人脂肪来源的间充质干细胞在肾脏、眼底疾病中的用途的制作方法

专利名称：人脂肪来源的间充质干细胞在肾脏、眼底疾病中的用途的制作方法
人脂肪来源的间充质干细胞在肾脏、眼底疾病中的用途
技术领 域本发明一般涉及间充质干细胞的用途。具体而言，本发明涉及人脂肪来源的间充 质干细胞在肾脏和/或眼底疾病中的用途。
背景技术：
间充质干细胞(MSCs)由于其自我更新和多系分化的能力，被广泛应用于多种疾 病的研究，人脂肪来源的MSCs (hAD-MSCs)由于其易获得，易扩增且具有与骨髓源MSCs具有 类似的分化潜能，近年来成为再生医学领域最为热门的种子细胞。急性肾损伤以及由此引发的肾脏纤维化，是临床上常见的病理过程。无论是各 种原发性肾小球疾病，还是糖尿病肾病、狼疮性肾炎等继发性肾脏疾病都与肾脏纤维化 病变的程度密切相关。这些疾病能引起肾小管上皮细胞的凋亡、基底膜断裂、肾间质炎 性细胞的浸润、肌成纤维细胞的聚集，并在一些促纤维化因子的参与下，使细胞外基质 (extra-cellular matrix, ECM)成分生成增多、降解减少，肾间质纤维化产生，导致肾功能 严重受损。目前临床上对肾脏纤维化的治疗措施多集中在控制加剧肾功能恶化的危险因 素，如高血压、高血糖、高血脂、高蛋白摄入等方面，而这不能从根本上改善病人的预后。视网膜变性疾病是眼科主要的致盲性疾病，代表疾病为视网膜色素变性 (retinitis pigmentosa, RP) 0视网膜色素变性为常染色体隐性遗传为主的遗传性疾病。 通过病理学观察目前普遍认为，其主要致病机理为视网膜色素上皮细胞对视细胞外节盘膜 的吞噬消化功能障碍，致使外节盘膜崩解物残留，堆积形成一层障碍物妨碍营养物质从脉 络膜到视网膜的转运，从而引起视细胞的进行性营养不良及逐渐变性和消失。但是引发这 一过程的原因，目前还不清楚，可能与基因异常、某些酶的缺乏及代谢障碍有关。目前临床 对视网膜色素变性治疗仍局限于使用血管扩张剂、维生素类、组织疗法、神经营养、各种激 素等保守治疗手段以延缓病情进展，还没有行之有效的针对性治疗手段。糖尿病视网膜病变(diabetic ratinopathy，DR)是糖尿病最常见和严重的并发症 之一。世界卫生组织公布，糖尿病视网膜病变是全世界导致视力缺损和失明的第二大因素。 在美国，糖尿病视网膜病变占40岁以上成人失明原因的25%，糖尿病患者致盲的危险性是 非糖尿病的25倍。世界卫生组织已经将糖尿病视网膜病变确定为在世界范围内造成视力 损害及失明的一个主要原因。长期以来，科研人员对DR的发病机制进行了大量的研究，但 迄今为止尚未完全阐明。特发性黄斑裂孔是正常眼自发形成的黄斑全层神经上皮缺失，不伴有眼外伤和其 他原发病因，其发病机制仍未完全阐明。从上个世纪70年代开始，人们一直致力于黄斑裂 孔治疗的研究。并大幅提高了裂孔解剖闭合率。然而目前已发表的大规模临床研究文献 中，并没有提出能够达到100%裂孔闭合率的方法。分期较晚、裂孔重复裂开的复杂黄斑裂 孔仍然是眼底疾病治疗的难点之一。但目前还没有将hAD-MSCs应用于眼底疾病移植治疗 的文献发表。因此，人们一直寻找治疗肾脏损伤相关疾病和眼底疾病的新的药物和治疗方法。

发明内容
本发明的一方面提供人脂肪来源的间充质干细胞在制备治疗肾脏和/或眼底疾 病的细胞制剂中的用途。本发明中，人脂肪来源的间充质干细胞可治疗的肾脏疾病包括急性肾损伤、肾脏 纤维化、肾小管上皮细胞损伤。本发明中，人脂肪来源的间充质干细胞可治疗的眼底疾病包括视网膜变性、糖尿 病视网膜病变、视网膜裂孔。优选地，本发明人脂肪来源的间充质干细胞可治疗的视网膜变性为视网膜色素变 性。在本发明中，用于治疗肾脏和/或眼底疾病的细胞制剂可包含的人脂肪来源的间 充质干细胞数目可根据公知技术确定，优选地，每单位细胞制剂可包含1XIO5至1 X IO6个 人脂肪来源的间充质干细胞。本发明中，治疗肾脏和/或眼底疾病的细胞制剂具有本领域公知的含义，例如用 于治疗肾脏和/或眼底疾病的细胞制剂可以使用本发明提供的人脂肪来源的间充质干细 胞作为种子细胞。本发明的细胞制剂还可以包括用于治疗肾脏和/或眼底疾病所需要本领 域公知的其他成分，如适合患者接纳的材料或基质，该基质可作为细胞移植用的三维模板， 具有特定的孔径，例如申请日为2004年6月7日的中国发明专利号为200480019202. 5，授 权公告号为CN100447186C的发明专利中所描述的基质。还可以包括生物可降解聚合物如 白蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白、明胶等，并制作成治疗用途的试剂盒的形式。本发明的细胞制剂满足本领域技术标准，例如符合国家食品药品监督管理局《人 体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》等相关标准。优选地，本发明提供的人脂肪来源的间充质干细胞的免疫表型为⑶11a，⑶31， CD34, CD45, HLA-DR 为阴性，CD29, CD44, CD105, CD166, Scar-1, Flk-I 为阳性，并且低表达 MHC II类分子。本发明所提供的细胞制剂优选地为静脉注射剂。在视网膜眼底裂孔的治疗中，本发明所提供的细胞制剂优选地为视网膜下注射 剂。


