一种提高脂肪源干细胞抗凋亡及旁分泌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞生物学领域，尤其一种提高脂肪源干细胞抗凋亡及旁分泌的方 法。
【背景技术】
[0002] 在我国急性心肌梗死的死亡率依然较高。目前对于心肌梗死的治疗方法主要包括 溶栓、冠状动脉旁路移植术，经皮腔内冠状动脉血管成形术、激光心肌血运重建术及心脏移 植手术等。前四项方法只能恢复梗死区早期再灌注、改善心肌供血，但不能修复或逆转已坏 死的心肌，残留心肌只能在有丝分裂信号的刺激下发生肥厚，进而使心室发生重构，最终导 致心力衰竭。心脏移植虽可替代受损心脏，但由于缺乏供体，移植后免疫排斥反应及花费较 高等原因难以得到广泛应用。因此如何增加梗死区有收缩功能的心肌细胞数量或减少心肌 细胞的凋亡或死亡成为治疗心肌梗死的主要障碍。虽然临床实验表明，移植自体细胞可以 改善受损心肌的功能，但心肌细胞体外扩增能力有限，难于获取足够数量的细胞，且移植细 胞很难弥补和修复先天性或大面积缺损。
[0003] 干细胞是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的细胞。研究发现脂肪组织中存 在一类间充质干细胞，因其克隆细胞株的增殖能力强，具有多向分化的潜能，在体外培养中 保持稳定的生长增殖活性，具有与骨髓间充质干细胞一样的多向分化潜能，称为脂肪干细 胞。与骨髓间充质干细胞相比，除皮下脂肪含量十分丰富，提取方便外，脂肪干细胞可以分 泌具有生物活性的血管内皮生长因子、肝细胞生长因子等多种促进血管新生的因子。
[0004] 体内各组织器官氧气含量变化范围较大，脂肪组织中氧气浓度一般小于3%，因此 脂肪干细胞处于低氧环境中。实验研究表明，低氧环境下培养的脂肪干细胞具有较强的扩 增，迀移及抗凋亡能力。Kim等发现活性氧（ROS)，还原型辅酶II氧化酶，磷酸化的血小板衍 生生长因子-P受到抑制后，脂肪干细胞的扩增与分化能力下降。然后进一步研究发现， 中、低量ROS可提高脂肪干细胞扩增，迀移以及再生能力。缺氧条件下，NADPH氧化酶活化 使脂肪干细胞产生R0S，定位于细胞核周围的Nox4优先表达，将其沉默后，脂肪干细胞的扩 增与迀移能力降低。说明还原型辅酶II氧化酶4在脂肪干细胞扩增迀移过程中发挥重要的 作用。低氧环境下培养的干细胞，其抗凋亡能力得到改善。Stubbs等应用MTT实验、乳酸 脱氢酶实验及Caspase激活实验发现低氧条件下（2%O2)培养ADSCs24小时后，和常氧条 件下培养相比，HP-hADSCs的VEGF分泌量增高，AKT的磷酸化程度也得到提高，进一步研究 表明，应用VEGF的中和抗体和磷酸肌醇3-激酶抑制剂LY294002可降低HP-hADSCs的生存 能力，说明低氧环境促使ADSCs分泌大量的VEGF，而该细胞因子与ADSCs的存活密切相关。 Valorani等的研究结果认为低氧环境（2%O2)不会改变ADSCs的细胞表型，并且能够提高 ADSCs扩增与生存能力，促使其向脂肪细胞与骨细胞分化。不仅如此，ADSCs的扩增与集落 形成与低氧环境密切相关（1 %O2)，其机制为低氧环境使得ADSCs的2581个基因受到调控， 进而激活了涉及ADSCs增殖与凋亡的相关途径。然而，对于在何种低氧环境下最适于ADSCs 旁分泌以及抗凋亡能力还需要进一步的研究。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种提高脂肪源干细胞抗凋亡及旁分泌的 方法。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
[0007] -种提高脂肪源干细胞抗凋亡及旁分泌的方法，3 %低氧环境能促进脂肪源干细 胞的抗凋亡及旁分泌能力。
[0008] 优选的，上述提高脂肪源干细胞抗凋亡及旁分泌的方法，具体方法如下：
[0009] (1)剪除脂肪组织中明显的血管，用含有双抗（2ml)的D-Hank' S(200ml)清洗脂 肪组织2-3次后剪碎，所述双抗为lOOU/ml青霉素和lg/ml链霉素；
[0010] (2)将剪碎的脂肪组织通过150目尼龙筛网过滤，收集150目滤网上的脂肪组织， 用含有40U/50mlDNaseI和250yg/ml两性霉素的D-Hank's液冲洗滤网上的脂肪组织， 去掉分离组织时因破坏细胞而释放的DNA及其他胞内容物；
[0011] (3)将脂肪组织加入D-Hank's液体，并以1500rpm离心5min，将上清转移至离心 管中，加入含有0. 5%胶原酶I的等体积D-Hank's液，在37°C恒温振荡器上振荡约75min 后，以 1800rpm离心 5min;
