人脂肪间充质干细胞提取物及其冻干粉和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开人脂肪间充质干细胞提取物及其冻干粉和应用，该人脂肪间充质干细胞提取物是取传代培养的P3～P30代人脂肪间充质干细胞，利用细胞生长液培养至细胞80%融合时，弃掉培养液，先用磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次，然后加入无血清培养液继续培养72小时后，收集无血清培养液，而未被收集的细胞利用消化液消化后，超声破碎仪破碎细胞，离心后收集上清；将收集的无血清培养液和收集的上清混合后，过滤，收集过滤液对其浓缩，再除菌处理后制备而得。本发明的人脂肪间充质干细胞提取物及其冻干粉具有多种生物学活性，可用于制备伤口愈合药物或细胞修复药物等生物医药产品，还可用于制备美白产品或皮肤抗皱产品等精细化工产品。
【专利说明】人脂肪间充质干细胞提取物及其冻干粉和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及干细胞在生物医药或医学美容中使用的技术，尤其涉及人脂肪间充质干细胞在生物医药或医学美容中的使用。
【背景技术】
[0002]脂肪组织来源广泛、取材容易、细胞分离效率高、给患者带来的创伤较少、并且不涉及伦理问题，因此日益受到广泛重视。
[0003]人脂肪间充质干细胞是脂肪组织中的一类多能性干细胞，其能够分泌多种生物活性物质，包括蛋白质、多肽及细胞因子等，比如干细胞生长因子(SCGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、肝细胞生长因子(HGF)和转化生长因子等，这些细胞生长因子能够控制或者维持受伤组织细胞，引导其自身修复。除此之外，人脂肪间充质干细胞中还含有多种膜蛋白质及生物活性因子等多种成分，这些成分相互协调相互补充，具有复杂的生理作用，能够对许多组织器官产生影响，因此具有比较好的抗光老化、抗氧化、抗皱、美白肌肤、伤口愈合、细胞修复等功效。
[0004]目前，虽然已有研究利用特定的诱导条件体外诱导干细胞分泌上清用于医疗、化妆品等方面，但是这种条件培养基是应用特定的细胞因子诱导干细胞分泌某些特定的因子从而达到疗效，细胞因子本身价格昂贵，使得干细胞的应用成本异常增高。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种具有多种生物学活性，可用于生物医药、精细化工领域的人脂肪间充质干细胞提取物。
[0006]本发明的另一个目的是提供上述人脂肪间充质干细胞提取物在制备伤口愈合药物或细胞修复药物等生物医药产品，或在制备美白产品或皮肤抗皱产品等精细化工产品中的应用。
[0007]本发明的另一个目的是提供上述人脂肪间充质干细胞提取物的冻干粉。
[0008]本发明的另一个目的是提供上述人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉的制备方法。
[0009]本发明的另一个目的是提供上述人脂肪间充质干细胞提取物的冻干粉在制备伤口愈合药物或细胞修复药物等生物医药产品，或在制备美白产品或皮肤抗皱产品等精细化工产品中的应用。
[0010]本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的:
人脂肪间充质干细胞提取物，该提取物是由如下方法制备而得:
步骤1.将人脂肪间充质干细胞经原代分离培养后，进行传代培养，取传代培养的P3~P30代人脂肪间充质干细胞，利用细胞生长液培养至细胞80%融合时，弃掉培养液，先用磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次，然后加入无血清培养液继续培养72小时后，收集无血清培养液，而未被收集的细胞进行后续处理；步骤2.将步骤I未被收集的细胞利用消化液消化后，超声破碎仪破碎细胞，离心后收集上清； 步骤3、
将步骤I收集的无血清培养液和步骤2收集的上清混合后，过滤，收集过滤液对其浓缩，所得浓缩液再进行除菌处理后，则制备得到所需人脂肪间充质干细胞提取物。
[0011]上述步骤I中，所述将人脂肪间充质干细胞经原代分离培养中，原代分离方法和培养方法采用本领域技术人员的常规操作即可。
[0012]上述步骤I中，所述细胞生长液是指含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，并且该培养液中还含有抗细菌抗生素；所述抗细菌抗生素为青霉素和链霉素两种，其中青霉素在细胞生长液中的终浓度为200 U/ml，链霉素在细胞生长液中的终浓度为250 U/ml ;所述含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液为向市售的基础DMEM/F12培养液中加入终浓度为10%的胎牛血清，并加入终浓度为200 U/ml的青霉素和终浓度为250 U/ml的链霉素即为本发明的细胞生长液。
