专利名称：一种提高cik细胞增殖速率的中药提取物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药技术领域，具体的说是涉及能提高CIK细胞增殖速率的中药提取物的配方及其制备方法和应用。
背景技术：
肿瘤生物治疗是当今肿瘤研究领域的一大热点，肿瘤生物治疗包括细胞因子、基因治疗、单克隆抗体、肿瘤疫苗和过继性免疫治疗等方法，其中肿瘤细胞过继性免疫治疗在肿瘤生物治疗中占据着重要地位。细胞过继免疫治疗是目前研究较多并已进入临床试验的生物治疗方法。它是将体外激活的自体或异体免疫效应细胞输注给患者，杀灭患者体内的肿瘤细胞；适合细胞免疫功能低下的患者，如大剂量化疗、放疗后、骨髓移植后、病毒感染损 伤免疫细胞数量及功能的患者。肿瘤过继性免疫治疗中的一个关键问题是寻找合适的肿瘤杀伤细胞，自上世纪80年代以来，包括LAK、TIL、⑶3AK、CTL等细胞已先后应用于临床，但由于存在着扩增倍速较低、细胞来源困难、细胞毒力不高等诸多问题，该疗法在临床应用上受到一定限制。细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-Induced Killer cell) CIK的出现,为肿瘤过继性免疫治疗带来了新的希望。CIK细胞是由美国斯坦福大学的Schmidt Wolf等于1991年率先发现的，他们将人外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得了一群异质细胞，该细胞共同表达了 CD3和CD56两种膜蛋白分子，是目前所知杀伤活性最强的一种肿瘤生物治疗效应细胞，该细胞兼具T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤等优点，又称为NK样T淋巴细胞(NKT细胞)，被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。该疗法既可单独使用，也可以作为手术、化疗和放疗后的有力辅助手段，效果显著。结合手术切除、介入、射频、氩氦刀等治疗，可清除不能用手术切除的极微小瘤灶或是体内散存的瘤细胞，在延缓或阻止肿瘤的转移或复发方面有重要作用；对于部分暂时不适宜做手术、介入或其它治疗的肿瘤患者，也可以先进行CIK细胞治疗，提高身体机能状况，改善生活质量，争取其它治疗机会。由此可见，CIK细胞的体外大量增殖，即进一步提高其体外增殖速率，是大规模使用CIK细胞免疫治疗的关键所在。中医药制剂是我们中华民族对世界医学的一大贡献，大量的科学研究表明中医药不仅能发挥抗肿瘤治疗的靶点作用，而且还有调整免疫，改善造血功能，诱导肿瘤细胞凋亡、促进分化，抑制RNA、DNA合成，逆转多药耐药，影响细胞通讯等作用。中医药如扶正中药，尤其是补气助阳药，可激活机体免疫细胞活性，使之吞噬功能增强，同时提高机体免疫功能，加强化疗效果。本发明的目的是通过一些免疫增强功能的中医药制剂对CIK细胞的诱导和调节能力进行研究，利用CIK细胞免疫治疗在肿瘤治疗中的强大优势，充分发挥中医药辅助诱导细胞免疫治疗的长处，即促进免疫细胞的大量增殖，从而间接改善肿瘤患者的生活质量，延长生存期。
发明内容
利用传统中医药可以有机地结合CIK细胞免疫治疗在肿瘤治疗中的强大优势，针对一些免疫增强功能的中医药制剂对免疫细胞有诱导增殖作用，从而间接改善肿瘤患者的生活质量，延长生存期。本发明目的在于提供一种提高CIK细胞增殖速率的中药提取物及其制备方法。本发明提供了一种提高CIK细胞增殖速率的中药提取物，所述中药提取物由下列重量配比的原料药所制成红参5 15g、麦冬5 15g、黄芪15 30g。本发明还提供了一种制备该中药提取物的方法，包括以下步骤
1)将3味原料药加水煎煮，过滤收集提取液，把提取液浓缩得提取液I;
2)取提取液I精制
取上述提取液I用乙醇沉淀，过滤，回收乙醇，得精制提取液II ;
3)精制的提取液II纯化
