一种具有促进神经细胞生长的山核桃提取物的提取方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有促进人类神经细胞生长发育的山核桃提取物的提取方法，该方法由以下步骤组成：采摘成熟的山核桃，风干后去壳得山核桃仁；将山核桃仁进行液氮速冻0.5min-10min后弃去液氮，得速冻后的山核桃仁；将速冻后的山核桃仁用粉碎机粉碎，得山核桃粉末；山核桃粉末用石油醚水浴加热回流萃取，得萃取液；萃取液用旋转蒸发仪旋转蒸发直至石油醚完全蒸发，得山核桃提取物。本发明提取工艺简单易行，采用该方法提取的山核桃提物，具有显著的促进人类神经细胞突触生长、保护神经细胞的作用。
【专利说明】—种具有促进神经细胞生长的山核桃提取物的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物提取【技术领域】，具体涉及一种具有促进神经细胞生长的山核桃提取物的提取方法。
【背景技术】
[0002]根据第五次全国人口普查的资料，2000年我国已经步入了老龄化社会，而且老龄化进程在不断加快。截至到2007年底，我国65岁及以上人口占总人口的比例已达9.35%。根据联合国预测，到2030年，这一比例在我国将达到15.9% ;到2050年，将增至23.3%。从绝对数看，2010年，我国65岁及以上人口数量达到1.11亿；2020年将达到1.8亿，2030年将高达2.36亿，2050年更高达3.31亿。21世纪的中国将是不可逆转的老龄化社会，这不仅仅是老龄化的人口结构的问题，更是潜在的健康问题，尤其是神经方面的健康问题。现今生活压力普遍增大，年轻时拼命赚钱，老来拿钱买命，这种状况导致如今的老年人疾病和生理紊乱等风险升高，慢性病患病率不断增加，包括神经衰退、脑血管病、糖尿病等。另外老年人由于缺少足够的陪伴，孤独感倍增，神经衰退更加明显，患神经方面的疾病的风险也上升，这是个潜在的健康难题。[0003]山核桃是补脑的绿色食品，常食山核桃，还具有健脾开胃，润肺强肾、滋补康复、预防冠心病、降低血脂之功效，其中补脑健脑功效更是人尽皆知。古人李时珍有说:核桃能“补肾通脑，有益智慧”，且在《本草纲目》记载，山核桃味甘性平，能补气益血，调燥化痰，温补肾肺，定喘。经常吃山核桃能滋养血脉、增进食欲、乌黑须发，而且还能医神经衰弱、记忆衰退等疾患，所以民间有“常食核桃油，白发老翁戏牦牛”之谤语。从现代营养学、生命科学的角度来看，山核桃中含有17种氨基酸，总量达到27.20%,其中谷氨酸含量最高，占氨基酸中的20.19%，而谷氨酸具有健脑作用，能促进脑细胞进行呼吸，有利于脑组织中代谢产物氨的排除，保护脑组织免受氨中毒。另外核仁中还含有8种脂肪酸，总含油率为69.8~74.0%，其中不饱和脂肪酸占总脂肪酸的88.38~95.78%，主要有油酸、亚油酸，这些是人体所必需的且人体又不能自身合成的脂肪酸。有研究表明，核桃油含有的抗氧化剂可以消除体内自由基，恢复人体脏腑器官的健康状态，能防止脑衰老，并能延年益寿，另外山核桃油中含有丰富的微量元素角鲨烯、黄酮类物质和多酚化合物等，能增强人体的免疫力，延缓衰老。科学调查的结果证明，由于长期食用核桃油，地中海沿岸居民很多健康的身体指标都居世界前列。用核桃油做食用油，可以形成真正健康合理的膳食结构。地中海成为世界三大疾病(老年痴呆症、心脑血管疾病、肿瘤)发病率最低的地区。核桃油产品的营养成分中，人体不能合成的亚麻酸和亚油酸的比值和母乳相似，且极易吸收，能促进婴幼儿神经和骨骼的生长发育，因此，亦是孕妇极佳的营养品和胎儿生长剂。