[0013]上述步骤I中，所述磷酸盐缓冲液为pH值为7.0~7.2的PBS溶液。
[0014]上述步骤I中，所述细胞在无血清培养液中继续培养72小时，这里的无血清培养液为市售产品。
[0015]上述步骤I中，具体操作时，将传代培养的不同代细胞分别进行处理，如:将P3代的人脂肪间充质干细胞利用细胞生长液培养至细胞80%融合时，弃掉培养液，先用磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次，然后将细胞加入到无血清培养液中继续培养72小时后，收集得到P3的无血清培养液；将P4代的人脂肪间充质干细胞利用细胞生长液培养至细胞80%融合时，弃掉培养液，先用磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次，然后将细胞加入到无血清培养液中继续培养72小时后，收集得到P4代的无血清培养液等等；然后将P3~P30代人脂肪间充质干细胞分别得到的无血清培养液收集合并后，则得到实施例1收集的无血清培养液；同时，将P3~P30代人脂肪间充质干细胞分别得到的未被收集的细胞收集合并后，一起进行后续处理。
[0016]上述步骤2中，所述消化液为0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液，该混合消化液先经0.22Mm的滤膜过滤除菌后才能用于本发明；所述0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液为本领域技术人员进行细胞实验时常用的一种消化液，其配制方法按照教科书上给出的配制方法，均可实现本发明；如可采用如下方法配制:取0.25g胰蛋白酶粉、20mgEDTA粉末和100ml 0.01mol/L的PBS，先用少量PBS溶解胰蛋白酶粉，然后将EDTA粉末和其余的PBS加入混合后，置于37°C水浴中，待彻底溶解液体呈透明为止，用G5抽滤，分装置于4°C冰箱中保存即可。
[0017]上述步骤2中，所述超声破碎仪破碎细胞，其破碎条件为4°C、400W、超声3s、间隔6s, 99个循环。
[0018]上述步骤2中，所述离心为17000g、30min。
[0019]上述步骤3中，所述将步骤I收集的无血清培养液和步骤2收集的上清混合，这里步骤I收集的无血清培养液和步骤2收集的上清的混合比例为1: 1，体积比。
[0020]上述步骤3中，所述过滤是采用孔径为0.45Mm的滤膜过滤。
[0021]上述步骤3中，所述浓缩是采用截留分子量为3KD的过滤膜进行浓缩脱盐。
[0022]上述步骤3中，所述浓缩是指浓缩至原体积的1/10，也就是说，将过滤液浓缩后得到浓缩液，所述浓缩液的体积是过滤液的1/10。
[0023]上述步骤3中，所述将浓缩液进行除菌处理，这里的除菌处理是将浓缩液采用无菌的0.22Mm滤膜过滤除菌。
[0024]上述制备的人脂肪间充质干细胞提取物经过实验研究证实，其具有很多种生物学活性，可用于制备伤口愈合药物或细胞修复药物等生物医药产品，还可用于制备美白产品或皮肤抗皱产品等精细化工产品。
[0025]本发明的人脂肪间充质干细胞提取物虽然具有多种生物学活性，应用领域广泛，但是其生物学活性受各种外界条件限制，保存起来不方便，因此本发明还提供人脂肪间充质干细胞提取物的冻干粉，该冻干粉就是将本发明的人脂肪间充质干细胞提取物经本领域常用的冻干粉制备方法制备的冻干粉；冻干粉是在无菌环境下将药液冷冻成固态，抽真空将水分升华干燥而成的无菌粉，冻干粉的制备方法是本领域比较成熟的技术，本发明采用任何一种冻干粉的制备方法，都可以得到所需的人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉。
[0026]为了取得更好的医药学效果，本发明还特别针对上述人脂肪间充质干细胞提取物的特点，研发了人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉的制备方法，该制备方法包括如下步骤:
向人脂肪间充质干细胞提取物中加入赋形剂和水，混合后过滤除菌，然后进行冻干处理，则制备得到所需人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉。
[0027]上述冻干粉的制备方法中，所述赋形剂采用甘露醇、海藻糖或蔗糖中的任意一种。
[0028]上述冻干粉的制备方法中，所述赋形剂的用量:赋形剂占人脂肪间充质干细胞提取物总重量的5~10%。
[0029]上述冻干粉的制备方法中，所述水采用超纯水。
[0030]上述冻干粉的制备方法中，加入超纯水至最终体积为100ml。
[0031]上述冻干粉的制备方法中，所述冻干处理是指冻干温度为-20~_35°C、真空度为50~200Pa，冻干48小时。
[0032]本发明的人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉同样具有多种生物学活性，可用于制备伤口愈合药物或细胞修复药物等生物医药产品，还可用于制备美白产品或皮肤抗皱产品等精细化工产品。
