一种人胎盘来源间充质干细胞的分离、培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及干细胞的分离、培养，特别是一种人胎盘来源间充质干细胞的分离、培养方法。
【背景技术】
[0002]间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)因其自我更新、多向分化、造血支持、免疫调节等特性而具有很高的临床应用价值，近年来已成为干细胞领域的研宄热点，在用于解决多种血液系统疾病，心血管疾病，肝硬化，神经系统疾病，自身免疫性疾病等方面取得了重大突破。
[0003]MSCs最早发现于骨髓，目前，骨髓仍是MSCs的主要来源，但其获取途径具有侵入性，来源有限，并且骨髓来源的MSCs(bone marrow derived MSCs，BMSCs)数量、分化能力都会随供者年龄的增长而逐渐减少变差，从而限制了 MSCs的临床应用(Rao，2001; Grove,2004; D’Ippolito，1999)。Parolini (2008) ,Mihu (2008)等的研宄均证实，被当做医疗垃圾丢弃的人类胎盘中存在大量的MSCs(placenta derived MSCs，PMSCs)，研宄表明PMSCs主要存在于羊膜、绒毛膜等来源于胎儿的组织，并且与绒毛的分布密切相关，多分布于绒毛内皮下以及绒毛附近间质内。与BMSCs相比，PMSCs因取材方便、操作无侵入性、多向分化潜能大、增殖能力强、免疫原性低、病原污染风险低等优点而成为再生医学的重要细胞来源和最具临床应用前景的功能干细胞。通常，PMSCs表面⑶29 (0-整合素)、^44 (纤维蛋白和透明质酸盐受体)阳性，而CD34 (高度糖基化的i型跨膜糖蛋白)、CD45 (白细胞共同抗原)阴性，可用这些分子来鉴定PMSCs。
[0004]目前常用的PMSCs分离方法是将胎盘绒毛膜剪碎后直接用组织块法培养，或者使用胶原酶联合胰酶或DNA酶等消化获得细胞悬液后再以密度梯度离心法、流式细胞仪或磁珠分选法进行分离培养(陆琰，2009 ;吴洁莹，2005 ;李栋，2007)。
[0005]PMSCs的分离方法不同，分离效果也大相径庭，其中，组织块方法培养的原代细胞数量增长缓慢，且此混合细胞群中只有少量细胞符合MSCs的表面抗原表达特征；混合酶消化的方法需要对组织块进行多次消化，操作繁复，增加污染几率，并且容易造成细胞损伤；因为MSCs缺乏特异的表面标志，所以利用流式细胞仪或磁珠分选法会损失大量细胞，并且成本高。对于PMSCs的体外培养，目前大多添加胎牛血清(FBS)，但临床应用上不允许使用动物来源制品，只能选择昂贵的无血清专用培养基，从而造成细胞培养成本的大幅增加。
【发明内容】
[0006]针对现有常用的PMSCs分离方法中存在的问题与缺陷，本发明的目的是提供一种新的简化了的PMSCs分离，培养方法，可有效地克服现有分离培养方法的不足。
[0007]其解决问题的技术方案是:
一种人胎盘来源间充质干细胞的分离、培养方法，包括以下步骤:
步骤一:用大镊子取出胎盘，放入白瓷盘中，用生理盐水充分洗涤，用直剪刀将胎盘上残留的脐带剪掉，用手术刀将羊膜切除，将胎盘切割成四块，分装到15cm培养皿中；
步骤二:用酒精棉球擦拭胎盘母体面和婴儿面，用直剪刀将母体面组织剪掉留婴儿面备用;
步骤三:剥离出胎盘绒毛，用组织剪将之剪成l_3mm3大小的组织块后放入50ml离心管中，加入二倍体积的0.1%胶原酶I，置于37°C培养箱中消化15h备用；
步骤四:用100mlPBS (磷酸盐缓冲液)稀释步骤三消化液后200目滤网过滤，800g，15min离心收集细胞备用；
步骤五:弃上清后用PBS重悬细胞，500g，5min离心沉淀细胞；
