一种阻断帕金森患者淋巴细胞周期的药物及制备方法与流程

本发明属于医药生物技术领域，涉及一种运用脐血源神经干细胞和环孢素A以及维生素B₁₂复合药阻断人类发散性帕金森疾病淋巴细胞的细胞周期应用。

背景技术：

大约90 %的帕金森患者属于散发性帕金森，平均年龄大约60岁，持续15年左右。到目前为止，治疗帕金森疾病的临床措施主要是对症治疗------用左旋多巴或多巴胺激动剂补充脑部缺失的多巴胺，然而，长期的多巴胺替代药物疗法却极易引发患者的副作用，例如：动作迟缓。可以说，能够用于临床上治疗帕金森的药物是极其有限，而且药效也不是很理想，只能稍微缓解帕金森患者的初期症状，不能完全阻止疾病的进展，临床的治愈可能几乎为零。因此，开发新的神经保护药物用于阻断或减缓帕金森疾病进程就显得至关重要，我们把目光放在脐血源神经干细胞药物上。

脐血源神经干细胞用于治疗人类帕金森疾病是非常有前景的，这属于一种利用细胞疗法对人类神经退行性疾病的治疗方案。脐血因其具有胚胎细胞的特性，所以它可以分化成神经干细胞。脐带血多能干细胞是一种发现较晚的一类脐带血干细胞。脐血源神经干细胞与其他来源的干细胞相比具有独特的优势：首先，来源充足，易于分离，纯度高，无肿瘤细胞污染，并且具有很强的增殖能力；其次，不涉及伦理道德问题，易于产业化制备；再次，对捐赠者无任何危害和损伤；最后，避免像其它来源的神经干细胞移植那样产生异体的免疫反应，也就是我们常说的移植物抗宿主反应。

帕金森患者的发病机理是由于体内纹状体和黒质部位严重缺少多巴胺能神经元，试想如果能够适时适量补给机体损失的细胞，一定就会对病情起到缓解乃至达到治愈的作用。细胞疗法是指用细胞或组织移植来达到治疗损伤机体的目的，该方法安全可靠。脐血源神经干细胞作为一类具有多分化潜能和自我更新能力的细胞，一旦植入帕金森患者体内，就能够在损伤区域分化为具有修复功能的多巴胺能神经细胞，并与宿主神经进行有机整合，逐步恢复损伤的神经功能。未分化的脐血源神经干细胞主要是利用本身的环境富集作用，在帕金森疾病发生的相应部位起到消除有毒物质，进而进行脑损伤组织的修复再生，以此创建辅助的神经网络。细胞疗法用于帕金森疾病的治疗将会是一种有效的治疗手段。

技术实现要素：

本发明的目的是弥补现有药物治疗手段的不足之处，脐血源神经干细胞和环孢素A以及VB12复合药具有阻断发散性帕金森患者淋巴细胞的细胞周期的活性，具有广泛的应用前景，可能成为临床上治疗帕金森疾病的潜在治疗手段。

本发明的技术方案是：一种阻断帕金森患者淋巴细胞周期的药物，其特征在于：由以下组分组成，1X10⁶细胞/ml脐血源神经干细胞和20-60ng/ml环孢素A以及2-10 ng/ml 维生素B₁₂。

本发明由以下组分组成，1X10⁶细胞/ml脐血源神经干细胞和50ng/ml环孢素A以及4ng/ml 维生素B₁₂。

本发明由以下步骤组成，淋巴细胞接种于含有10 %胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃，5 ％ CO₂培养箱中悬浮培养；待淋巴细胞生长到70-80 %，用1X10⁶/ml脐血源神经干细胞和50 ng/ml环孢素A以及4 ng/ml维生素B₁₂培养24 h即可。

DMEM培养基是 dulbecco's modified eagle medium的缩写；

DMEM的特性：

(1)氨基酸含量为依格尔培养基的2倍，且含有非必需氨基酸，如甘氨酸等;

(2)维生素含量为依格尔培养基的4倍;

(3)含有糖酵解途径中的重要物质------丙酮酸;