图1.流式细胞检测hAD-MSCs表型及周期。A :hAD_MSCs表型。B 第三代hAD_MSCs 细胞形态(200X)。C hAD-MSCs细胞周期。图2.病理学观察。H&E染色结果显示，移植组3天(B)，对照组3天(A)，移植组 21天(D)，对照组21天(C)，对照组6个月(E)，移植组6个月(F)，标尺为50 μ m。 图3. Masson染色显示胶原沉积。A 对照组10天；B 移植组10天；C 对照组6 个月；D 移植组6个月。E :I/R后10天和6个月移植组的胶原沉积量明显低于对照组，(ρ < 0. 05)。标尺为 50 μ mo 图4. hAD-MSCs和mBM_MSCs在损伤肾脏组织中的分布。A =RT-PCR检测人特异性 β -actin表达，I/R后3天(3)，10天(5)，6个月(7)移植组肾脏被检测，正常C57BL/6小鼠和同一时间点对照组肾脏(1，2，4，6)作为对照，hAD-MSCs作为阳性对照(8)。菲立磁的 普鲁士蓝染色显示，I/R后3天(B)，肾脏皮质区小管⑶和间质(H)处有呈蓝色颗粒样的 阳性细胞存在，10天结果与三天类似(C)。抗人核抗体检测结果与之类似(E，I)。β-gal, 绿色荧光蛋白抗体分别检测Rosa鼠(F，G)和EGFP转基因小鼠(J，K)来源的供体MSCs细 胞的分布情况。L-O为阴性对照。标尺为50 μ m。图5.植入的hAD-MSCs在I/R模型肾脏中分化为肾小管上皮细胞。免疫荧光双染 显示，移植组3天肾脏中检测到抗人核阳性的供体细胞(红色荧光)，同时表达上皮细胞的 标志pan-CK (绿色荧光)(A-C)。对照组肾脏作为阴性对照(D-E)。标尺为50um。G =RT-PCR 检测，1，正常C57BL/6小鼠肾脏；2，hAD-MSCs ；3，对照组3天；4，移植组3天；5，HK2细胞。 标尺为50 μ m。图6.体外诱导培养hAD-MSCs可以分化为上皮样细胞。A 诱导前梭形hAD-MSCs ； B hAD-MSCs诱导后呈多变形上皮样；抗CK18抗体免疫荧光染色诱导后见阳性细胞(C，绿 色荧光)，诱导前hAD-MSCs，作为阴性对照(D)0 RT-PCR检测诱导后细胞表达CD18 (2)， hAD-MSCs为阴性对照(1)，HK2为阳性对照(3)。标尺为50 μ m。图7.移植细胞剂量与植入比例的关系。用人特异性β -actin进行RT-PCR检测， 低剂量组和高剂量组的供体细胞植入比例没有显著差别。P < 0. 05。图8. hAD-MSCs促进肾脏增殖。抗小鼠PCNA单克隆抗体免疫组化染色，阳性细胞 为棕色核阳性。A，B, C，D分别为对照组3天、移植组3天、对照组10天、移植组10天。免 疫荧光双染抗人特异性核抗体(红色荧光)和抗PCNA抗体(绿色荧光)，E-G为移植组3 天，H-J为对照组3天。标尺为50 μ m。图9. hAD-MSCs促进肾脏BMP7高表达。抗小鼠BMP7单克隆抗体进行免疫组化染 色，DAB显色，苏木素复染，阳性细胞为棕色胞浆染色。A，B分别为对照组1天和移植组1天； C，D为对照组3天和移植组3天。E =RT-PCR结果显示I/R后1天和3天移植组BMP7表达 明显高于对照组。标尺为50 μ m。图10 病理学观察。hAD-MSCs移植后1天，移植组(B)和对照组(A)视网膜病理 结果显示破坏程度没有差别；移植后1周对照组(C)外核层出现塌陷，移植组破坏程度较轻 (D)；随后2周、3周、6周移植组(F，H，J)的损伤修复情况均好于对照组(E，G，I)。标尺长 度为50 μ m。图11 hAD-MSCs的植入和分化。A-C 抗人核阳性的供体细胞(红色荧光)同时表 达RPE特异的标志MITF (绿色荧光)；D-F:抗人核阳性的供体细胞(红色荧光)同时表达 感光细胞特异的标志Rhodopsin (绿色荧光)；G-I 抗人核阳性的供体细胞(红色荧光)同 时表达血管内皮细胞特异的标志vWF (绿色荧光)。标尺为50 μ m。图12. hAD-MSCs对BRB功能的影响。STZ模型小鼠的BRB出现渗漏，造模后3个月 BRB功能一直处于异常状态。移植组从移植后1周开始，BRB功能有所恢复，之后的2周，4 周BRB功能逐渐恢复到正常水平(ρ < 0. 01)。 图13. hAD-MSCs对血糖的影响。与对照组相比较，移植组的血糖从移植后1周下 降，到移植后4周，血糖水平接近正常值(ρ < 0. 01)。图14. hAD-MSCs的植入和分化。A-C 抗人核阳性的供体细胞(红色荧光)同时表 达感光细胞特异的标志Opsin (绿色荧光)，标尺长度50 μ m ；D-F 抗人核阳性的供体细胞(红色荧光)同 时表达胶质细胞特异的标志GFAP (绿色荧光)，标尺长度50 μ m。图15. OCT观察。兔眼行裂孔术后的OCT检查的结果A，2天；C，4天；E，12天；G， 20天；移植组分别为=B, 2天；D，4天；F, 12天；H, 20天。图16.病理结果。术后1个月，H&E染色显示，移植组(A)裂孔处组织略高于两 侧正常视网膜，可见细胞不规则排列；对照组(B)裂孔处低于正常视网膜组织，细胞排列无 序。C为正常兔眼视网膜结构。标尺为50 μ m。图17.裂孔处细胞免疫荧光染色。术后1个月对照组裂孔处主要为GFAP阳性的 胶质细胞(A)，未见Opsin阳性和PKC阳性的细胞(D，G)；移植组除大量GFAP阳性的胶质细 胞外(B)，还可观察到少量Opsin阳性(E)的感光细胞，极少量PKC阳性的双极细胞(H)；正 常视网膜的GFAP (C)、Opsin (F)和PKC染色(I)。标尺为50 μ m。图18. hAD-MSCs在视网膜裂孔的分布分化。hAD_MSCs移植后4周，可见少量抗人 核阳性(红色荧光)供体细胞位于视网膜内核层，并且表达胶质细胞的标志GFAP(绿色荧 光)(A-C)。标尺为10 μ m。尚可见可见少量抗人核阳性(红色荧光)供体细胞位于视网膜 外核层，并且表达感光细胞的标志Opsin (绿色荧光)(D-F)。标尺为50 μ m。