步骤六:使用添加有5%组成为:3%-6%结合蛋白；0.5%-1.5%生长因子；0.5%-1.5% (组氨酸:脯氨酸3:1) ；0.03%-0.07%固醇类激素;0.1%-0.5%【(维生素B1:维生素B2:维生素B6:维生素B12 1:1:1:1):维生素C:维生素D:维生素E 1:1:1:1】；0.01%_0.03% (铁:锌:钼:钴2:2:1:1) ；0.5%-1.5%粘附因子；87.4%_95.36%去离子水的血清替代物MEM-α培养基重悬细胞并接种于1cm细胞培养皿中，于37°C、体积分数为5%C02培养箱内进行培养，3-4d后添加新鲜的含有5%血清替代物的MEM- α培养基，待细胞达到80%融合时用0.05%胰酶消化，传代培养；
步骤七:待细胞扩增至3-6X 17个时用0.05%胰酶消化，800g，15min离心收集细胞，用新鲜的含有5%血清替代物的MEM- α培养基重悬，加入冻存保护剂并使用程序降温仪冻存细胞，程序为:以1°C /min的速率降至-5°C后，以3°C /min的速率降至-20°C，再以1°C /min的速率降至-60°C，最后以5°C /min的速率降至_120°C，结束后放入液氮中冻存。
[0008]这种将绒毛剥出后再用胶原酶I 一步消化法分离PMSCs，能够减少操作步骤，减轻细胞损伤，有效提高目的细胞所占的比例，减少其他细胞的污染；这种细胞贴壁筛选方法，简单易行，并且能够逐代纯化细胞；使用含5%血清替代物的MEM- α培养基来培养细胞，能够将生产成本降低至少50% ;原代培养的细胞以集落方式生长，6-9d后接近80%融合，传代后细胞的生长速度明显加快，细胞形态较原代均一，呈均质长梭形，由细胞流式检测结果可知，在第一代细胞中，目的细胞的含量即可达到85%左右；从而缩短了细胞原代培养时间并使细胞纯度得到提高，能够大幅降低成本并能很好维持PMSCs原始状态，为PMSCs的大量制备以及将来广阔的临床应用打下了坚实的基础。
【具体实施方式】
[0009]以下结合【具体实施方式】对发明作出详细的说明实施例一
一种人胎盘来源间充质干细胞的分离、培养方法，包括以下步骤:
步骤一:用大镊子取出胎盘，放入白瓷盘中，用生理盐水充分洗涤，用直剪刀将胎盘上残留的脐带剪掉，用手术刀将羊膜切除，将胎盘切割成四块，分装到15cm培养皿中；
步骤二:用酒精棉球擦拭胎盘母体面和婴儿面，用直剪刀将母体面组织剪掉；
步骤三:剥离出胎盘绒毛，用组织剪将之剪成l_3mm3大小的组织块后放入50ml离心管中，加入二倍体积的0.1%胶原酶I，置于37°C培养箱中消化15h ；
步骤四:用100mlPBS (磷酸盐缓冲液)稀释后200目滤网过滤，800g，15min离心收集细胞； 步骤五:弃上清后用PBS重悬细胞，500g，5min离心沉淀细胞；
步骤六:使用添加有5%组成为:3%结合蛋白；0.5%生长因子；0.5%非必须氨基酸(组氨酸:脯氨酸3:1) ;0.03%固醇类激素；0.1%【(维生素B1:维生素B2:维生素B6:维生素B12 I:1:1:1):维生素 C:维生素 D:维生素 E I:1:1:1]；0.01% (铁:锌:钼:钴 2:2:1:I) ；0.5%粘附因子；95.36%去离子水的MEM- α培养基重悬细胞并接种于1cm细胞培养皿中，于37°C、体积分数为5%C02培养箱内进行培养，3-4d后添加新鲜的含有5%血清替代物的MEM- α培养基，待细胞达到80%融合时用0.05%胰酶消化，传代培养；
步骤七:待细胞扩增至3-6X 17个时用0.05%胰酶消化，800g，15min离心收集细胞，用新鲜的含有5%血清替代物的MEM- α培养基重悬，加入冻存保护剂并使用程序降温仪冻存细胞，程序为:以1°C /min的速率降至-5°C后，以3°C /min的速率降至-20°C，再以1°C /min的速率降至-60°C，最后以5°C /min的速率降至_120°C，结束后放入液氮中冻存。
[0010]实施例二
一种人胎盘来源间充质干细胞的分离、培养方法，包括以下步骤:
步骤一:用大镊子取出胎盘，放入白瓷盘中，用生理盐水充分洗涤，用直剪刀将胎盘上残留的脐带剪掉，用手术刀将羊膜切除，将胎盘切割成四块，分装到15cm培养皿中；
步骤二:用酒精棉球擦拭胎盘母体面和婴儿面，用直剪刀将母体面