(4)含有微量的铁离子。

环孢素A是由11个氨基酸组成的环状多肽类物质，它是一种选择性作用于机体T淋巴细胞的强效免疫抑制剂，临床上主要用于肝、肾以及心脏移植的抗排异反应，也可与肾上腺皮质激素同用，治疗患者的免疫系统疾病。维生素B12（VB12）为B族维生素之一，是一类含钴的复杂有机化合物。VB12是神经系统功能健全不可缺少的维生素，参与神经组织中一种脂蛋白的形成，当机体内缺乏VB12时，可引起神经障碍，脊髓变性以及周围神经炎，临床表现有患者的情绪异常，表情呆滞以及反应迟钝等等。

以下是本发明针对某医院康复科室诊断20名患者为散发性帕金森疾病的病人做出的实验数据，其中：12男，8女，选择20名年龄相仿的健康人作为对照组，对照组是帕金森患者的家人或者看护者，分别从散发性帕金森疾病和健康人中的外周血样中分离纯化淋巴细胞。

1）、增殖能力检测：用CCK-8法检测细胞增殖情况，在96孔板中接种细胞悬液（100 μl/孔），将培养板放在培养箱中预培养一段时间（37 ℃，5 % CO₂）。向每孔加入10 μl CCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数），将培养板在培养箱内孵育1-4小时，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

2）、细胞周期检测：首先，收集每个实验组的淋巴细胞，并用70 %乙醇固定并使细胞透化；然后，用PBS冲洗细胞，并用0.5 ml含有20 U/ml RNase的50 μg/ml PI溶液孵育30 min；最后，用流式细胞仪检测细胞周期。

（1）样品制备

收集细胞，1000 rpm，离心5 min。弃上清，加入适量1 × PBS溶液，并用加样枪轻轻吹打，洗涤，然后1000 rpm，离心5 min；弃上清，1 × PBS溶液重新洗涤一次，然后1000 rpm，离心5 min；弃上清，加入RIPA裂解液（含有蛋白酶抑制剂PMSF），在冰上裂解细胞30 min（裂解过程中，经常弹一弹离心管，保证细胞完全裂解）。4 ℃，12000 rpm，离心5 min，收集细胞，将上清液转移至新的EP管中，加6 × loading buffer。沸水浴加热10 min，10000 g，离心10 min，取上清，-20 ℃保存1个月。用BCA法，测定每个实验组的细胞总蛋白含量。

（2） SDS-PAGE电泳

用SDS-PAGE电泳分离蛋白。首先，清洗电泳槽和玻璃板，分别灌分离胶和浓缩胶以及插梳子，上样。然后，80 V电泳，溴酚蓝指示剂跑至浓缩胶底端，分离胶的前缘；120 V电泳，溴酚蓝指示剂到达分离胶底部，停止电泳。最后，取胶，根据实验需求切胶，为电转移做准备。

（3）电转移

PVDF转膜。首先，准备夹心层（阴极塑料夹板-滤纸-凝胶-PVDF-滤纸-阳极塑料夹板），注意PVDF做好标记，例如：减去左上角。然后，装好电转移装置，电泳，4 ℃，100 V，2 h。最后，取出PVDF，准备封闭。

（4）抗体反应和显色反应

首先，在室温条件下，加入封闭液，封闭2 h，在这一过程中，要求蛋白面向上；或者，在4 ℃条件下，封闭过夜。然后，轻轻在1 × TBST中漂洗一下，加一抗，在室温条件下，孵育2 h；1 × TBST，漂洗三次，每次5-15 min；加二抗，孵育和漂洗情况与一抗相同。最后，在暗室中，取出膜，稍微沥干， ECL发光试剂盒进行发光，显影，以及最后的定影。用Image J进行蛋白质分析。