[0033]本发明的人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉制备方法简单，易于保存和运输。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1为人脂肪间充质干细胞的流式细胞检测图；
图2为人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉对HDF细胞生长的影响结果柱状图；
图3为人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉对细胞内SOD酶活性的影响结果柱状图；图中，I为人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉2(^g/ml组；2为人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉lOPg/ml组；3为模型组；4为阳性对照组；5为阴性对照组；其中:**P ^ 0.01,氺P ^ 0.05 ；
图4为5个实验组的小鼠血浆中SOD酶活性的检测结果柱状图；
图中，I为人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉2(^g/ml组；2为人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉lOPg/ml组；3为模型组；4为阳性对照组；5为阴性对照组；其中:**P ^ 0.01,氺P ^ 0.05 ；
图5为5个实验组的小鼠血浆中GPx活性的检测结果柱状图；
图中，I为人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉2(^g/ml组；2为人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉lOPg/ml组；3为模型组；4为阳性对照组；5为阴性对照组；其中:**P ^ 0.01,氺P ^ 0.05 ；
图6为5个实验组的小鼠血浆中MDA含量的检测结果柱状图。
[0035]图中，I为人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉2(^g/ml组；2为人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉lOPg/ml组；3为模型组；4为阳性对照组；5为阴性对照组；其中:**P ^ 0.01, *P = 0.05。
【具体实施方式】
[0036]下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。 [0037]实施例1人脂肪间充质干细胞的原代分离、培养及鉴定
1、人脂肪间充质干细胞的原代分离和培养
将通过脂肪抽吸术获取的人体腹部皮下脂肪组织抽提液(术前己排除内分泌疾病及传染病)800g离心，用PBS缓冲液冲洗，浸泡，再800gX4min洗涤3次；剔除肉眼可见的血管及结蹄组织，用眼科剪将其充分剪碎后放入50ml离心管，加入2倍体积0.2%胶原酶、I倍体积1%BSA和双抗，混匀，封口，放入摇床中37°C消化45min，至糊状为止；
加入等体积的含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM终止消化，1800r/min离心IOmin,离心后分为3层，上层为油脂及未消化完全的脂肪组织，中层为上清液，下层为脂肪干细胞和红细胞等混合细胞的沉淀；
弃上层和中层，下层加入完全培养基重悬细胞沉淀，70Mm细胞筛网过滤，将滤过后的滤液调整细胞浓度为5 X IO5单核细胞/mL接种于T-25cm2培养瓶中，37°C、5%C02、饱和湿度培养，48h后换液，加入脂肪干细胞完全培养基继续培养。
[0038]2、人脂肪间充质干细胞的鉴定
采用流式细胞仪进行人脂肪间充质干细胞的鉴定，结果如图1所示，细胞中CD29、⑶44、⑶90呈阳性表达，⑶49d、⑶71呈弱阳性，而⑶34、⑶45呈阴性表达，因此可判定为人脂肪间充质干细胞。
[0039]实施例2人脂肪间充质干细胞提取物
本实施例的人脂肪间充质干细胞提取物，该提取物是由如下方法制备而得:
步骤1.将经过鉴定的传代培养的P3~P30代人脂肪间充质干细胞，利用细胞生长液(所述细胞生长液是向市售的基础DMEM/F12培养液中加入终浓度为10%的胎牛血清以及终浓度为200 U/ml的青霉素和终浓度为250 U/ml的链霉素制备而得)培养至细胞80%融合时，弃掉培养液，先用磷酸盐缓冲液(所述磷酸盐缓冲液为PH值为7.0~7.2的PBS溶液)洗涤细胞三次，然后加入市售的无血清培养液继续培养72小时后，收集P3~P30代各代人脂肪间充质干细胞分别得到的无血清培养液并合并，而未被收集的细胞进行后续处理；