具体实施例方式本发明中使用的仪器和试剂均是本领域技术人员公知的，可通过商业机构购买获 得。本发明所使用的方法，如HE染色、Masson三色染色、免疫组化、菲立磁染色、免疫荧光 染色等均为本领域公知的方法，可通过教科书或相关文献的描述进行，本发明说明书中有 描述的，参照本发明中描述的方法进行。实施例1 相关实验方法1. 1、人脂肪来源的MSCs培养及扩增取成人的脂肪组织，用D-Hank’ S液反复冲洗，剪碎，0. 2% I型胶原酶37°C，消化 30分钟，用大量D-Hank，S液洗涤终止I型胶原酶的作用，离心1000r/m，IOmin后，用100 目的滤网过滤，并用移液管反复吹打，使之成为单细胞悬液，计数，接种密度为2X 106/ml， 用完全培养基(含 58% DMEM/F12+40% MCDB-201、2%胎牛血清(FCS)、10ng/ml EGFUOng/ ml PDGFUX 胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸(Insulin-Transferrin-Selenium，ITS)、1 X 亚油 酸-牛血清白蛋白(linoleic acid-bovineserum albumin, LA-BSA)，50 μ M β 巯基乙醇， 2mM L-谷氨酰胺，100 μ g/ml青霉素和100U/ml硫酸链霉素)，置37°C，5% CO2培养箱培养， 1天后换液，弃去未贴壁的细胞，以后每三天半量换液。当细胞达80 90%融合(约10天 左右)时，0.25%胰酶常规消化传代。1. 2、小鼠骨髓来源的MSCs的分离与培养1、动物骨髓的取材。(1)用颈椎脱臼断颈法处死小鼠。在无菌条件下取股骨和胫骨，除去骨表面附着的 肌肉组织，用D-Hank’ s液浸泡(或其它细胞培养用的平衡盐溶液，添加青霉素100IU/ml， 链霉素 100ug/ml)。(2)用器械去除股骨近端和胫骨远端，暴露骨髓腔。然后除去股骨、胫骨另一端的 骨骺，并用Iml注射器在骨端的生长面上开一个小孔。(3)用Iml注射器吸Iml含血清的基础培养液，将针头从上述小孔插入骨髓腔中，注入培养液，从骨的另一端收集冲洗出来的骨髓。(4)将收获的全部骨髓用注射器反复抽吸，以打散组织成为细胞悬液。(5)收集细胞悬液，离心。用干细胞培养液重悬沉淀的细胞。2、接种及培养 (1)用干细胞培养液调节细胞密度。将6X IO7个骨髓有核细胞接种到T25培养瓶 中。在37 °C、5 % CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养。(2)原代接种后24小时，除去未贴壁的造血细胞，用D-Hank’S液换洗，半量换液。 以后每隔3 4天换液1次。(3) 12 14天后，当形成一些较大的细胞克隆时，用D-Hank’S液将培养的细胞洗 2遍。加入0. 25%胰酶(含0. 01 % EDTA)消化液，室温消化，显微镜下观察，待细胞变形时， 用含血清培养液或牛血清终止胰蛋白酶的作用。(4)用吸管轻轻吹打培养瓶的细胞贴附面，使细胞从培养瓶壁上脱离下来，制成细 胞悬液。(5)将细胞以培养基重悬，将悬液接种到新的培养瓶中，于37°C、5% CO2、饱和湿度 的CO2培养箱中培养。待传代的细胞生长密度达到80% 90%时，即再次传代。1.3、细胞周期的测定将人脂肪来源的间充质干细胞消化计数，1 X IO6细胞，70%冷乙醇4°C固定30min， PBS液洗涤细胞二遍，5 μ g/ml PI室温染色5min，用流式细胞仪(FACSVantage型)检测， ModFIT软件分析结果。1. 4、流式细胞仪鉴定细胞的表型用间接免疫荧光法检测成人脂肪来源的MSC的免疫表型。针对细胞表面抗原，细 胞用胰酶消化后，用含0. 5 %的牛血清白蛋白的PBS冲洗，加入一抗4°C孵育30min。一抗为 小鼠抗人的单克隆抗体CD105、CD29、CD34、CD31、CD44、CD45、HLA-DR、Flk-I。为检测细胞 内抗原Flk-I，细胞与一抗孵育之前，用1 %多聚甲醛4°C固定15min，并在室温下用0. 1 %的 皂角素透膜1小时。我们选用同种同型非相关IgG抗体作为阴性对照。细胞用洗液PBS洗 过后，加入FITC标记的二抗4°C孵育30min。细胞洗两次，并悬浮在500ul的PBS中，置于 冰上待流式细胞仪检测。1. 5、hAD-MSCs体外诱导为上皮样细胞分离C57BL/6小鼠的肾小管上皮细胞，以5X105/ml密度重悬于DF12培养基中。 经IOGy照射后，置于培养箱中培养12小时。收集上清，与DF12以1 4比例混合，加入 20ng/mlHGF、10ng/mlFGF-4和2%胎牛血清作为诱导培养基。将第三代hAD-MSCs以2X IO4/ cm2密度接种，培养3周。未经诱导的hAD-MSCs作为阴性对照，人肾小管上皮细胞系HK2作 为阳性对照。1. 6、肾脏损伤模型和MSCs输入雄性C57小鼠分为2组(20只/组)，8周龄，1 %戊巴比妥钠腹腔麻醉，用无菌剪在 腹部右侧剪开2cm左右的切口，暴露右侧肾脏及周围组织，用无损伤血管夹钳夹右侧肾蒂， 计时，在35分钟松开血管夹，恢复血流。关闭腹腔，缝合切口。术中以及关腹前用无菌生理 盐水补充液体。术后24小时内，移植组的小鼠经尾静脉注射第3-5代的MSCs，lX106/只； 对照组术后仅尾静脉输注等量的生理盐水。分别在I/R后3天、10天、3周、2个月和6个月断颈处死小鼠，取出右侧肾脏，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片。另外一组肾脏则用液 氮冷冻，保存用于提取总RNA。1. 7、视网膜变性大鼠模型的建立及hAD-MSCs植入Lewis大鼠60只，80_100g，雄性，按50mg/Kg碘酸钠的剂量经尾静脉注射1 %碘 酸钠液，一周后随机分为6组，每组中5只大鼠经尾静脉注射hAD-MSCs细胞悬液1ml，约 1 X IO7个hAD-MSCs，另5只大鼠注射等量的PBS液Iml作阴性对照。