一种葡萄花细胞提取物的提取方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及植物提取技术领域，具体设及一种提取葡萄花细胞提取物的方法及将 该提取物在护肤品中应用。
【背景技术】
[0002] 葡萄属植物全世界有60余种，分布于温带和亚热带。葡萄是著名的水果和酿酒原 料，在世界各地栽培的历史悠久。研究发现，葡萄属植物中含有大量的营养成分和非营养活 性成分，如糖、蛋白质、维生素、氨基酸、微量元素、踩质、巧类、祗类、黄酬、有机酸、酱类等， 主要有抗氧化、抗动脉硬化、抗血栓、抗胃溃瘍、抗菌、抗炎、抗癌等活性。
[0003] 葡萄的果、根、藤均可入药，果可解表透疹、利尿解毒，根、藤可枯风湿、止血、消食、 解毒、安胎，外用可治疗伤筋骨折。在中国传统医学中，葡萄常作为补气药，《神农本草经》曾 记载其果实有"益气倍力，强志，令人肥健"的功效。但葡萄花的应用却少之又少，在美容护 肤上的使用更是未有发现，但葡萄花含有丰富的的花青素巧等，具有很强的抗氧化作用，是 理想的美容抗衰成分。
[0004] 要推广使用葡萄花的活性物质，必须能够有效地提取到大量的葡萄花提取物。现 有植物提取一般是采用植株进行提取，但植株生长需要多年时间，而且受到地域，气候，季 节W及病虫害等的影响与威胁，其提取物品质不稳定，其效果难W控制。因此，研究如何获 取大量的品质稳定的葡萄花提取物是推广应用葡萄花提取物必须解决的难题。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种葡萄花细胞提取物的提取 方法，该方法能够高效地获取大量品质稳定的葡萄花提取物。
[0006] 发明人经研究发现，对葡萄花进行组织培养后体获得的葡萄花细胞提取物同样含 有葡萄花提取物的成分，同样具有很强的抗氧化作用，是理想的美容抗衰老用品，因此，本 发明的技术原理是：
[0007] 采集新鲜的葡萄花进行清洗，然后接种在MS培养基中进行黑暗培养，直至长出愈 伤组织再进行传代培养，获得葡萄花细胞株做为提取葡萄花提取物的原料，再提取葡萄花 细胞提取物。
[000引本发明具体的技术方案如下；
[0009] 一种葡萄花细胞提取物的提取方法，其包括W下步骤：
[0010] (1)采集葡萄花花蕾，清洗干净；
[0011] 似将葡萄花花蕾接种到MS培养基中黑暗培养；
[0012] (3)待长出愈伤组织后进行传代培养；
[0013] (4)收集传代扩增后的葡萄花细胞，经冷冻干燥后磨成粉末。
[0014] 优选地，步骤（1)选取无核白的小花蕾，用水冲洗后，用酒精消毒，再用无菌水冲 洗，然后用化CIO溶液浸泡，最后再用无菌水冲洗。
[0015] 优选地，所述 MS 培养基为 MS+2,4-D 1.0(mg ? kl)+6-BA 1. 126(mg ? kl)。
[0016] 优选地，步骤似黑暗培养的温度为25°C恒温培养。
[0017] 优选地，步骤（3)传代培养的周期为每四周传代一次，传代培养W 40ml培养基 1~2g细胞传代。
[001引优选地，步骤（4)研磨的粉末过40目筛。
[0019] 发明人经研究发现，上述葡萄花细胞提取物具有较强的抗氧化作用，且对皮肤无 刺激，因此，本发明还提供了葡萄花细胞提取物的用途，将葡萄花细胞提取物应用在护肤品 中。
[0020] 优选地，所述护肤品为面膜、面箱、洁面乳、爽肤水、乳液、精华素、眼箱。
[0021] 优选地，所述护肤品为抗衰老护肤品。