步骤2.将步骤I未被收集的细胞利用消化液(所述消化液为0.25%胰蛋白酶-0.0296EDTA混合消化液，且该混合消化液经0.22Mffl的滤膜过滤除菌)消化后，加入步骤I用的细胞生长液终止消化，4°C、3000g、离心5min ;PBS洗涤细胞3次，并重悬细胞，放于冰上利用超声破碎仪破碎细胞，破碎条件为400W、超声3s、间隔6s，99个循环；待液体变澄清后，4°C、17000g、离心30min收集上清，将P3~P30代各代人脂肪间充质干细胞分别得到的上清收集并合并；步骤3、
将步骤I收集的无血清培养液和步骤2收集的上清以1:1的体积比混合后，利用
0.45Mffl滤器过滤溶液，收集过滤液并将该过滤液浓缩至原体积的十分之一，所得浓缩液用无菌的0.22ΜΠ1滤膜过滤除菌，则制备得到本实施例的人脂肪间充质干细胞提取物溶液。
[0040]实施例3人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉
采用BCA法对实施例2制备的人脂肪间充质干细胞提取物溶液进行蛋白浓度测定，酶标仪测定A570的吸光度，得到实施例2制备的人脂肪间充质干细胞提取物溶液的蛋白浓度，然后根据该蛋白浓度，按照需冻干溶液的最终质量加入赋形剂甘露醇(甘露醇占人脂肪间充质干细胞提取物总重量的5%)和50~60°C的超纯水混匀，并调节至蛋白终浓度为50.0±0.5μδ/πι1,过滤除菌，然后冻干处理，冻干温度为-20~-35°C，真空度为50~200Pa，冻干时间48小时，则制得所需的人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉；冻干粉按照Iml量/支分装。
[0041]人脂肪间充质 干细胞提取物冻干粉的质量标准如下所示:
(I)外观
观察人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉产品为白色、粉末状。按标示量用Iml超纯水溶解后为澄清、透明的淡红色溶液。
[0042](2) pH值的测定
采用精密PH计测定人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉的pH值。首先根据操作说明书利用标准液对PH计进行校正，再对干细胞提取物冻干粉水溶液进行测定。人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉水溶液的PH值在6.5~7.5之间。
[0043]实施例4人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉体外抗光老化试验
(I) MTT法测定人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉对人真皮成纤维细胞生长的影响检测样品:实施例3制备的人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉(蛋白含量为50.0±0.5μδ / 支)。
[0044]受试生物体:HDF细胞。
[0045]具体步骤如下所示:
(1)利用10%(v/v)FBS 的 DMEM/F12 培养基(青霉素 200 U/ml、链霉素 250 U/ml,pH7.2)培养HDF细胞，当细胞密度达到100%融合时，利用细胞消化液消化细胞，调整细胞浓度为为I X 105cell/ml，接种至Ij 96孔板中，每孔100 μ 1，设定4个复孔，37°C、5%C02、饱和湿度的细胞培养箱中继续培养；
(2)24h后，弃去培养基，用含1%FBS的DMEM/F1培养基稀释干细胞提取物至终浓度为400 μ g/ml、200μ g/ml、100 μ g/ml、50 μ g/ml、25 μ g/ml、12.5 μ g/ml、6.25 μ g/ml,每孔加入ΙΟΟμ 1，设定4个复孔，对照组加入1%FBS的DMEM/F12培养基。37°C、5%C02、饱和湿度的细胞培养箱中继续培养；(3)48h后，加入20 μ I/孔的MTT溶液，继续培养4h，弃上清，加入DMS0100 μ I/孔，避光震荡15min，利用酶标仪在波长为570nm、参考波长为630nm处测定吸光度，并计算细胞存活率。
[0046]细胞存活率(％)=(实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值)X 100%
实验结果如图2所示，人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉在浓度=400 μ g/ml时对HDF
细胞无明显的抑制作用，镜下观察细胞也无明显的死亡等症状。实验组与对照组相比较，其细胞存活率没有明显的差异，说明没有出现显著的细胞死亡，而当人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉浓度=100 μ g/ml时能够促进HDF细胞的生长。