移植后1天、1周、2周、 3周、6周和3个月，分别将一组大鼠过量麻醉处死，手术显微镜下观察大鼠眼底情况。摘除 眼球，10%中性福尔马林溶液固定过夜，去除眼前节，梯度脱水，石蜡包埋，将眼球12点位 置向上做冠状连续切片，分别作HE染色、免疫荧光检测和免疫组化检测。1. 8、STZ诱导的大鼠糖尿病模型的建立及hAD-MSCs植入60只大鼠空腹12h后，按60mg/kg的剂量腹腔一次性注射2% STZ溶解于的柠檬 酸缓冲液，PH值4. 2-4. 5)，7日后测血糖> 16. 7mmol/L，尿糖+++或++++者确定为糖尿病 大鼠模型。模型建立3月后，移植组尾静脉注射hAD-MSCs，IX IO7/只，0. 5ml ；对照组以等量 的生理盐水注射。1. 9、兔视网膜裂孔模型的建立及hAD-MSCs植入1、动物麻醉速眠新Iml肌肉注射，3%戊巴比妥Iml耳缘静脉注射行基础麻醉，盐酸丁卡因滴 眼液滴眼表面麻醉。2、手术操作手术器械高温消毒。连接灌注、气液交换设备及玻璃体切除设备。将动物置于显 微手术操作台上，置左眼于手术显微镜操作视野下，铺巾，充分散瞳。置开睑器将眼睑撑开， 用眼科剪打开结膜，固定镜环，安放眼底镜。在手术显微镜下检查眼底有无异常。用尖刀于 耳侧距角膜缘2. 5mm处做巩膜切口，固定灌注头。于鼻侧同样位置插入玻璃体切割头，在手 术显微镜直视下充分切除玻璃体。玻切频率450HZ，最大吸力400mmHg。玻璃体切除干净 后，于视盘下方约2. Omm处，将毛细玻璃管小心插入视网膜下，缓慢注入生理盐水，形成约 1. 5mm大小小泡，插入笛针垂直抵于小泡上，用最大负压快速吸引，形成约1. 5mm左右大小 视网膜缺失。打开气液交换开关，设送气压力40mmHg，充分气液交换，笛针吸引使网膜复位。 取出灌注头，缝合巩膜切口、结膜。涂抹红霉素眼膏预防感染。3、hAD-MSCs移植将细胞悬液混勻，用微量注射器吸取人hAD-MSCs悬液至需要 量，换气镜检查眼底，在手术显微镜直视下将微量注射器于巩膜切口处小心插入。在裂孔表 面缓慢注入hAD-MSCs悬液10 μ 1，细胞数约1 X IO5。4、对照组换用另一只微量注射器注入10 μ 1生理盐水，方法同上。5、术中眼底检查术中手术显微镜下观察可见裂孔处网膜缺失，脉络膜血管较正常，视网膜处更清 晰，裂孔周围Imm范围内网膜稍隆起，该处脉络膜血管模糊不清。注入hAD-MSCs后，在玻璃 体内，网膜孔及附近网膜上方可见浑浊细胞悬液。1. 10、OCT和眼底检查 手术后第2、4、8、12、20和32日对每只术眼行三维OCT检查，扫描范围裂孔周围6mm视网膜。每只眼不同时间均取裂孔中心同一平面截取二维视网膜裂孔OCT图像，比较 不同天数裂孔处视网膜厚度变化。比较相同天数hAD-MSCs移植组与对照组裂孔形态异同。 同时拍摄眼底彩照。1.11、RT-PCR1、将冻存的组织研磨碎后放入1. 5mLEp管中。2、加入Trizollml于Ep管中震荡。3、加入氯仿200 μ L，剧烈震荡15s，静置20min。4、12000rpm，离心 15min。5、移取上清至新的Ep管中，加入等量异丙醇，混勻后静置IOmin。6、12000rpm，离心 lOmin。7、去上清，用75%乙醇700ul洗沉淀，7500rpm离心5分钟，弃上清，控干。加入去 离子水溶解RNA。8、测量RNA的纯度和含量。9、取 2yL cDNA 模板，力口入 buffer 2 μ L, Mg2+(50mM) 1. 2μ L,5'和 3'引物各 1 μ L, dNTP 2 μ L，Taq酶0.2 μ L，纯水10. 6 μ L，进行PCR反应。所用引物分别为β-actin F，5，-GCT CCT CCT GAG CGC AAG TA-3，R，5， -GAT GGA GGG GCC GGA CT-3，CK18 F，5，-CGC ATC GTC TTG CAG ATC GAC—3，R，5， -GCT GAG ACC AGT ACT TGT CCAG-3，human β—actin F，5，-CTG GAA CGG TGA AGG TGA CA—3，R，5， -AAG GGA CTT CCT GTA ACA ATG CA-3，PCR条件为94°C IOmin ；94°C变性 40s，60°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，循环 34 次； 最后72°C延伸lOmin。10,PCR结果进行2%的琼脂糖凝胶电泳，电压75伏，时间30min。观察电泳结果。1. 12、实时定量 RT-PCR我们应用Takara公司SYBR Premix Ex Taq 试剂盒，在ABI7500实时定量PCR 仪上进行Real time RT-PCR实验。为了防止提取的总RNA中污染基因组DNA，对实验结果 产生干扰，我们所用的引物对均跨越内含子，引物序列如下human β-actin F，5，-CTG GAA CGG TGA AGG TGA CA-3，；R，5， AAG GGA CTT CCT GTA ACA ATG CA—3，；BMP7F，5，-ACG GAC AGG GCT TCT CCT AC-3，，R，5， -ATG GTG GTA TCG AGG GTG GAA—3，。反应在25μ 1 体系中进行，包含 1μ 1 模板 cDNA，12. 5μ 1 2XSYBR Green I MasterMix, 0. 5μ 1 ROX校正染料，200nM上、下游引物。条件为95°C预变性IOs ；95°C变性 5s，60°C退火，延伸40s，循环40次。反应结束后，溶解曲线分析和琼脂糖电泳证实产物的特 异性，每对引物的反应均包括一个无模板对照。我们以0-皿^11为内参，1 ^-7-(3为校正 器(calibrator)，采用2_[Δ 法来计算MCF_7_ih细胞基因表达的相对值，公式如下基因 的相对值=2_[ΔΔα]，AACt= ACtsample-ACtcalibrator ； Δ Ct = Ctgeneofinterest-Ct 0_actinO 我们 对每份模板的每个基因都设置了 3个重复孔，独立的实验重复至少3次。