统计方法：所有结果用mean ± SEM表示。使用ANOVA方法进行数据分析，它属于Tukey 的一种多重比较法。当P < 0.05时，结果有显著性差异，

细胞增殖能力结果。

利用CCK-8检测淋巴细胞的细胞增殖能力，结果显示，帕金森患者淋巴细胞的细胞增殖率增加，脐血源神经干细胞和环孢素A以及VB12复合药减低散发性帕金森患者淋巴细胞的增殖能力比左旋多巴组明显，结果提示脐血源神经干细胞和环孢素A以及VB12复合药能够显著减低散发性帕金森患者淋巴细胞的增殖（图1）。

LDH是一种稳定的细胞质酶，当细胞膜被破坏时，LDH会迅速释放到培养基中，因此，我们可以用培养基中LDH的活性来表征细胞的坏死程度。帕金森患者淋巴细胞组与对照组相比，LDH的活性明显增加，这说明帕金森患者淋巴细胞处于损伤严重的状态。脐血源神经干细胞和环孢素A以及VB12复合药降低帕金森患者淋巴细胞所升高的LDH水平比左旋多巴组明显（图2）。实验结果说明脐血源神经干细胞和环孢素A以及VB12复合药能够明显降低帕金森患者淋巴细胞所升高的LDH水平。

用流式细胞仪检测细胞周期，以此验证脐血源神经干细胞和环孢素A以及VB12复合药阻滞帕金森患者淋巴细胞的细胞周期。帕金森患者淋巴细胞组，细胞的周期活动主要集中在G1期； 脐血源神经干细胞和环孢素A以及VB12复合药组和左旋多巴组，都使细胞的周期活动明显集中在S期，且脐血源神经干细胞和环孢素A以及VB12复合药恢复效果好（图3）。实验结果说明脐血源神经干细胞和环孢素A以及VB12复合药能够明显阻滞帕金森患者淋巴细胞的G1/S期。

用Western blot检测Cyclin D3蛋白含量，进一步确定脐血源神经干细胞和环孢素A以及VB12复合药阻滞帕金森患者淋巴细胞的细胞周期。Cyclin D3是参与G1/S期的标志性节点蛋白。帕金森患者淋巴细胞组，Cyclin D3的蛋白表达明显升高；脐血源神经干细胞和环孢素A以及VB12复合药降低Cyclin D3蛋白表达的能力高于左旋多巴组（图4）。Western blot与流式细胞仪的检测结果一致。实验结果说明脐血源神经干细胞和环孢素A以及VB12复合药能够明显阻滞帕金森患者淋巴细胞G1/S期的Cyclin D3蛋白表达。

一种阻断帕金森患者淋巴细胞周期的药物简称复合药物。

本发明的有益效果是：到目前为止，对于帕金森疾病的治疗只是对症治疗，不能根除病因，本发明是一种新型的临床上治疗帕金森疾病的新药物组合，能够明显降低帕金森患者淋巴细胞所升高的LDH水平。

附图说明

图1是脐血源神经干细胞和环孢素A以及VB12复合药对于散发性帕金森患者淋巴细胞的细胞增殖的影响。

数据代表± SEM。n=3。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

图2是脐血源神经干细胞和环孢素A以及VB12复合药对于散发性帕金森患者淋巴细胞的LDH的影响。

数据代表± SEM。n=3。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

图3是流式细胞仪分析脐血源神经干细胞和环孢素A以及VB12复合药对于散发性帕金森患者淋巴细胞的细胞周期的影响。

数据代表± SEM。n=3。

图4是Western blot分析脐血源神经干细胞和环孢素A以及VB12复合药对于散发性帕金森患者淋巴细胞的Cyclin D3蛋白表达的影响。

数据代表± SEM。n=3。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001 vs. 对照组；#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001 vs. 散发性帕金森患者淋巴细胞组。

具体实施方式

实施例1

1X10⁶细胞/ml脐血源神经干细胞和20ng/ml环孢素A以及2ng/ml 维生素B₁₂。

实施例2

1X10⁶细胞/ml脐血源神经干细胞和50ng/ml环孢素A以及4ng/ml 维生素B₁₂。

实施例3

1X10⁶细胞/ml脐血源神经干细胞和60ng/ml环孢素A以及10 ng/ml 维生素B₁₂。