[0004]有大量文献及民间证据表明，山核桃油是具有补脑功效的，然而对于其补脑健脑的效果、作用机制及具体功能因子(物质基础)的发掘做的还远远不够。众所周知，山核桃营养丰富，民间普遍认为是补脑的好食品，但近几年的研究基本关注于山核桃和某些提取物的作用表型和效果的研究，例如以小鼠为模型，研究山核桃对于学习能力和记忆能力的影响，很少对山核桃及其提取物神经保护作用的作用机理进行研究。
[0005]SH-SY5Y是来源于1970年建立的人类神经母细胞瘤患者的转移骨瘤灶细胞株，该细胞株表达神经细胞特有的多巴胺-β-羟基酶活性及其它神经细胞特有的结构蛋白，如神经纤维蛋白NF58、NF160和NF200等，因此该细胞模型被广泛地应用在神经生物学、神经化学和神经毒理学的研究中，是一个成熟的体外神经细胞实验模型，可以用来检测活性化合物对神经细胞的发育和受伤神经细胞功能的修复。
【发明内容】
[0006]针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的是提供一种具有促进神经细胞生长发育的山核桃提取物的提取方法。
[0007]所述的一种具有促进神经细胞生长的山核桃提取物的提取方法，其特征在于该方法由以下步骤组成:
1)预处理:采摘成熟的山核桃，风干后去壳得山核桃仁；
2)液氮速冻:将步骤I)制得的山核桃仁进行液氮速冻0.5min-10min后弃去液氮，得速冻后的山核桃仁；
3)粉碎:将步骤2)制得的速冻后的山核桃仁用粉碎机粉碎，得山核桃粉末；
4)石油醚萃取:将山核桃粉末用石油醚水浴加热回流萃取，得萃取液；
5 )将萃取液用旋转蒸发仪旋转蒸发直至石油醚完全蒸发，得山核桃提取物。
[0008]所述的一种具有促进神经细胞生长的山核桃提取物的提取方法，其特征在于步骤
2)中山核桃仁以料液的重量体积比为1:2-5的液氮进行速冻。采用液氮处理即可有效保证山核桃仁内含有的活性成分不被破坏，同时经液氮处理后的山核桃仁变脆变硬，便于后续粉碎工艺的进行。
[0009]所述的一种具有促进神经细胞生长的山核桃提取物的提取方法，其特征在于步骤
3)中山核桃粉末过100目筛。
[0010]所述的一种具有促进神经细胞生长的山核桃提取物的提取方法，其特征在于步骤
4)中山核桃粉末以料液的重量体积比为1:15-25的石油醚进行水浴加热回流萃取，萃取温度50-80°C，萃取时间l_7h。
[0011]所述的一种具有促进神经细胞生长的山核桃提取物的提取方法，其特征在于所述山核桃为产地临安的山核桃。临安山核桃产量丰富，营养价值高。
[0012]本发明一种具有促进神经细胞生长发育的山核桃提取物的提取方法，提取工艺简单易行，通过将山核桃仁液氮速冻，保证其活性成分不被破坏，同时方便粉碎成粉状，石油醚萃取，可保证山核桃仁脂溶性成分被提出，以SH-SY5Y-EGFP (绿色荧光)为神经细胞模型，用山核桃提取物处理神经细胞，研究神经细胞突触的个数和长度，为进一步研究山核桃提取物对神经细胞的保护作用及其作用机制打下基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为空白组绿色荧光细胞突触观察图；
图2为实验组绿色荧光细胞突触观察图；
图3为阳性组绿色荧光细胞突触观察图；图4为实验组、空白组及阳性组突触平均长度图；
图5为实验组、空白组及阳性组40 μ m以上的突触所占比例图。
【具体实施方式】
[0014]本发明下面结合实施例予以进一步详述。其创新之处在于和其他普通提取物做产品不同，本发明利用人类神经细胞模型，在细胞水平研究山核桃提取物促进人类神经细胞生长发育的作用机理，从而为山核桃提取物在食品保健领域的应用提供科学依据，推动山核桃深加工产业的发展。
实施例