[0022] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0023] 1、本发明通过接种葡萄花进行组织培养来为获取葡萄花细胞提取物提供原材料， 原材料不再受地域、气候等自然条件限制，而且化学性质稳定，为推广应用葡萄花提取物奠 定了基础。
[0024] 2、本发明的葡萄花细胞提取物具有较强的抗氧化能力，对皮肤无刺激，适合应用 于护肤品中，尤其是抗衰老的护肤品中。
【附图说明】
[0025] 图1为DPPH法测定葡萄花细胞提取物及葡萄花提取物清除自由基的能力的结果 图；
[0026] 图2为用TU肥L法测定葡萄花细胞提取物及葡萄花提取物对人真皮成纤维细胞生 长的影响的结果图。
【具体实施方式】
[0027] 下面通过具体实施例子对本发明做进一步详细阐述，W便清楚理解本发明所要保 护的技术方案。
[002引实施例1葡萄花细胞提取物的提取方法
[0029] 1. 1外植体的采集及清洗：取无核白（Vitis vinifera L. CV. Thompson Seed-less)的小花蕾。在开花前5~12天，取花序长为8~11cm，花穗上密集的小花蕾， 单个小花蕾大小1. 5~1. 8mm，用流水冲洗1~12h，70%酒精消毒30~160s，无菌水冲洗 3次，再用有效氯0. 5~12%的化CIO溶液（加入1滴Tween-20)浸泡10~130min，再用 无菌水冲洗3次，备用。
[0030] 1. 2外植体的接种：把消好毒的小花蕾接种到含有1. 0 (mg ? kl)的2,4-D ; 1. 126 (mg ? kl)的6-BA的MS培养基中，25°C黑暗培养，直至长出愈伤组织，每四周传代一 次，传代W每40ml培养基1~2g细胞传代。
[0031] 1. 3收获增植后的鲜细胞，称重后，经冷冻干燥后研磨成粉末（过40目筛）。
[0032] 实施例2葡萄花提取物的提取方法
[0033] 2. 1 取无核白（Vitis vinifera L. CV. Thompson Seed-less)的小花蕾，在开花前 5~12天，花序长为8~11cm，花穗上密集的小花蕾，单个小花蕾1. 5~1. 8mm，流水冲洗干 净干净。
[0034] 2. 2加入等体积的蒸馈水，超声破碎后，再绞碎，200g离屯、lOmin，1上清液经冷冻 干燥后研磨成粉末（过40目筛）。
[0035] 实施例3葡萄花细胞提取物及葡萄花提取物的抗氧化实验
[0036] DPK1法测定提取物清除自由基的能力；用实例1制备的葡萄花细胞提取物及实施 例2制备的葡萄花提取物清除自由基的能力。
[0037] 精密称定0. 05g葡萄花细胞提取物及葡萄花提取物，己醇定容至10血。室温浸 泡静置12h，上清液分别配制浓度为0. 2mg/血己醇溶液，作为实验组。用0. 2mg/ml的抗 坏血酸作为对照组。细胞提取物与用己醇配制的0. 2mg/ml的DPPH等体积反应完全30min 后，记录最终吸光度。自由基清除率（％) = [1-(样本加入DPPH的吸光度-样本的吸光 度）/DPPH的吸光度]X100%。实验结果见附图1。
[003引由图1可知，葡萄花细胞提取物及葡萄花提取物均有对抗自由基的作用，且两者 的作用效果相差不大。
[0039] 实施例4葡萄花细胞提取物及葡萄花提取物对光老化人皮肤纤维细胞调亡的影 响
[0040] 用TU肥L法测定葡萄花细胞提取物及葡萄花提取物对人真皮成纤维细胞生长的 影响。
[0041] 检测样品；实施例1制备的葡萄花细胞提取物及实施例2制备的葡萄花提取物。
[0042] 受试生物体；HSF细胞。
[0043] 具体步骤如下所示：
[0044] (1)利用 10% (v/v)FBS 的 DMEM/F12 培养基（青霉素 200U/m