[0047](2)人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉对紫外损伤人真皮成纤维细胞的保护作用 检测样品:实施例3制备的人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉(蛋白含量为
50.0±0.5μδ / 支)。
[0048]受试生物体:HDF细胞。
[0049]具体步骤如下所示:
(1)当人真皮成纤维细胞生长至80%融合时，用UVA紫外线照射细胞，每天照射2小时，共照射4天，阴性对照组用锡纸包住细胞培养瓶。在显微镜下观察细胞的形态，发现细胞开始出现皱缩，个别细胞漂浮在培养基中；第五天，加入人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉，蛋白终浓度分别为20 μ g/ml和10 μ g/ml，维生素C20 μ g/ml作为阳性对照，继续培养48h，收集细胞；
(2)人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉对细胞内SOD酶活性的影响:胰酶消化后，细胞在1500g、4°C条件下离心lOmin。细胞沉淀悬浮在遇冷的缓冲液中(50mM的Tris - HCl,5mM EDTA和I mM DTT)进行超声，裂解液在10000g、4°C条件下离心lOmin，上清利用SOD检测试剂盒根据其说明方法进行分析。
[0050]结果如图3所示，人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉蛋白浓度无论是20μ g/ml，还是10 μ g/ml都不同程度地提高了细胞内SOD酶的活性，从而减少因紫外线辐射诱导产生的氧自由基对细胞的攻击和损害，降低细胞的死亡率，从而起到保护细胞的作用，达到抗光老化的功效。
[0051]实施例5人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉对紫外线引起小鼠皮肤光老化的保护作用
一、实验方案
1、检测样品:实施例3制备的人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉(蛋白含量为50.0±0.5μδ / 支)。
[0052]2、试验方法:
2.1动物饲养:4周龄SP F级雌性昆明小鼠(体重20±2g)，广东省医学实验中心提供，适应性饲养一周后，剔除小鼠背部毛，裸露皮肤棉结约2cm2，进行试验。试验过程中正常给水和饲料。
[0053]2.2实验分组及药物处理:小鼠分为五组，每组5只，分别进行如下操作:
第I组:用生理盐水溶解人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉，制备得到人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉浓度为2(^g/ml的溶液；将前述人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉浓度为2(^g/ml的溶液涂抹到小鼠上，涂抹量为Iml/只，I次/天(照射前)，然后紫外照射；第2组:用生理盐水溶解人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉，制备得到人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉浓度为lOPg/ml的溶液；将前述人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉浓度为lOPg/ml的溶液涂抹到小鼠上，涂抹量为Iml/只，I次/天(照射前)，然后紫外照射；第3组:模型组，该组的小鼠不涂抹人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉，紫外照射；
第4组:阳性对照组，用生理盐水溶解维生素C (VitC)制备得到维生素浓度为2(^g/ml的溶液，将该溶液涂抹于小鼠上，涂抹量为Iml/只，I次/天(照射前)，然后紫外照射；第5组:阴性对照组，该组的小鼠什么也不涂抹，也不紫外照射。
[0054]紫外线照射的具体操作:对小鼠给药Ih待药物被吸收后进行紫外照射，第一周每天照射lh，第二周每天照射2h，第三周每天照射3h，从第4周开始每天照射4h，总共照射42天；紫外线的强度为:UVA:0.25mJ/cm2/s, UVB:0.02mJ/cm2/s ;待照射完成后，将老鼠处死，进行各项指标的检测；对老鼠进行放血，血清在2500g、4°C条件下离心4min，取上清进行各项指标的检测。
[0055]3、检测项目: 血浆中SOD酶、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)及丙二醛(MDA)含量的测定:对小鼠进行放血,在2500g、4°C条件下离心4min,收集上清；
SOD的活性，GPx的活性以及MDA的含量利用南京建成生物工程研究所提供的诊断试剂盒根据供应商的说明书进行测定分析。
