一种具有抗氧化活性的发菜细胞及发菜提取物的制备方法

专利名称：：一种具有抗氧化活性的发菜细胞及发菜提取物的制备方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
的微藻细胞，尤其是涉及一种属于具有抗氧化活性的发菜细胞粉及发菜提取物——胞外多糖和细胞提取液的制备方法。
背景技术：
：在生命活动的代谢过程中，会不断产生各种自由基，其中超氧阴离子自由基(02—)和羟自由對OH)是两种具有代表性的自由基。人体在正常生理作用下产生的超氧阴离子自由基会被超氧化物岐化酶SOD作用生成H202，而H202可迅速被细胞内的过氧化酶除去，当这些酶不足时或者生成or过多，特别是在电离辐射、紫外线或某些药物作用下，体内可以产生大量的or，如果无法及时去除，11202可与另一02-，在变价铁离子催化作用下会迅速生成氧化性更强的羟基自由基(OH)。体内的活性氧物质主要是单线态氧和过氧化氢，只要利用抗氧化剂来清除或阻断这些活性氧的生成，这些自由基就不会对机体造成损伤。很多疾病如衰老、肿瘤、心血管疾病的病理生理过程都与存在过量的自由基有关，因此寻找有效的抗氧化剂具有重要意义。发菜(A^wtoc7/a/ge//^me)为分布于我国北部和西北部干旱半干旱地区的一种陆生经济蓝藻，营养极为丰富，每100g野生发菜中含蛋白质22.8g、钙875mg、镁132mg、铁99.3mg、锌1.67mg、铜0.72mg、磷66mg、硒7.45mg;发菜还含有18种氨基酸，以及超氧化物歧化酶(SOD)。野生、自养(20d)和混养(8d)的发菜中分别含有胡萝卜素1.39%、1.19%、2.29%，藻蓝蛋白1.23%、1.13%、4.46%。研究发现，SOD是清除自由基主要酶之一，它在机体内催化超氧阴离子自由基歧化为氧气和过氧化氢，后者经过过氧化氢酶和过氧化物酶的作用得到清除。类胡萝卜素也是一种天然抗氧化剂，能够保护敏感组织及反应化合物不致受到氧化损伤，其分子结构中含有多个共轭双键，能减少自由基对细胞遗传物质(DNA、RNA)和细胞膜(如蛋白质、脂质和碳水化合物)的损伤，系统中一旦形成高度活泼具有损伤能力的自由基，它们就靠近蛋白质、脂质和核酸等细胞的重要组分，对它们进行强烈破坏。硒是人体必需的微量元素，在体内主要起抗氧化作用，它能使细胞膜中的脂类免受过氧化氢和过氧化物的损害，发菜中丰富的营养成分使其有望成为天然抗氧化剂和功能性食品。通过检索，发现我国公布的有关发菜细胞培养的专利有2004年11月3日国家知识产权局公布由中国科学院水生生物研究所毕永红、胡征宇等人发明的"一种培养发菜细胞的方法"，专利号为02138828.8。此发明是将原种发菜匀浆获得匀浆液，此时的发菜细胞为藻丝体状态，实际上是发菜藻丝体的液体培养。2006年3月8日国家知识产权局公布了我们在2003年3月14日申请的名称为"一种发菜细胞培养联产发菜多糖的方法"的发明专利(专利号为-ZL03119101.0)。此发明是从野生发菜藻体中分离获得可长期保藏的发菜细胞种，进行发菜单体细胞液体悬浮培养工作。该发菜细胞种经扩培以后，在气升式反应器中进行光合自养培养，最后收集发菜细胞培养物和培养液，从培养物、培养液中提取发菜多糖或直接作为功能性食品、药物生产的原料。2005年12月1日我们申请了另一专利，名称为"发菜细胞固态培养的方法"(申请号为200510122059.9)，此发明是将液体悬浮培养获得的发菜细胞培养物接种于固态培养基质表层，在人工控制或自然条件下培养发菜细胞，并进行干湿节律培养，提供可控的适宜培养条件，实现完全人工培养或野外扩大培养，解决了发菜在人工控制或自然条件下相对快速生长的问题。接着在2006年4月29日我们又申请了一项名称为"稳定高产发菜多糖的发菜细胞高密度培养的方法"的发明专利(申请号为2006100113589.4)，此发明建立了高密度培养工艺，采用混合营养或异养培养模式，突破了传统的发菜细胞生长的光合自养模式，减少了培养过程中对光的依赖性，添加有机碳源大大提高了发菜细胞的生长速度，縮短培养周期同时提高多糖产量。另外我们2006年在日本申请国际专利两项"髪菜細胞^培養i髪菜多糖O抽出金U>夕$廿《行,t灼0方法.(C12N1/12PF5483);髪菜細胞O固体培養方法.(C12N1/12PF5482)"。发菜细胞的高密度培养和发菜多糖的高产为实现发菜细胞及发菜提取物在抗氧化方面的应用提供了重要的基础支持。