1. 13、伊文思蓝法1、制备 伊文思蓝在甲酰胺中不同浓度的标准曲线。2、按1. 33ml/kg腹腔注射3%戊巴比妥钠溶液麻醉。3、麻醉后将大鼠固定在解剖台上，钝性分离右侧颈静脉和颈动脉，分别留置静脉 和动脉插管，用100IU/ml的肝素盐水润管。4、按45mg/kg的剂量从右侧颈静脉注射伊文思蓝染料，10秒钟注入。5、2分钟后通过颈动脉取血0.2ml。6、注射后每20分钟从颈动脉插管取血0. 2ml，直到120分钟时自左心室取血得到 最终血浆浓度；7、打开大鼠胸腔，左心室灌注37 °C的柠檬酸钠缓冲液(pH值4. 5)，压力为 1 OOmmHg，2 分钟；8、灌注后立即取出大鼠眼球，显微镜下分离出视网膜；9、视网膜在烘箱钟干燥1小时，称重后将视网膜置于0.3ml甲酰胺溶液钟，70°C保 温10小时；10、4°C离心，l2000rpm，45 分钟，取出上清；11、取50ul上清用分光光度计测量620nm和720nm的吸光光度值，计算净A值= A620nm-A720nm ；12、将各次动脉血标本混勻，4°C离心10000rpm，20分钟，取上清液，用甲酰胺稀 1 500稀释，分光光度计测量，同上；13、依照标准的伊文思蓝在甲酰胺钟的公式，计算各个标本中伊文思蓝的浓度；根据下列公式计算BRB损伤情况
伊文思蓝(Hg) /视网膜重量(g)_
伊文思蓝的血浆平均浓度(ug) /血浆(ul) x2 (h)实施例2 人脂肪来源的间充质干细胞在肾脏缺血再灌注模型中的作用及机制的 研究2. 1、培养的hAD-MSCs的形态和表型从人脂肪中分离得到的MSCs在原代培养中，有两类细胞，一种为成纤维细胞样， 分散生长；另一种为内皮细胞样，呈多角形，紧密生长。经过传代，内皮样细胞逐渐减少，传 至第2代时，基本消失，视野中都为梭形细胞(图1.B)。流式表型分析，hAD-MSCs高表达 ⑶29、⑶44、⑶105和Flk-I，而造血及内皮标志(⑶31、⑶34和⑶45)为阴性，并且其低表达 MHC II类分子(图1. A)。细胞周期分析发现，多数hAD-MSCs都位于G0/G1期(图1. C)。 我们分离培养的hAD-MSCs，具有多系分化潜能，免疫表型⑶11a，⑶31，⑶34，⑶45，HLA-DR 结果为阴性，⑶29，⑶44，⑶105，⑶166，Scar-1, Flk-I为阳性，体外诱导分化结果显示， hAD-MSCs在体外可以分化为上皮样的细胞，与体内实验结果一致。2. 2、人脂肪来源的MSCs在I/R模型中的作用2. 2.1、病理结果我们的实验采用了肾脏缺血再灌注模型，模型小鼠分为两组，移植组和对照组，分 别在损伤后24小时内，经尾静脉注射给予1 X 106hAD-MSCs和等体系的生理盐水。移植后3天、3周、以及6个月，分别取两组小鼠的右侧肾脏进行病理检测。H&E染色后观察发现I/R 后3天，对照组肾脏近曲小管出现水肿，周围有炎细胞浸润，但是没有显著的坏死(图2. A)； 而移植组肾脏形态结构基本正常(图2. B)。3周后，对照组肾间质区大量炎症细胞浸润，小 管上皮细胞坏死，小管结构丧失，出现纤维化(图2. C)；而移植组，肾间质区仅有少量炎症 细胞，小管结构完整(图2. D)。造模后6月，移植组的肾脏结构基本修复(图2. F)，而在对 照组肾脏切片中可见肾小球聚集，形成纤维化修复(图2. E)。2. 2. 2、胶原染色为了定量评估两组小鼠的纤维化症状，进一步进行Masson三色染色，并通过胶 原沉积面积与组织总面积的比值(胶原沉积率)量化评估纤维化程度(图3. E)。结果显 示，I/R后10天处死的小鼠(对照组)肾脏出现大量胶原沉积(图3. A)，胶原沉积率为 0. 37549士0. 03111 ；而在缺血再灌注损伤后给予hAD_MSCs治疗的小鼠肾脏，10天后胶原 量明显较对照组少(图3. B)，胶原沉积率为0. 10997士0. 02045 ；相应的，I/R六个月移植 组的胶原沉积量为0. 54712 士0. 03190 (图3. D)，远远低于对照组的0. 19217 士0. 06067 (图
3.C)。由此可见，供者来源的hAD-MSCs植入一定程度上改善了肾脏缺血再灌注损伤的小鼠 肾脏组织，并且能够减少胶原分泌积聚，有效的抑制了纤维化的形成。2. 3hAD-MSCs的植入与分化2. 3. 1、hAD-MSCs在模型小鼠肾脏组织中的分布我们将菲立磁标记的人脂肪来源的间充质干细胞(hAD-MSCs)移植到I/R模型小 鼠中。RT-PCR结果显示，I/R后3天和10天，移植组肾脏表达人特异性的β-actin(图