[0056]皮肤组织切片HE染色，观察皮肤结构的变化:取小鼠背部剔除毛的皮肤，10%的甲醛溶液固定，常规石蜡切片，HE染色观察。
[0057]4、实验结果
图4为5个实验组的小鼠血浆中SOD酶活性的检测结果柱状图，由图4可以看出:模型组小鼠体内的SOD酶活性7.26±2.24U/ml，而第I组小鼠体内SOD酶活性为53.3±5.99U/ml，第2组小鼠体内SOD酶活性为37.26±2.24U/ml ;干细胞提取物保护的小鼠体内SOD酶活性虽然没有恢复到正常对照组水平，但是与模型组和阳性药VitC组比较，均具有大幅度的提高，说明干细胞提取物能够更加有效清除或者协助动物体内抗氧化系统清除体内的氧自由基等有害物质，从而使抗氧化平衡系统保持稳定。
[0058]图5是5个实验组的小鼠血浆中GPx活性的检测结果柱状图，从图5可以看出，第I组小鼠和第2组小鼠的GPx活性都比模型组和阳性药VitC组要好，从而保护了小鼠皮肤；其中第I组和第2组受试小鼠血浆中GPx酶活性分别是=1125.33 + 104.47U/ml,811.27 ±125.88U/ml ;模型组小鼠血浆中 GPx 酶活性是 591.55 ±176.47U/ml。
[0059]图6是5个实验组的小鼠血浆中MDA含量的检测结果柱状图，从图6可以看出，阴性对照组的MDA含量最低6.54±0.66nmol/ml，模型组的MDA含量最高25.92±1.16nmol/ml，人脂肪间充质干细胞提取物有效地降低了 MDA的含量，保持了体内抗氧化平衡系统。
[0060]5个实验组的小鼠皮肤组织的检测结果如下所示:
第I组:皮肤结构完整且清晰，和正常皮肤组织没有明显的差别，表皮及真皮层均未见明显增厚，未见炎症细胞浸润等现象；
第2组:真皮内的胶原纤维排列较为整齐，皮肤附件有少许的增生；
第3组(模型组):小鼠表皮厚度明显增加，真皮厚度急剧减少，胶原纤维异常增长且排列紊乱，皮肤附件也出现明显的增生，呈现出皮肤初期老化的特征；第4组(阳性对照组):表皮有一定的增生现象，皮肤深层胶原纤维排列较为松散；
第5组(阴性对照组):皮肤正常，没有明显的裂痕和增生现象，没有初期老化的特征。
[0061]由于维生素C是已知的具有良好防晒效果的药物，因此作为本实验的阳性药，而最终结果表明本发明的人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉的不同剂量组都有较好的对紫外线引起小鼠皮肤光老化的保护或修复作用，效果等同于或大于阳性对照组。
[0062]实施例6人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉的毒性评价
本实施例的人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉的毒性评价分为人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉的小鼠急性经口毒性试验(一次限量法)、人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉的大鼠急性经皮毒性试验(一次限量法)和人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉的家兔皮肤光毒性试验。
[0063]一、人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉的小鼠急性经口毒性试验(一次限量法) 样品:实施例3制备的人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉。
[0064]受试生物体:昆明小鼠。
[0065]试验方法:
前期体外实验的结果表明，人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉基本无毒，因此采用一次限量法证实其对生物体的安全性，即一次最大灌胃剂量采用其10倍实效标示药量(50.0±0.5Pg /支X 10支)的受试物对10只昆明小鼠(雌雄各半，体重为20.0g± 0.2g)进行灌胃，观察其毒性反应，当未引起动物死亡，则不再进行多个剂量的急性经口毒性试验。
[0066]观察期限:14天。
[0067]实验结果观察:未观察到试验动物有任何不良反应，亦没有动物死亡。
[0068]二、人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉的大鼠急性经皮毒性试验(一次限量法) 样品:实施例3制备的人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉。
[0069]受试生物体:SD大鼠(广东省动物实验中心)。
[0070]试验方法:
前期体外实验的结果表明，人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉基本无毒，因此采用一次限量法进一步证实其对生物体的安全性，即用10只动物(雌雄各半，体重为149.1±12.48)，皮肤涂抹200011^ /kg体重剂量的干细胞提取物水溶液，当未引起动物死亡，则不再进行多个剂量的急性经皮毒性试验。