将精制提取液II经大孔树脂柱富集，用蒸馏水洗脱至无色，用乙醇洗脱，收集洗脱液，经浓缩，经0. 45 u m微孔滤膜滤过，滤液浓缩至5g生药/ ml，活性炭煮沸吸附热源，除炭，调PH值，又经0. 22 y m微孔滤膜滤过除菌，分装，即得本发明的中药提取物。本发明所述的中药提取物在提高CIK细胞增殖速率中的应用。本发明的有益效果是(I)本发明所述的中药提取物(SMH)与其他化学诱导增殖因子相比，符合细胞培养要求，即对人体无毒副作用，故诱导增殖后的CIK细胞直接可以用于临床试验。(2)与相应的中药刺激因子相比，本发明所述的中药提取物(SMH)处方精练，剂型先进，该中药提取液功效提高，成分明确，质量可控。(3)本发明所述的中药提取物(SMH)具有明显提高CIK细胞增殖速率的作用，激活后的细胞杀伤疗效高于以前的无中药提取物(SMH)的CIK细胞治疗，会产生较好的社会效益和经济效益。
图I不同处理对CIK细胞增殖的影响。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行详细的说明。这些具体的实施例仅仅是在不违背本发明精神下的有限列举，并不排除本领域的一般技术人员把现有技术和本发明结合而产生的其他具体的实施方案。本发明是通过以下的技术方案来实现的
I、主要材料的准备。一种对CIK细胞增殖速率有明显提高作用的中药提取物(简称SMH)，其特征在于该提取物由下列重量配比的原料药所制成红参5 15g、麦冬5 15g、黄芪15 30g。2、所述中药提取物的方法，其特征在于其方法步骤如下
1)将3味原料药加水煎煮，过滤收集提取液，把提取液浓缩得提取液I;
2)取提取液I精制
取上述提取液I用乙醇沉淀，过滤，回收乙醇，得精制提取液II ；3)精制的提取液II纯化
将精制提取液II经大孔树脂柱富集，用蒸馏水洗脱至无色，用乙醇洗脱，收集洗脱液，经浓缩，经0. 45 u m微孔滤膜滤过，滤液浓缩至5g生药/ ml，活性炭煮沸吸附热源，除炭，调PH值，又经0. 22 y m微孔滤膜滤过除菌，分装，即得本发明的中药提取物。上述步骤I)中加水的水量为药材量的10-15倍，煎煮0. 5-1. 0小时，过滤收集提取液浓缩至0. 5g生药/ ml。上述步骤2)中用与提取液I等量的80%乙醇沉淀一次。上述步骤3)中用10 40%的乙醇洗脱,收集洗脱液浓缩至5g生药/ mlo上述的中药提取物在提高CIK细胞增殖速率的应用。实施例I 一种制备中药提取物(SMH)的配方及制备方法
取红参5g、麦冬5g、黄芪15g。加热纯化水煎煮提取，加水量为10倍；煎煮时间为0. 5小时。过滤收集提取液，把提取液浓缩得提取液I ;将上述提取液I用乙醇沉淀，过滤，回收乙醇至无醇味，得精制提取液II ;将精制提取液II经大孔树脂柱富集，用蒸馏水洗脱至无色，用乙醇洗脱，收集洗脱液，经浓缩，经0. 45 y m微孔滤膜滤过，滤液浓缩至5g生药/ ml，活性炭煮沸吸附热源，除炭，调PH值，又经0. 22 y m微孔滤膜滤过除菌，分装，制成SMH中药提取物。实施例2另一种制备中药提取物(SMH)的配方及制备方法
取红参15g、麦冬15g、黄芪30g。加热纯化水煎煮提取，加水量分别为15倍；煎煮时间分别为I小时。过滤收集提取液，把提取液浓缩得提取液；将上述提取液经大孔树脂柱富集，用蒸馏水洗脱至无色，用乙醇洗脱，收集洗脱液，经浓缩，经0. 45 y m微孔滤膜滤过，滤液浓缩至5g生药/ ml，活性炭煮沸吸附热源，除炭，调pH值，又经0. 22 u m微孔滤膜滤过除菌，分装，制成SMH中药提取物。实施例3加入中药提取物(SMH)的CIK细胞培养和常规的CIK细胞培养在诱导增殖及增殖后的细胞对肿瘤细胞的杀伤力的对比实验
(I)中药提取物(SMH)和各细胞因子共同刺激培养