4.A)。菲立磁的普鲁士蓝染色显示，I/R后3天，肾脏皮质区小管(图4. D)和间质(图4. H) 处有呈蓝色颗粒样的阳性细胞存在，10天结果与三天类似(图4. C)。因此我们选择3天这 个时间点进行检测。通过免疫组化方法，用抗人核抗体检测人源细胞在小鼠肾脏的分布，结 果与之类似(图4. E，I)。为了与研究报道有所比较，我们分别将Rosa鼠和EGFP转基因小鼠骨髓来源的间 充质干细胞(mBM-MSC)，输注到缺血再灌注损伤的模型鼠，分别定义为Rosa移植组(Rosa mice-donor group)和 GFP 移植组(EGFP mice-donor group)。分别在 I/R 后 3 天取各组的 肾脏组织进行检测。通过免疫组织化学方法，用β _gal，绿色荧光蛋白抗体分别检测Rosa 鼠(图4. F，G)和EGFP转基因小鼠(图4.G，K)的供体MSCs细胞的归巢情况，如图所示， I/R后3天在肾皮质小管及间质处均可以看到阳性细胞分布。上述实验结果提示植入受损肾脏组织的异体MSC可植入到在受损肾脏的间质和 皮质区小管。2. 3. 2、植入到肾脏的hAD-MSCs表达小管标志 在上面的结果中，观察到植入的MSC分布在肾脏小管和间质中，为了进一步验 证处于小管位置的外源性细胞的确分化为小管上皮细胞，用pan-CK和抗人核抗体对 hAD-MSCs移植后3天的肾脏组织切片进行免疫荧光双染，结果显示，分布于小管的抗人核 阳性的供体细胞(红色荧光)pan-CK染色同时呈阳性结果(绿色荧光)，表明体内注射MSC 可以分化为肾脏小管上皮细胞(图5.A-C)。为了验证这一结果，用RT-PCR的方法检测移 植后3天的肾脏组织，结果显示，在移植后3天，移植组的人特异的β -actin表达，且同时 表达人特异的上皮表达基因CK18 ；对照组显示为阴性(图5. G)。说明我们移植到受体鼠的hAD-MSCs可以分布到缺血再灌注损伤的肾脏，并且表达上皮特异基因。上述结果表明移植 到受损肾脏组织的hAD-MSCs可以直接分化为肾小管上皮细胞，参与对损伤肾脏的修复。2. 3. 3、MSC可在体外诱导为上皮样细胞因为对于MSC是否可以分化为肾小管上皮等上皮细胞存在较大争议，将hAD-MSC 扩增后以肾小管上皮诱导培养基培养3周，光学显微镜观察可见，经诱导的细胞形态明显 改变，梭形细胞逐渐变短，最终成为典型的上皮样多边形细胞(图6. B)，免疫荧光显示约 60%的细胞表达pan-CK(图6. C)，同时RT-PCR结果显示CK18表达阳性(图6. E)。这部分 结果证实了 MSC细胞群具有向上皮分化的潜能，与体内结果相互印证。2. 3. 4、植入细胞数量与分布比例的关系在确认了 hAD-MSCs在肾脏组织损伤早期确实能够植入，并且能够分化为肾小管 上皮细胞之后，我们猜想，引发对于细胞是否直接分化的争论的根源可能与移植数量相关。 我们分别将1 X IO5和1 X IO6个菲立磁标记的hAD-MSCs经尾静脉移植到模型鼠中，移植后 三天取材，进行普鲁士蓝染色和相对定量real time PCR检测。普鲁士蓝染色显示，两组切 片的阳性细胞均在肾脏小管和间质分布，与之前结果相同，而高剂量组切片上阳性细胞数 量高于低剂量组，但以半定量RT-PCR量化结果发现，高剂量组人来源的看家基因表达量虽 然较低剂量略高，但没有统计学差异(图7)。以上结果说明移植细胞的数量与MSC在肾脏 组织分布有一定的比例关系，但是对于细胞分布和分化的性质不产生根本影响。2. 4促进增殖2. 4. 1、分化的hAD-MSCs并非直接参与修复的主要成员我们用PCNA抗体检测了肾脏缺血再灌注后移植组和对照组细胞增殖的情况。免 疫组化结果显示，I/R后3天，接受hAD-MSCs移植的小鼠(移植组)肾脏增殖细胞的数目 (图8. B)明显高于对照组(图8. A)；而到第10天，实验组增殖细胞的数量减少(图8. D)， 对照组明显增加(图8. C)。这一结果表明，hAD-MSCs的确能够通过促进增殖，加快肾脏组 织修复。为了确定向肾小管上皮分化的hAD-MSCs是否直接对受损肾脏进行了替代性修复， 这些增殖的细胞是否即是向肾小管上皮分化的hAD-MSCs，我们进行了 PCNA和抗人核抗体 的免疫荧光双染。染色结果显示，双阳性的细胞占的比例很少，也就是说供体细胞本身很少 在大量增殖，但同时也可以观察到，供体细胞较多分布的区域与增殖细胞较多分布的区域 是吻合的(图8. E-G)。这些结果说明，hAD-MSCs可能通过直接分化为肾小管上皮细胞参与修复，但并不 是其修复受损肾脏组织的主要成员，而可能是在通过某些途径激活内源性的修复，加快I/R 损伤后肾脏的修复中起重要作用。2. 4. 2、hAD-MSCs 的植入促进 BMP7 表达 实时定量RT-PCR方法检测I/R后1天和3天，移植组和对照组肾脏组织中BMP7 表达，结果显示，移植组BMP7的表达量明显高于对照组(图9. E)。我们进一步用抗BMP7抗 体进行了免疫组织化学染色，肾皮质的小管和肾小球的足细胞可见阳性结果(图9. B，D)。 可见，hAD-MSCs的植入促进了损伤肾脏BMP7高表达，从而促进肾脏内源性修复。实施例3 hAD-MSCs在视网膜变性大鼠模型中的作用3. 1、hAD-MSCs移植后治疗效果的病理评估正常大鼠视网膜色素上皮层完整，PRE细胞单层扁平，排列整齐连续，光感受器细胞外节纵行规律排列，视网膜各层清晰。碘酸钠注射后，视网膜RPE细胞首先受到破坏， 如图所示，注射后1天RPE细胞数量开始减少，光感受器细胞外节层排列开始出现紊乱。 hAD-MSCs移植组(图10. B)，与对照组(图10. A)视网膜破坏程度和修复情况基本没有差 别。碘酸钠尾静脉注射后3天，对照组RPE细胞进一步减少，光感受器细胞外节层薄厚不均 勻，在RPE层上方的光感受器细胞外节层里有少量巨嗜细胞出现，同时在RPE层上方可见大 量细胞碎片堆积，视网膜外核层变薄，细胞核数量减少，可见外核层塌陷；同一时间点移植 组RPE细胞较多，光感受器细胞外节层薄厚均勻，在RPE层上方的光感受器细胞外节层里基 本不能观察到巨嗜细胞的分布，RPE层上方少见细胞碎片，视网膜外核层较厚，细胞核数量 变化不明显，外核层无明显塌陷。碘酸钠尾静脉注射后7天，大鼠视网膜上大量光感受器细 胞外节进解，视网膜外核层塌陷。