[0012] (4)弃上清，加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基，调整每个T75Cm2培养瓶中的 细胞数约为2x106,置入37°C，5%C0J?箱中培养，24小时后，将未贴壁的细胞移除；
[0013] (5)7-10天后瓶中细胞增殖并铺满瓶底，待融合率达到80%，以0? 25 %胰蛋白 酶-0. 01 %EDTA消化，所得细胞为原代细胞，继续培养原代细胞，每3天换液1次，当细 胞融合率达80%时，用0. 25%胰蛋白酶消化、传代得到脂肪源干细胞，所用脂肪源干细胞 (humanAdiposederivedstemcells,hADSCs)为 3-5 代；
[0014](6)培养脂肪干细胞24小时，使细胞融合达50 %，更换培养基，调整氧浓度，3 % 02、5%C02、92% N2，在上述氧浓度环境中培养24小时。
[0015] 本发明的有益效果是：
[0016] 本发明所述提高脂肪源干细胞抗凋亡及旁分泌的方法，通过大量研究发现3%氧 环境下最适于ADSCs旁分泌以及抗凋亡能力的提高，为临床实践中提高脂肪源干细胞生存 能力提供新的参考。
【附图说明】
[0017] 图1:从人脂肪组织中获取的人脂肪干细胞。
[0018] 图2:经流式细胞仪检测脂肪干细胞的特异性标记。人脂肪干细胞免疫表型抗原 ⑶71、⑶73、⑶90、⑶105阳性表达率较高，⑶34、⑶45、⑶54、HLA-DR为阴性表达。
[0019] 图3 :qRT_PCR及WesternBlot检测脂肪源干细胞的抗凋亡及旁分泌情况。
[0020] 图4 :ELISA检测脂肪源干细胞的旁分泌情况。
[0021] 图5 :流式细胞术分析脂肪源干细胞的抗凋亡情况。
[0022] 图6 :SPCET观察低氧环境培养的人脂肪源干细胞缩小心肌梗死面积。
[0023] 图7 :免疫荧光分析低氧环境培养的人脂肪源干细胞的生存及成血管性。
[0024] 图8:免疫荧光分析经低氧环境培养的人脂肪源干细胞减少心肌细胞凋亡的情 况。
【具体实施方式】
[0025] 在1%、3%、5%、10%、21%氧环境下，充分对比脂肪源干细胞的抗凋亡及旁分泌 能力。依据上述结果，选3%氧环境作为最适宜的培养条件。再将该条件下培养的脂肪源干 细胞用于治疗心肌梗死，观察疗效。经体外、体内实验证实，3%低氧环境能促进脂肪源干细 胞的抗凋亡及旁分泌能力。
[0026] 具体实施步骤包括：
[0027] LADSCs的获取及免疫表型鉴定的实验方法
[0028] 患者知情并同意后，经吸脂术获取脂肪组织。剪除脂肪组织中明显的血管，用含有 2ml双抗（100U/ml青霉素，lg/ml链霉素）的200mlD-Hank's清洗脂肪组织2-3次后剪 碎。将剪碎的脂肪组织通过150目尼龙筛网过滤，收集150目滤网上的脂肪组织。用含有 DNaseI(40U/50ml)和250yg/ml两性霉素的D-Hank's液冲洗滤网上的脂肪组织，去掉分 离组织时因破坏细胞而释放的DNA及其他胞内容物。将脂肪组织加入D-Hank's液体，并以 1500rpm离心5min，将上清转移至离心管中。加入含有0. 5%胶原酶I的等体积D-Hank's 液，在37°C恒温振荡器上振荡约75min后，以1800rpm离心5min。弃上清，加入含有10% 胎牛血清的DMEM培养基，调整每个T75Cm2培养瓶中的细胞数约为2x106,置入37°C，5%CO2 孵箱中培养。约24小时后，将未贴壁的细胞移除。7-10天后瓶中细胞增殖并铺满瓶底，待 融合率达到80%，以0. 25%胰蛋白酶-0. 01 %EDTA消化，所得细胞为原代细胞。继续培养 原代细胞，每3天换液1次，当细胞融合率达80%时，用0. 25%胰蛋白酶消化、传代得到脂 肪源干细胞，所用脂肪源干细胞（humanAdiposederivedstemcells,hADSCs)为3-5代。
[0029] 培养脂肪干细胞24小时，使细胞融合达50%，更换培养基，按以下分组调整氧浓 度，A组：1% 02预处理组（1% 02,5% C02,94%N2)B组：3% 02预处理组（3% 02,5% C02， 92%队)(：组：5%02预处理组（5%02,5%0) 2,90%队)0组：10%02预处理组（10%02,5% C0 2,85%N2)E组，对照组：5% C02,95%空气。在上述氧浓度环境中培养24小时。
[0030] 收集生长状态良好的hADSCs经胰酶消化后，用含0. 5%BSA的PBS冲洗。将细胞 悬液加在8个I. 5ml的EP管中，每管待测细胞数多105。在EP管中分别加入一抗⑶34， ⑶45,⑶54,⑶71，⑶73,⑶90,⑶105和HLA-DR，以及IgG-PE的同型对照抗体各4y1，充分 混匀，4°C避光孵育30min。离心2000rpmXlmin，弃上清，用Iml的PBS洗涤一次，弃上清。 4 %多聚甲醛400