/孔；转移至细胞培养箱进行培养。
[0116] 6、培养12h后，将培养液转移至新的六孔板中（切勿吹打，贴壁的均为内皮细胞）， 转移至细胞培养箱进行培养。
[0117] 7、24h后观察到贴壁的细胞多为间充质干细胞，共培养72h。
[0118] 二、传代培养：
[0119] 待原代细胞融合率达85 %时，用0. 25 %胰酶-0. 02%EDTA进行酶解传代。
[0120] 调整细胞密度为lX105cell/mL，接种8mL至9cm平皿中，转移至细胞培养箱进行 培养4h。
[0121] 4h后，取出平皿，吸弃上清，加入新DMEM高糖+10%FBS培养基进行培养。
[0122] 继续培养4h至细胞贴壁，弃除培养液，贴壁的细胞为进一步纯化的间充质干细 胞。
[0123] 经检测，间充质干细胞纯度为93. 5%。
[0124] 实施例4
[0125] 观测实施例1~3和对比例1~2的细胞生长情况，并绘制细胞增殖曲线。其中， 对实施例1和对比例1~2细胞生长情况所绘制的曲线如图2所示。结果表明，实施例1 培养细胞的增殖速度显著优于对比例1~2。（p〈0. 05)
[0126] 实施例5
[0127] 原代培养12h后，细胞到达对数期，取处于对数生长期的羊水干细胞，调整细胞密 度为lX106cell/mL。按细胞悬液：0.4%台盼蓝=3:l(v:v)充分混匀，取20uL细胞混匀液 加入细胞计数板中，用Countstar细胞计数器进行细胞活率及体积检测。每组细胞检测3 次。对实施例1~3及对比例1~2培养后的干细胞的活力如表1所示：
[0128] 表1干细胞活力
[0129]
【主权项】
1. 羊水间充质干细胞的原代分离培养方法，其特征在于，包括： 步骤1 :明胶铺板后接种羊水组织细胞，培养Ilh~13h后转移培养液； 步骤2 :将所述培养液培养至细胞融合率不低于85%，获得初步纯化的细胞； 步骤3 :将所述初步纯化的细胞重悬，培养3h~5h后，更新培养基，继续培养至细胞贴 壁，弃除培养液，获得羊水间充质干细胞。
2. 根据权利要求1所述的原代分离培养方法，其特征在于，步骤1中所述接种的羊水组 织细胞密度为5 X IO5个/mL。
3. 根据权利要求1所述的原代分离培养方法，其特征在于，步骤1中所述培养的培养基 为Lonza完全培养基；步骤1中所述培养的温度为37°C，5% CO2、湿度为95%。
4. 根据权利要求1所述的原代分离培养方法，其特征在于，步骤1中所述培养的时间为 12h〇
5. 根据权利要求1所述的原代分离培养方法，其特征在于，步骤2中所述培养的时间为 72h〇
6. 根据权利要求1所述的原代分离培养方法，其特征在于，步骤3中所述重悬至细胞密 度为IX IO5个/mL。
7. 根据权利要求1所述的原代分离培养方法，其特征在于，步骤3所述重悬采用Lonza 完全培养基；步骤3中所述培养的温度为37°C，5% CO2、湿度为95%。
8. 根据权利要求1所述的原代分离培养方法，其特征在于，步骤3所述培养的时间为 4h，继续培养的时间为120h。
9. 根据权利要求1所述的原代分离培养方法，其特征在于，所述羊水组织细胞的获取 方法为：将羊水离心后取沉淀，以PBS缓冲液洗涤，获得羊水组织细胞。
10. 根据权利要求1~9任一项所述的原代分离培养方法，其特征在于，所述羊水组织 细胞为人羊水组织细胞。
【专利摘要】本发明涉及干细胞培养技术领域，尤其涉及羊水间充质干细胞的原代分离培养方法。本发明提供的方法，利用差速贴壁原理，在适宜条件下，使内皮细胞先贴壁生长，而此时间充质干细胞尚未贴壁。本发明准确控制培养时间，待内皮细胞贴壁完成后，转移包含羊水间充质干细胞的培养液。对培养液进行传代培养后获得羊水间充质干细胞。本发明提供的方法操作简单，无需更多的仪器，且无需人为刮除的操作，避免了细胞的损伤和污染。检测结果表明，步骤1中获得的培养液中所包含的羊水间充质干细胞的活力不低于89.28％，经传代3代，流式细胞检测结果表明，其表面抗体仍符合干细胞特性，未见分化趋势。
【IPC分类】C12N5-0775
【公开号】CN104830764
【申请号】CN201510289599
【发明人】葛啸虎, 陈海佳, 王一飞, 卢瑞珊, 王小燕, 李平, 马岩岩
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年5月29日