外核层，甚至内核层直接贴附在Bruch’ s膜上，整个视网 膜切面呈拱桥样改变，周边视网膜亦受累，中央视网膜较周边视网膜受损明显(图10. C)； 同一时间点移植组大鼠视网膜上光感受器细胞外节发生形变，视网膜外核层局部位置出现 凹陷，结构基本保持完整(图10. D)。碘酸钠尾静脉注射后7天，视网膜损伤达到峰值，在移 植后2周、3周、6周，受损眼球病理结构没有发生明显改变(图10.E，G，I)，而移植组进一 步修复(图10. F，H)，在移植后6周，结构基本恢复(图10. J)，与正常鼠眼类似。从以上结果可见，移植后1周、2周、3周、6周、12周移植组视网膜RPE细胞、光感 受器细胞数量、光感受器细胞层厚度、视网膜外核层塌陷程度和数量，均好于对照组。 3. 2、hAD-MSCs在视网膜变性大鼠体内的分布、分化和疗效观察hAD-MSCs移植后1周、2周、3周均可见视网膜RPE层和脉络膜毛细血管层有 hAD-MSCs存在，并且整合到宿主的RPE层和毛细血管内皮中，表现出RPE细胞和血管内皮 细胞特有形态，第3周时还可见一些hAD-MSCs存在于视网膜光感受器细胞层。6周和3个 月时仅见视网膜光感受器细胞层散在hAD-MSCs存在。第1、2周，hAD-MSCs虽然整合到宿 主脉络膜毛细血管和视网膜外层，但是并没有表达宿主靶细胞特有的标志。到第3周，可见 hAD-MSCs分布于视网膜光感受器细胞层、RPE层和脉络膜毛细血管层，并且表达光感受器 细胞标志Rhodopsin、RPE细胞标志MITF、血管内皮细胞标志vWF(图11)。实施例4 干细胞在糖尿病视网膜病变中的应用4.1、hAD-MSCs 对 BRB 功能的改善BRB在DR早期开始损伤，我们采用了伊凡思蓝染色方法来检测糖尿病大鼠BRB 功能的改变。如图12所示，与正常大鼠(7.0士0.6)相比细胞移植前DR大鼠BRB水 平(20. 8 士 3.1)明显上升；hAD-MSCs移植后1周，移植组(9. 9 士 1.5)渗漏水平较对 照组(20. 2 士 2. 8)有所下降；植入后2周结果与1周类似，移植组对照组9.8 士 1.6vs 19. 5士4. 0 ；移植后4周，移植组基本恢复正常，达到8. 0士 1. 2，而对照组依然维持在较高水 平19. 2士0. 3。由此可见，hAD-MSCs的输入对于BRB渗漏水平明显改善，显著提高了 BRB的 功能。4. 2、血糖改变我们分别观察DR在细胞植入后1周、2周和4周血糖的变化(图13)，结果显示，植 入后1周，移植组DR大鼠的血糖(19. 7士4. 9ml/L)较对照组(21. 9士3. 2ml/L)有所下降，但 二者之间没有明显的统计学差异。细胞植入后2周，移植组血糖进一步下降(14. 5士4. 9ml/ L)，而对照组没有变化(24. 3士2. 9ml/L)。到第4周移植了 hAD-MSCs的大鼠血糖下降到10. 6士4. 5ml/L ；对照组血糖一直维持在高水平(22. 1 士2. lml/L)。hAD_MSCs的植入确实可 以降低DR大鼠的血糖水平，可能对于减轻视网膜损伤有一定的作用。4. 3、hAD-MSCs在视网膜细胞的分化及分布我们之前的研究显示，hAD-MSCs可以分布在多种损伤的组织，这里我们使用抗人 核抗体，通过免疫荧光方法检测供体细胞在眼底的分布状况。荧光显微镜下观察发现细胞 移植后一周，植入细胞在视网膜的内核及外核层都有分布。随后，抗Rhodopsin、抗GFAP和 抗人核的免疫荧光双染显示，分布在视网膜的供体细胞也表达感光细胞和胶质细胞的的标志。实施例5 在视网膜裂孔疾病模型中的应用5.1、三维 OCT 检查视网膜裂孔术后第2日，手术眼内气体基本吸收完全，行兔眼三维OCT及眼底检 查显示裂孔大小约1. 5mm左右，边缘整齐近圆形，网膜复位无脱离，裂孔处RPE层无损伤。 术眼玻璃体清，OCT成像清晰，术眼视网膜裂孔周边网膜复位良好，视网膜裂孔边缘及裸露 RPE层均无新生组织形成(图15.A)。眼底检查示裂孔范围视网膜呈苍白色，遮挡脉络膜 血管。hAD-MSCs移植组与对照组受体眼三维OCT检查图像基本相同，未见明显细胞团堆积 (图 15. B)。术后第4日，对照组的术眼视网膜裂孔边缘界限消失，修复组织出现，新生组织在 裂孔边缘最为丰富，向裂孔中心逐渐减少，裂孔中心处修复组织薄，厚度约为正常视网膜厚 度的1/5 (图15. C)。hAD-MSCs移植组的术眼视网膜裂孔边缘也始修复，孔中心厚度达约为 正常视网膜的1/2(图15. D)。眼底检查视网膜裂孔处呈乳白色，余视网膜正常。术后12日，对照组与hAD-MSCs移植组视网膜裂孔均进一步修复。hAD-MSCs移植 组裂孔中心厚度即恢复到与正常视网膜基本相同(图15. F)，对照组裂孔中心厚度为正常 的1/2 (图15. E)。眼底检查较前无明显变化。术后20日对照组裂孔中心厚度仍仅约为正 常视网膜的2/3 (图15. G)，且不再有明显变化。眼底检查较前无明显变化。术中对照组2只小鼠术后裂孔边缘的视网膜未完全复位，裂孔边缘翘起，边缘贴 附于RPE层处出现新生修复组织，而翘起处无修复组织出现，至术后3周裂孔均仍未闭合， 于裂孔局部注入hAD-MSCs悬液10 μ 1 (约1 X IO5)，移植后术眼裂孔修复，修复过程与干细 胞移植组一致。5. 2、病理检查术后1个月，HE染色结果显示，对照组视网裂孔处组织厚度较正常视网膜略薄，正 常视网膜各层结构不清晰，基本被胶原纤维样组织所替代，裂孔处细胞的细胞核形态为近 圆形或长圆形，部分为长杆状(图16. A)。hAD-MSCs移植组术后1个月，裂孔修复组织略高 出两侧正常视网膜，裂孔处细胞的细胞核多为不规则圆形，基本不存在长杆状细胞核(图 16. B)。5. 