脂肪原始间充质干细胞的分离方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种脂肪原始间充质干细胞的分离方法。
【背景技术】
[0002] 干细胞是一类具有自我更新能力且在适合微环境下具有多系分化潜能的原始细 胞。根据个体发育过程中出现的先后次序不同，干细胞可分为胚胎干细胞，多能干细胞以及 各种组织中的定向干细胞如造血干细胞、神经干细胞等。目前，已有利用干细胞治疗心肌梗 塞、红斑狼疮、类风湿性关节炎、神经损伤、肌肉萎缩等的实验报道。
[0003] 成体干细胞是存在于人体组织中具有多系分化潜能的一种超能干细胞群，在特定 环境下可诱导分化成多种组织细胞。在成体干细胞中，间充质干细胞广泛存在于全身各种 组织中，特别是骨髓，脂肪，脐带和胎盘。由于脂肪来源的间充质干细胞具有强大的增值能 力，较强的分化能力，低免疫原性和免疫调节功能，其在临床上的应用价值越来越受人们关 注。
[0004] 中国专利ZL201210336264. 5公开了一种"人脂肪干细胞的分离培养方法和干细 胞库的构建方法"，该专利中采用I型和IV型胶原酶对脂肪组织进行消化，虽然该方法使得 消化效果有所提高，但不能除去大量的杂细胞，需要通过连续传代来纯化细胞，使培养的细 胞不利于临床应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种脂肪组织消化更彻底、明显提高细胞的纯度的脂肪原始 间充质干细胞的分离方法。
[0006] 为实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种脂肪原始间充质干细胞的 分离方法，采用P型胶原酶消化脂肪组织，离心后获得脂肪间充质干细胞。由此，P型胶原酶 (collagenageP)使脂肪组织消化更彻底，组织消化均一，没有明显的组织残留，得到的间充 质干细胞活性好，贴壁快，均一性好。
[0007] 在一些实施方式中，P型胶原酶的浓度为0. 1~1% (m/v)。由此，采用此浓度的P 型胶原酶能够实现较好的消化效果，获得质量较高的间充质干细胞。
[0008] 在一些实施方式中，P型胶原酶的浓度为0. 4% (m/v)，消化时间为16min。由此， 0.4%的浓度获得的细胞数量更优，更有利于规模化生产。
[0009] 在一些实施方式中，P型胶原酶母液的配制方法为：100ml生理盐水加入IgP型胶 原酶。由此，采用生理盐水配制母液操作更加便捷，成本低，且不影响P型胶原酶的活性。
[0010] 在一些实施方式中，脂肪原始间充质干细胞的分离方法，包括以下步骤：
[0011] 配制P型胶原酶母液：100ml生理盐水加入IgP型胶原酶；
[0012] 获取脂肪组织：通过肿胀法吸脂手术获得腹部浅表层的脂肪组织；
[0013] 消化脂肪组织：加入等体积的0.1~1% (m/v)的P型胶原酶充分混匀， 37°C 150rpm 震荡消化 8 ~50min ;
[0014] 离心收集：消化产物经过梯度离心后，取离心得到的沉淀即脂肪间充质干细胞。
[0015] 由此，P型胶原酶对脂肪组织充分消化，经过滤和离心进一步纯化细胞，具有步骤 简单、得到的间充质干细胞数量大活性大的特点。
[0016] 在一些实施方式中，离心收集方法为：消化产物经150目筛网过滤，收集细胞初悬 液，将细胞初悬液经1500rpm，lOmin，1200rpm，lOmin，lOOOrpm，IOmin三次梯度离心后，取 离心得到的沉淀即脂肪间充质干细胞。由此，筛网过滤和三梯度离心进一步提高细胞纯度。
[0017] 在一些实施方式中，获取的脂肪组织维持在2~8°的环境中运输，12小时内进行 分离操作。由此，脂肪组织在上述条件下运输和操作，能够保证脂肪组织具有良好的活性。
[0018] 在一些实施方式中，获取的脂肪组织在消化前采用生理盐水洗涤。由此，生理盐水 成本低，且不影响细胞活性，具有较好的洗涤效果。
[0019] 在一些实施方式中，脂肪组织洗涤方法为：将脂肪组织放入离心管内，20ml/管， 补加生理盐水至40ml，离心200rpm，3min，弃下层血水，重复上述步骤。由此，上述洗绦步骤 具有良好的洗涤效果。
[0020] 本发明的有益效果为：本发明的脂肪原始间充质干细胞的分离方法采用单一的P 型胶原酶消化，使脂肪组织消化更彻底均一，没有明显的组织残留，细胞活性好，贴壁快，均 一性好，通过筛网过滤去除结缔组织及采用滴度离心，明显提高细胞的纯度。本发明的分离 方法步骤简单适用于生产。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明的脂肪原始间充质干细胞的分离方法的实施例1~3获得的脂肪间 充质干细胞的计数结果和细胞培养24小时后细胞长势。
【具体实施方式】
[0022] 下面对本发明作进一步详细的说明。
[0023] 本发明的脂肪原始间充质干细胞的分离方法中获取脂肪组织的方法为：
[0024] 筛选合格的患者，HBV抗原、抗HCV抗体、抗HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体、ALT、支 原体检测项目均为阴性；
[0025] 脂肪组织由专业的医院或美容机构通过肿胀法吸脂手术获得腹部浅表层的组 织；
[0026] 获得的脂肪组织装入20ml注射器内存放。
[0027] 以下通过实施例进一步解释本发明。其中，使用的P型胶原酶从罗氏公司（Roch) 购得。
[0028] 实施例1
[0029] 配制P型胶原酶母液：100ml生理盐水加入IgP型胶原酶，混匀后过滤，然后再用 生理盐水将P型胶原酶母液稀释成终浓度为0. 1% (m/v)。
[0030] 获取脂肪组织：通过肿胀法吸脂手术获得腹部浅表层的脂肪组织，获取的脂肪组 织维持在2~8°的环境中运输，12小时内进行分离操作。
[0031] 洗涤脂肪组织：将脂肪组织放入离心管内，20ml/管，补加生理盐水至40ml，离心 200rpm，3min，弃下层血水，重复上述步骤一次。
[0032] 消化脂肪组织：取IOml脂肪组织，加入等体积的0.1 % (m/v)的P型胶原酶充分 混匀，37°C 150rpm震荡消化50min。
[0033] 离心收集：消化产物经150目筛网过滤，收集细胞初悬液，将细胞初悬液经 1500rpm，lOmin，1200rpm，lOmin，lOOOrpm，IOmin三次梯度离心后，取离心得到的沉淀即脂 肪间充质干细胞。
[0034] 获得的脂肪间充质干细胞的细胞活力如图Ia所示。将脂肪获得的间充质干细胞 进行细胞培养，24小时后细胞长势如图IA所示。
[0035] 实施例2
[0036] 配制