含有抗凝剂的真空采血管采集静脉血30 mL，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)，洗涤2次，再用RPMI 1640完全培养液(内含灭活的10 %自体血浆、25 mmol/LHEPESU00 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素)重悬细胞，调整细胞浓度为2 X107ml。细胞均分为2组，I组按常规CIK细胞培养方法，即第0天加入IFN-Y (I 000 U/ml)，入CO2培养箱孵育24小时后再加入IL-2 (300 U/ml)、抗⑶3单抗(25 ng/ml)继续培养。另I组于第0天加入SMH (1%、3%、5%、7%、9%)，24小时后按常规CIK细胞培养方法继续培养。每3-4天根据细胞浓度添加新鲜RPMI 1640完全培养液，并补加rhIL-2至300 U/ml。至第14天收集细胞进行有关检测。(2)肿瘤细胞的分离获得
手术切除的新鲜肿瘤组织剪成细小块，超声波打碎，加入RPMI 1640，经60目钢筛过滤，肿瘤细胞通过钢筛，收集细胞，用0. 15M磷酸缓冲液(PH 7. 2)冲洗三次，检测活细胞数目。(3)细胞的增殖、杀伤和表型检测结果
采用台盼蓝拒染法计数细胞，检测细胞的增殖水平；MTT法检测CIK细胞的体外细胞毒活性。上述共同刺激培养激活的细胞于第2天开始数目增多，到14天最高扩增倍数达610±20倍(如图I所示)。第14天的扩增倍数检测结果显示，含5%中药提取物(SMH)的培养基中细胞绝对数比无中药提取物SMH (CIK cell group)高2. 8倍。分别对1%、3%、5%中药提取物(SMH)诱导增殖后的细胞进行肿瘤细胞的杀伤率的检测，结果发现这三个处理对肿瘤细胞的杀伤率均达到97%以上，对NK敏感的K562细胞杀伤率也达80%以上。这些结 果指标均略高于无中药提取物SMH(CK)，但无显著性差异(P〈0. 05)。在进行检测之前，每次均在培养过程中取少量CIK细胞做流式细胞仪检测。达到标准(⑶3+⑶56+细胞数> 50%,⑶3+⑶8+ ^ 30%)后，再收集细胞进行相关检测。
权利要求
1.一种提高CIK细胞增殖速率的中药提取物，其特征在于该提取物由下列重量配比的原料药所制成红参5 15g、麦冬5 15g、黄芪15 30g。
2.一种制备权利要求I所述中药提取物的方法，其特征在于其方法步骤如下 1)将3味原料药加水煎煮，过滤收集提取液，把提取液浓缩得提取液I; 2)取提取液I精制 取上述提取液I用乙醇沉淀，过滤，回收乙醇，得精制提取液II ； 3)精制的提取液II纯化 将精制提取液II经大孔树脂柱富集，用蒸馏水洗脱至无色，用乙醇洗脱，收集洗脱液，经浓缩，经0. 45 u m微孔滤膜滤过，滤液浓缩至5g生药/ ml，活性炭煮沸吸附热源，除炭，调PH值，又经0. 22 y m微孔滤膜滤过除菌，分装，即得本发明的中药提取物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤I)中加水的水量为药材量的10-15倍，煎煮0. 5-1. 0小时，过滤收集提取液浓缩至0. 5g生药/ ml。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤2)中用与提取液I等量的80%乙醇沉淀一次。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤3)中用10 40%的乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩至5g生药/ ml。
6.根据权利要求I所述的中药提取物在提高CIK细胞增殖速率的应用。
全文摘要
本发明涉及一种对CIK细胞增殖速率有明显提高作用的中药提取物，它是由原料药红参、麦冬、黄芪按一定重量配比制成。所述配方制备包括以下步骤红参、麦冬、黄芪加水煎煮，乙醇沉淀一次，过滤，回收乙醇，经大孔树脂柱富集，用蒸馏水洗脱至无色，用乙醇洗脱，收集洗脱液，经微孔滤膜滤过，滤液浓缩，调pH值，又经微孔滤膜滤过除菌，分装，即得中药提取物。经药效学试验结果表明该中药提取物对CIK细胞的增殖速率有显著的提高作用。
文档编号A61P35/00GK102755512SQ20111010815
公开日2012年10月31日 申请日期2011年4月28日 优先权日2011年4月28日
发明者徐军, 陈春 申请人:徐军, 陈春