3、修复后裂孔的细胞分型为了进一步了解裂孔修复的情况，我们分别采用GFAP(胶质纤维酸性蛋白，glial fibrillary acidic protein，GFAP)，R0PSIN，PKC抗体对胶质细胞、感光细胞和双极细胞进 行了标记。结果显示，对照组术眼裂孔处只有GFAP阳性细胞在裂孔修复组织、脉络膜视网 膜粘合处广泛分布，走向与RPE层平行(图17.A)。裂孔处双极细胞标记抗原PKC、感光细胞标记抗原Opsin免疫荧光检测均为阴性(图17. D. G)。而移植组术眼裂孔处除大量无序 分布的GFAP阳性的胶质细胞外(图17. B)，可见少量Ropsin阳性的感光细胞(图17. E)和 PKC阳性的双极细胞(图17. H)分布。这个结果提示，移植组和对照组均主要以胶质细胞修 复为主，但同时移植组有少量感光细胞及双极细胞分布，而对照组仅为胶质修复。5. 4、植入的MSC在损伤部位的分布及分化我们用抗人核抗体检测植入的hAD-MSCs在裂孔处的分布情况。如图所示，裂孔处 可见少量散在分布的抗人核阳性的供体细胞。进一步通过免疫荧光双染检测供体细胞的分 化，结果可见，部分供体细胞表达GFAP抗原(图18. A-C)，同时少量供体细胞表达Opsin (图 18. D-F)，而PKC抗原阳性的细胞和与抗人核阳性的细胞没有重叠。上述结果说明，供体来 源的间充质干细胞通过直接分化参与了模型小鼠眼损伤的修复，但仅局限于很小的数目， 对于裂孔的修复不起决定性作用。序列表<110>中国医学科学院基础医学研究所<120>人脂肪来源的间充质干细胞在肾脏、眼底疾病中的用途<130>890136CG<160>10<170>PatentIn version 3.4<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1gctcctcctg agcgcaagta20<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>2gatggagggg ccggact17<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3cgcatcgtct tgcagatcga c21<210>4<211>22<212>DNA <213>人工序列
<400>4gctgagacca gtacttgtcc ag 22<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5ctggaacggt gaaggtgaca20<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>6aagggacttc ctgtaacaat gca 23<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>7ctggaacggt gaaggtgaca20<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>8aagggacttc ctgtaacaat gca 23<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>9acggacaggg cttctcctac20<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>10atggtggtat cgagggtgga a2权利要求
1.人脂肪来源的间充质干细胞在制备治疗肾脏和/或眼底疾病的细胞制剂中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述的肾脏疾病包括急性肾损伤、肾脏纤维化、肾 小管上皮细胞损伤。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述的眼底疾病包括视网膜变性、糖尿病视网膜 病变、视网膜裂孔。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述的视网膜变性为视网膜色素变性。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的用途，其中每单位所述的细胞制剂包含IXlO5 至IXlO6个人脂肪来源的间充质干细胞。
6.根据权利要求1-4中任意一项所述的用途，其中所述的人脂肪来源的间充质干细胞 是种子细胞。
7.根据权利要求1-4中任意一项所述的用途，其中所述的人脂肪来源的间充质干细胞 免疫表型为 CDlla，CD31, CD34, CD45, HLA-DR 为阴性，CD29, CD44, CD105, CD166, Scar-I, Flk-I为阳性，并且低表达MHC II类分子。
8.根据权利要求1-4中任意一项所述的用途，其中所述的细胞制剂为静脉注射剂。
9.根据权利要求3所述的用途，其中所述的细胞制剂为视网膜下注射剂。
全文摘要
本发明涉及人脂肪来源的间充质干细胞在肾脏、眼底疾病中的用途。本发明提供人脂肪来源的间充质干细胞在制备治疗肾脏和/或眼底疾病的细胞制剂中的用途，所述的疾病可以是急性肾损伤、肾脏纤维化、肾小管上皮细胞损伤、视网膜变性、糖尿病视网膜病变或视网膜裂孔等。本发明的细胞制剂可促进肾脏构和受损眼球病理结构的修复，具有良好的效果。
文档编号A61P13/12GK102048756SQ20091020932
公开日2011年5月11日 申请日期2009年11月4日 优先权日2009年11月4日
发明者于伟鸿, 晁纬静, 李康华, 杨治坤, 王旭倩, 董方田, 赵春华, 赵潺, 闫曦, 韩钦 申请人:中国医学科学院基础医学研究所