发明内容本发明的目的是提供一种具有抗氧化活性的发菜细胞及发菜提取物的制备方法，所制备的发菜细胞粉、细胞提取液及胞外多糖能够有效地清除超氧阴离子自由基，而细胞提取液对羟自由基也有很强的清除能力。本发明得目的是这样实现的一种具有抗氧化活性的发菜细胞及发菜提取物的制备方法，其制备方法的步骤是(1).制备发菜细胞培养液采用BG11培养基进行液体悬浮培养，在2030。C培养2535d，每天光照时间1015h，得到发菜细胞培养液；(2).制备发菜细胞粉将发菜细胞培养液在45005500r/min、离心1020min得到细胞沉淀，收集细胞冷冻干燥，研磨粉碎即得到发菜细胞粉，35。C密封保存备用，上清液用来提取胞外多糖；(3).提取发菜胞外多糖将上清液超滤浓縮，采用截留分子量为10000的中空纤维膜超滤装置，对经预处理的上清液脱水浓縮并除去小分子物质。得到的浓縮液用3~5倍体积95%乙醇沉淀，35°C静置2030h，离心得到沉淀即为发菜胞外多糖，冷冻干燥保存；(4).制备发菜细胞提取液取备用的发菜细胞粉，加入使其浓度相当于20mg/mL的50mmol/LpH7.0的磷酸盐缓冲液，一20。C4。C反复冻融五次，35°C800011000r/min离心1020min，取上清液即为发菜细胞提取液，35"C保存备用。而且，所述发菜细胞包括自养发菜细胞和混养发菜细胞，且采用混养培养发菜细胞时，采用添加葡萄糖的BG11培养基。本发明的优点和积极效果是本发明所得的发菜细胞粉、胞外多糖和细胞提取液具有清除超氧阴离子自由基的活性，细胞提取液具有清除羟自由基的活性，是潜在的天然抗氧化剂和功能性食品。具体实施例方式下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。一种具有抗氧化活性的发菜细胞及发菜提取物的制备方法，其制备方法的步骤是U).制备发菜细胞培养液自养发菜发菜细胞的自养培养采用BG11培养基进行液体悬浮培养，在25"C培养30d，每天光照时间12h。在采用混合营养培养发菜细胞时，采用添加葡萄糖的BG11培养基。(2).制备发菜细胞粉将自养或者混养发菜细胞培养液在5000r/min、离心15min分别得到细胞沉淀，分别收集细胞并冷冻干燥，研磨粉碎即得到自养或者混养发菜细胞粉，然后在4t:温度条件下分别密封保存备用，收集二者的上清液用于制备胞外多糖。(3).提取发菜胞外多糖分别将上述两种上清液超滤浓縮，采用截留分子量为10000的中空纤维膜超滤装置，对经预处理的上清液脱水浓縮并除去小分子物质，二者得到的浓縮液分别用4倍体积95%乙醇沉淀，4°C静置24h，离心得到沉淀即为养或者混养发菜胞外多糖，冷冻干燥保存；(4).制备发菜细胞提取液取自养或混养的发菜细胞粉各0.5g，分别加入25mL50mmol/LpH7.0的磷酸盐缓冲液，反复冻融五次，8000r/min4。C离心15min，取上清液即为二者的发菜细胞提取液，认为其浓度相当于20mg/mL，4'C保存备用，实验中稀释到所需浓度。下面通过实验来进一步验证本发明的创造性实验l:对本实施例制得的自养和混养的发菜细胞粉、胞外多糖、细胞提取液进行体外清除超氧阴离子自由基实验。试剂N-甲基吩嗪硫酸盐(PMS)、还原性辅酶I二钠盐(NADHNa2)、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，浓盐酸。方法称取细胞粉和多糖50mg，配制成浓度为2mg/mL的溶液，将细胞粉溶液、多糖溶液、细胞提取液分别稀释到以下浓度0.4、0.8、1.6mg/mL。稀释细胞粉时，应先将其溶液充分混匀。由NADH/PMS体系产生超氧阴离子(02—)，02—可将NBT还原为蓝紫色物质formazane，产物稳定且不溶于水。用Tris-HCl缓冲液(20mmol/L，pH8.0)配制80umol/LPMS、400umol/LNADHNa2、200umol/LNBT，反应体系为lmLPMS、lmLNADHNa2、lmLNBT以及lmL样品溶液。以去离子水为参比，以缓冲液代替样品做为空白，以lmL样品溶液、lmLNADHNa2、lmLNBT和lmL缓冲液作为每个待测样品的对照。