[0015]采摘成熟的临安山核桃，于通风处风干后去壳得IOg鲜山核桃仁，然后迅速将IOg鲜核桃仁用20-50ml的液氮速冻0.5min-10min后弃去液氮,得速冻后的硬脆的山核桃仁；然后将速冻后的山核桃仁用粉碎机粉碎，过100目筛得山核桃粉末；山核桃粉末用150-250ml石油醚于水浴温度为50_80°C的温度条件下加热回流萃取l_7h得萃取液；将萃取液于旋转蒸发仪中直至石油醚完全挥发，得山核桃提取物6ml。
[0016]实验例
取山核桃提取物与DMSO按体积比1:3-8的比例进行混合，然后于120-200rpm摇床上摇1-4小时充分混匀制得混合物，分别取2.5 μ 1、5 μ 1、10 μ I混合物作用于人类神经细胞，每2-3天换细胞培养基一次，换培养基之后再次加入同样量的混合物，连续培养5-10天，最后分别对应制得山核桃提取物与培养基质量体积浓度为0.lmg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml的三组实验例，观察并统计神经细胞突触长度，通过显著性分析，发现实验组与空白组有显著性差异。其中，空白组为0.1%DMS0,阳性组为碱性纤维生长因子bFGF。
[0017]表达绿色荧光蛋白EGFP的人类神经细胞株SH-SY5Y-EGFP从杭州纽龙生物科技有限公司购得。
[0018]不同实验组、空白组及阳性组绿色荧光细胞突触观察图，见图1-3，由图1-3可知:山核桃提取物具有促进人类神经细胞突触生长的作用。
[0019]三组实验例组成的实验组、空白组及阳性组对促进人类神经细胞突触平均长度的影响，见图4，由图4可知:山核桃提取物对人类神经细胞突触平均长度的促进作用随着提取物剂量的增加而加强。
[0020]三组实验例组成的实验组、空白组及阳性组对促进人类神经细胞40 μ m以上突触数量的影响；结果见图5，由图5可知:山核桃提取物显著增加了人类神经细胞40 μ m以上突触的数量，并且这种促进作用随着提取物剂量的增加而加强。
[0021]由图1-5可知:山核桃提取物具有显著的促进体外神经母瘤细胞突触增长的作用。
【权利要求】
1.一种具有促进神经细胞生长的山核桃提取物的提取方法，其特征在于该方法由以下步骤组成: 1)预处理:采摘成熟的山核桃，风干后去壳得山核桃仁； 2)液氮速冻:将步骤1)制得的山核桃仁进行液氮速冻0.5min-10min后弃去液氮，得速冻后的山核桃仁； 3)粉碎:将步骤2)制得的速冻后的山核桃仁用粉碎机粉碎，得山核桃粉末； 4)石油醚萃取:将山核桃粉末用石油醚水浴加热回流萃取，得萃取液； 5 )将萃取液用旋转蒸发仪旋转蒸发直至石油醚完全蒸发，得山核桃提取物。
2.根据权利要求1所述的一种具有促进神经细胞生长的山核桃提取物的提取方法，其特征在于步骤2)中山核桃仁以料液的重量体积比为1:2-5的液氮进行速冻。
3.根据权利要求1所述的一种具有促进神经细胞生长的山核桃提取物的提取方法，其特征在于步骤3)中山核桃粉末过100目筛。
4.根据权利要求1所述的一种具有促进神经细胞生长的山核桃提取物的提取方法，其特征在于步骤4)中山核桃粉末以料液的重量体积比为1:15-25的石油醚进行水浴加热回流萃取，萃取温度50-80°C，萃取时间l_7h。
5.根据权利要求1所述的一种具有促进神经细胞生长的山核桃提取物的提取方法，其特征在于所述山核桃为产地临安的山核桃。
【文档编号】A61P25/00GK103893257SQ201410110290
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月24日 优先权日:2014年3月24日
【发明者】钱永常, 黄坚钦, 王向军, 周瑜, 高飞 申请人:浙江农林大学