脐带来源间充质干细胞的培养方法及用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种脐带来源间充质干细胞的原代提取方法及在此基础上可获得大量的不涉及动物成分的间充质干细胞的传代培养操作方法，以及所述获得的间充质干细胞在自身免疫性疾病中的用途。
【背景技术】
[0002]间充质干细胞的自我更新及多项分化潜能，在组织损伤与修复中的应用越来越广泛。另外，其分泌的多种细胞因子，对人体的内分泌及免疫系统有重要的调节作用。间充质干细胞的来源从最初发现的骨髓，发展到脐带、脐带血、牙齿、胎盘、胚胎肝、脂肪等多种组织。但这些来源中，骨髓和脂肪来源取材给患者带来痛苦，而且骨髓中间充质含量小，骨髓源MSC细胞数量及增殖分化潜能随年龄的增大而下降，所以不适合广泛应用。胚胎来源的存在伦理问题。因而，经过多年实践，人们普遍认为脐带仍是间充质干细胞的最佳来源。取材方便，不给患者带来痛苦，没有伦理限制。而其他来源或多或少存在一些不尽人意的问题。
[0003]脐带间充质干细胞的基础和应用研宄越来越受到研宄者的青睐。脐带间充质干细胞的培养方法已有报道，包括组织贴壁法、酶消化法及两种细胞联合的方法。而每种方法的框架下，又有不同的操作细节。而且不同方法得到的干细胞的数量和质量也大不相同。如酶消化法:使用的酶包括胶原酶、胰酶等。消化液的浓度及消化时间对细胞的得率影响很大。此种方法操作步骤繁琐、时间长、污染几率大。组织贴壁法又有不同的方式及操作细节，对细胞的原代提取质量和数量及后续的传代效果都有一定的影响。再生医学的研宄和临床实践需大量的种子细胞，目前，大部分的细胞培养均添加胎牛血清，增加了动物成分的影响及各种动物病毒感染的危险。因此，寻找一种不含动物成分、易操作的、能普遍应用的、成本较低的、可安全应用于临床试验治疗的脐带间充质干细胞的培养方法具有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明提供了一种不含动物成分、易操作的、能普遍应用的、成本较低的可用于临床试验治疗的脐带源间充质干细胞的培养方法。另一方面，由于脐带源间充质干细胞具有免疫调节能力，本发明提供了脐带源间充质干细胞在血小板减少性紫癜(一种免疫性疾病)中的用途。
[0005]本发明的第一方面涉及一种无动物成分的脐带源间充质干细胞的培养方法，其包括如下步骤:
[0006]I)获得脐带组织，洗净，并剥离脐动脉和脐静脉；
[0007]2)在小烧杯中将来自步骤I)的脐带组织剪细成泥状；
[0008]3)用含血清替代物的培养基悬浮剪碎的脐带组织，离心后去上清；
[0009]4)使用不锈钢搅拌棒将剪碎的脐带组织混合均匀；
[0010]5)用塑料巴氏吸管将步骤4)中混合均匀的脐带组织吸取至细胞培养瓶中；
[0011]6)用不锈钢搅拌棒的平头一侧，力度较轻地将脐带组织摆成芯片点阵形状；
[0012]7)加入含血清替代物的培养基，培养；
[0013]8)用TrypLE解离酶消化细胞、传代到T182的培养瓶中，获得Pl代脐带源间充质干细胞。
[0014]优选地，根据本发明所述的方法，其中步骤2)的小烧杯是1mL烧杯。
[0015]优选地，根据本发明所述的方法，其中不锈钢搅拌棒一侧为圆柱状、另一侧制成扁平状，优选其长度为20-30cm。
[0016]优选地，根据本发明的方法，其中所述塑料巴氏吸管的开口直径为3_5mm。
[0017]根据本发明所述的方法，其进一步包括传代所获得的Pl代脐带源间充质干细胞的步骤。
[0018]根据本发明的方法获得的脐带源间充质干细胞在制备用于治疗过敏性紫癜的药物中的用途。
[0019]根据本发明所述的用途，其中所述脐带源间充质干细胞是P4代脐带源间充质干细胞。
[0020]一种用于从脐带组织分离脐带源间充质干细胞的装置，其包括1mL烧杯、不锈钢搅拌棒和塑料巴氏吸管，其中所述不锈钢搅拌棒一侧为圆柱状、另一侧制成扁平状，其长度为20-30cm ;所述塑料巴氏吸管的开口直径为3-5mm。
【附图说明】
[0021]图1:显示脐带组织剥离出2根脐动脉和I根脐静脉。
[0022]图2:显示在1ml小烧杯中剪碎脐带组织。
[0023]图3:显示用剪去尖嘴的巴氏吸管吸取脐带组织。
[0024]图4:显示用自制的不锈钢棒均匀分布脐带组织为点阵状。
[0025]图5:显示将培养瓶倒置，使脐带组织倒贴壁并加入培养基。
[0026]图6:显示原代培养8天时，观察组织周围有细胞爬出。
[0027]图7:显示细胞扩增生长布满整个瓶底。
[0028]图8A-8H:显示脐带源间充质干细胞流式细胞术检测鉴定的结果。
【具体实施方式】
[0029]下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
[0030]下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。
[0031]实施例1脐带源间充质干细胞的制备方法
[0032]1、主要试剂与耗材:
[0033]a-MEM培养基(Hyclone公司)，血清替代物(达科为公司，Hel1s UltraGROTM)。细胞解离酶TrypLETMSelect (Life公司)，生理盐水(巨能药业)，T75的细胞培养瓶(NEST公司，聚苯乙烯材质)，T182的细胞培养瓶(JET公司)，流式细胞术检测用抗体CD14、CD19、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-DR 及其同型对照购自美国 eb1science 公司。1ml小烧杯，自制不锈钢搅拌棒:制成细的、一定长度，其中，其直径为3-5mm，长度20_30cm，且能探入到培养瓶的底部角落；所述不锈钢搅拌棒一侧为圆柱状、另一侧制成扁平状，方便推动泥状的脐带组织，并将其均匀分布成点阵状，有利于细胞之间相互促进生长。本不锈钢棒能高压灭菌，方便操作，节约成本。塑料巴氏吸管(JET公司)，由于在吸取脐带剪后泥状组织时，用尖嘴无菌的枪头或吸管容易堵，所以，所述塑料巴氏吸管的尖嘴剪掉，使其开口为3-5mm，吸取方便，是比较简便的一次性无菌工具。
[0034]2、设备:
[0035]二氧化碳培养箱(美国THERMO公司371型)，倒置显微镜(日本OLYMPUS公司CKX41型)，大容量低速离心机(美国THERMO公司Multifuge 4KR)，