[0071]观察期限:14天。
[0072]观察结果:未观察到试验动物有任何不良反应,亦没有动物死亡。
[0073]三、人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉的家兔皮肤光毒性试验 样品:实施例3制备的人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉。
[0074]受试生物体:成年白色家兔(广东省动物实验中心)50只，雌性各半。
[0075]UV 光源:波长为 320nm ~400nm 的 UVA。
[0076]照射时间:1.5h。
[0077]试验步骤:
进行正式光毒试验前18~24h，将家兔脊柱两侧皮肤去毛，试验部位皮肤需完好，无损伤及异常；备4块去毛区，每块去毛面积约为2cmX 2cm，去毛皮的试验安排如表1所示；将动物固定，根据下表，在动物去毛区I和2分别涂敷Iml含l(^g/ml、2(^g/ml受试物水溶液；30min后，左侧(去毛区I和3)用铝箔复盖，胶带固定，右侧用UVA进行照射，结束后分别于
1、24、48和72h观察皮肤反应，根据皮肤刺激反应评分表判断是否对皮肤有刺激反应，结果如表2所示。
[0078]表1动物去毛区的试验安排
【权利要求】
1.人脂肪间充质干细胞提取物，其特征在于该人脂肪间充质干细胞提取物是由如下方法制备而得: 步骤1.将人脂肪间充质干细胞经原代分离培养后，进行传代培养，取传代培养的P3~P30代人脂肪间充质干细胞，利用细胞生长液培养至细胞80%融合时，弃掉培养液，先用磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次，然后加入无血清培养液继续培养72小时后，收集无血清培养液，而未被收集的细胞进行后续处理； 步骤2.将步骤I未被收集的细胞利用消化液消化后，超声破碎仪破碎细胞，离心后收集上清； 步骤3、 将步骤I收集的无血清培养液和步骤2收集的上清混合后，过滤，收集过滤液对其浓缩，所得浓缩液再进行除菌处理后，则制备得到所需人脂肪间充质干细胞提取物。
2.根据权利要求1所述人脂肪间充质干细胞提取物，其特征在于所述步骤I中，细胞生长液是指含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，该培养液中还含有终浓度为200 U/ml的青霉素和终浓度为250 U/ml的链霉素。
3.根据权利要求1所述人脂肪间充质干细胞提取物，其特征在于所述步骤2中，消化液为经0.22Mm的滤膜过滤除菌的0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液。
4.根据权利要求1所述人脂肪间充质干细胞提取物，其特征在于所述步骤2中，超声破碎仪破碎细胞的条件为4°C、400W、超声3s、间隔6s，99个循环。
5.根据权利要求1所 述人脂肪间充质干细胞提取物，其特征在于所述步骤3中，步骤I收集的无血清培养液和步骤2收集的上清的混合比例为1:1，体积比。
6.根据权利要求1所述人脂肪间充质干细胞提取物，其特征在于所述步骤3中，过滤是采用孔径为0.45ΜΠ1的滤膜过滤，浓缩是采用截留分子量为3KD的过滤膜浓缩至原体积的的1/10，除菌处理是采用无菌的0.22ΜΠ1滤膜过滤除菌。
7.权利要求1-6所述任一项的人脂肪间充质干细胞提取物在制备伤口愈合药物、细胞修复药物、美白产品或皮肤抗皱产品中的应用。
8.人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉，其特征在于该冻干粉是由权利要求1-6所述任一项的人脂肪间充质干细胞提取物经冻干处理制备而得。
9.权利要求8所述人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉的制备方法，其特征在于该制备方法包括如下步骤: 向人脂肪间充质干细胞提取物中加入赋形剂和水，混合后过滤除菌，然后进行冻干处理，则制备得到人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉；所述赋形剂采用甘露醇、海藻糖或蔗糖中的任意一种，赋形剂占人脂肪间充质干细胞提取物总重量的5~10% ;所述冻干处理的冻干温度为-20~-35°C、真空度为50~200Pa，冻干48小时。
10.权利要求8所述人脂肪间充质干细胞提取物冻干粉在制备伤口愈合药物、细胞修复药物、美白产品或皮肤抗皱产品中的应用。
【文档编号】A61K35/34GK103784474SQ201410037863
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月26日 优先权日:2014年1月26日
【发明者】陈海佳, 王一飞, 舒辉萍, 刘秋英, 马岩岩 申请人:广州赛莱拉生物科技有限公司