加入试剂后摇匀，室温反应5min，于560nm波长处测定吸光度值(A)并计算清除率。清除率=[1一(A样品一A对照)/A空s]X100。/。。测定含细胞粉的体系的吸光度时，用移液枪吸取上清液，测定上清液的A560。结果体外清除超氧阴离子自由基作用的测定结果(％)0.4mg/ml>0.8mg/mL1.6mg/mL自养发菜细胞粉45.28土(U762.73±0.5872.33±0.47混养发菜细胞粉32.27±0.2543.3±0.4253.85±0.34自养发菜胞外多糖54.02±0.5270.46±0.2485.59±0.38混养发菜胞外多糖27.9±0.2941.62±0.4359.17±0.17自养发菜细胞提取液39.54±0,1967.43±0.578.84±0.33混养发菜细胞提取液29.9±0.4152.89±0.5368.87±0.34实验2:对本实施例制得的自养和混养发菜的细胞粉、胞外多糖、细胞提取液进行体外清除羟自由基实验。试剂30%过氧化氢、硫酸亚铁、水杨酸。方法溶液的配制同实施例4。采用H2(VFe^体系，通过Fenton反应生成OH，H202+Fe2+—OH+H20+Fe3+，羟自由基氧化水杨酸得到紫色2，3-二羟基苯甲酸，测定其510nm处的吸光值，吸光值与OH的量成正比。反应体系中含1mLH202(4.9mmol/L)，lmLFeS04(4.5mmol/L)，lmL水杨酸(4.5mmol/L，用乙醇溶解)，lmL不同浓度的样品溶液(0.4、0,8、1.6mg/mL)。11202最后加入用来启动整个反应。37'C保温30min，以去离子水为参比，以去离子水代替样品为空白，以lmL样品溶液、lmLFeS04、lmL水杨酸(乙醇溶解)和lmL去离子水作为每个样品的对照，在510nm测量各浓度的吸光度。清除率=[1一(A样品一A对照)/A空白]X1000/0。结果体外清除羟自由基作用的测定结果(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求1.一种具有抗氧化活性的发菜细胞及发菜提取物的制备方法，其特征在于制备方法的步骤是(1).制备发菜细胞培养液采用BG11培养基进行液体悬浮培养，在20～30℃培养25～35d，每天光照时间10～15h，得到发菜细胞培养液；(2).制备发菜细胞粉将发菜细胞培养液在4500～5500r/min、离心10～20min得到细胞沉淀，收集细胞冷冻干燥，研磨粉碎即得到发菜细胞粉，3～5℃密封保存备用，上清液用来提取胞外多糖；(3).提取发菜胞外多糖将上清液超滤浓缩，采用截留分子量为10000的中空纤维膜超滤装置，对经预处理的上清液脱水浓缩并除去小分子物质。得到的浓缩液用3～5倍体积95％乙醇沉淀，3～5℃静置20～30h，离心得到沉淀即为发菜胞外多糖，冷冻干燥保存；(4).制备发菜细胞提取液取备用的发菜细胞粉，加入使其浓度相当于20mg/mL的50mmol/LpH7.0的磷酸盐缓冲液，—20℃～4℃反复冻融五次，3～5℃8000～11000r/min离心10～20min，取上清液即为发菜细胞提取液，3～5℃保存备用。2.根据权利要求l所述的一种具有抗氧化活性的发菜细胞及发菜提取物的制备方法，其特征在于所述发菜细胞包括自养发菜细胞和混养发菜细胞，且采用混养培养发菜细胞时，采用添加葡萄糖的BG11培养基。全文摘要本发明涉及一种具有抗氧化活性的发菜细胞及发菜提取物的制备方法，能够获得有效清除超氧阴离子自由基和羟自由基的发菜细胞粉、胞外多糖和细胞提取液。该制备方法是将自养和混养的发菜细胞研磨粉碎获得细胞粉，从自养和混养的发菜细胞培养液中提取自养和混养发菜胞外多糖，取细胞粉加入磷酸盐缓冲液，反复冻融五次离心取上清液得到细胞提取液。本发明所得的发菜细胞粉、胞外多糖和细胞提取液具有清除超氧阴离子自由基的活性，细胞提取液具有清除羟自由基的活性，是潜在的天然抗氧化剂和功能性食品。文档编号C08B37/00GK101372668SQ20081015229公开日2009年2月25日申请日期2008年10月10日优先权日2008年10月10日发明者乔长晟,瑾姚,岳思君,李志刚,苏建宇,鹏许,谭之磊,贾士儒申请人:天津科技大学