一种夹氧杂蒽酮类化合物CCE9的用途的制作方法

本发明属于中药提取物的应用领域，具体涉及一种夹氧杂蒽酮类化合物cce9的用途。

背景技术：

p38丝裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activatedproteinkinases(p38mapk))可以由细胞外的多种应急包括uv，放射线，热休克，促炎症分子，特定抗原及其它应激反应激活，并在凋亡，细胞因子产生，转录调节及癫痫发作中其重要的作用。

近期研究表明p38mapk在细胞凋亡中起重要作用。如p38mapk通路的激活可导致神经细胞凋亡。在肿瘤细胞中，p38mapk活性升高，并参与调控凋亡。最近的研究表明p38mapk可以通过诱导bcl-2磷酸化，诱导细胞凋亡。

bcl-2是细胞凋亡过程最重要的调控因子之一。最近，越来越多的证据表明，bcl-2的结构无序链区域的磷酸化调控着bcl-2的生存功能，bcl-2磷酸化失活其生存功能。在环境因子、炎症细胞因子、脂多糖(lps)和其它因子的作用下，p38mapk可以介导bcl-2结构无序链上ser87和thr56的磷酸化，从而介导ngf撤除、肿瘤坏死因子和no所诱导的细胞凋亡过程。在上述情况下，无论是细胞中或无细胞实验中，p38mapk介导的bcl-2高度磷酸化均表现为促凋亡事件，诱导细胞色素c从线粒体的释放过程。

bcl-2结构无序链区域的磷酸化可能通过影响其与bcl-2家族促凋亡蛋白如bax的相互作用抑制其抗凋亡功能。在记忆性b淋巴细胞中，ngf撤除诱导依赖p38mapk的磷酸化，抑制其抗凋亡功能，诱导细胞色素c的释放。同样，在成年大鼠心脏细胞中h2o2介导依赖p38mapk的bcl-2磷酸化，诱导细胞凋亡。已有证据表明，bcl-2结构无序链上的ser87和thr56是p38mapk磷酸化bcl-2的位点，并且这此残基的磷酸化降低bcl-2的抗凋亡作用。

cce9是一种从中药牛黄木中提取的夹氧杂蒽酮类化合物。黄牛木(cratoxyloncochinchinensisbl)别称黄牛茶、黄芽木、狗芽木、雀笼木、水杧果、鹧鸪木、节节花、满天红(广西)、茶咯桌、梅低优、美启烈、山狗芽等是藤黄科(guttiferae)黄牛木属(cratoxylum)植物。功用清热解暑、化湿消滞、消肿止血，主治感冒发热、肠炎腹泻、咳嗽声嘶、黄疸病等；黄牛木的主要化学成分为夹氧杂蒽酮类，此外还含有蒽醌苯甲酮类、三萜类和黄酮类成分；现代药理研究表明黄牛木具有抗氧化、细胞毒性和神经生长因子增效作用。

虽然已有文献报道黄牛木具有抗癌活性，并分离得到了一些活性成分，但研究大多只限于较为基础的mtt实验阶段如laphookhieo等对c.cochinchinense根中分离到的7个吡酮类化合物进行体外细胞毒活性测试，结果与喜树碱的抗癌活性比较表明化合物cochinchinonea对乳腺癌，宫颈癌，肠癌和kb细胞系具有较强的生长抑制活性；boonnaknawong等发现化合物gerontoxanthonei对乳腺癌，宫颈癌，肠癌和kb细胞系具有较强的细胞毒活性等，但是这些简单的活性研究无法明确活性成分的抗肿瘤作用靶点、作用机理，这是制约其进一步开发成为抗癌药物的最主要原因。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于，提供一种夹氧杂蒽酮类化合物cce9在制备治疗癌症药物中的用途。

本发明的第二个目的在于，提供一种以bcl-2作为作用靶点筛选夹氧杂蒽酮类化合物的应用。

为了实现本发明目的，本发明提供了一种夹氧杂蒽酮类化合物cce9用于制备治疗癌症药物的用途。

进一步，所述夹氧杂蒽酮类化合物cce9以bcl-2为作用靶点。

进一步，所述夹氧杂蒽酮类化合物cce9具有用于诱导肿瘤细胞凋亡的用途。

进一步，所述夹氧杂蒽酮类化合物cce9具有通过激活p38mapk诱导肿瘤细胞凋亡的用途。

进一步，所述夹氧杂蒽酮类化合物cce9具有通过诱导bcl-2的磷酸化诱导肿瘤细胞凋亡的用途。

进一步，所述夹氧杂蒽酮类化合物cce9具有通过诱导bcl-2的构象变化诱导肿瘤细胞凋亡的用途。

进一步，所述夹氧杂蒽酮类化合物cce9具有通过bax的激活诱导肿瘤细胞凋亡的用途。

进一步，所述癌症为子宫颈癌、肺癌和肝癌。

所述夹氧杂蒽酮类化合物cce9(1,3,7-trihydroxy-2,4-diprenylxanthone)为中药黄牛木提取物，其结构如下：

根据本发明，以bcl-2的磷酸化为靶点，可以用于筛选夹氧杂蒽酮类化合物，以进一步开发用于治疗各种癌症。

本发明提供的作用于bcl-2诱导肿瘤细胞凋亡可以用于指导筛选夹氧杂蒽酮类化合物，从中获得具有抗肿瘤活性的化合物，并可将获得的药物进而制备可用于bcl-2诱导肿瘤细胞凋亡的活性与功能的药物。

附图说明

图1a为荧光染色检测cce9诱导肿瘤细胞的凋亡图；

图1b为cce9诱导肿瘤细胞凋亡的百分比结果图；

图1c为cce9诱导肿瘤细胞中的parp蛋白切割图；

图2为流式细胞仪分析annexin-v/pi双染检测cce9诱导hela229子宫颈癌细胞的凋亡结果图；

图3为cce9对hela229细胞中p38mapk的激活作用图；

图4a为p38mapk抑制剂抑制cce9诱导的肿瘤细胞凋亡图；

图4b为敲低p38表达抑制cce9诱导的肿瘤细胞凋亡图；

图5为流式细胞仪分析annexin-v/pi双染检测敲除细胞中的bcl-2抑制cce9诱导的肿瘤细胞凋亡图；

图6为cce9对hela229细胞中bcl-2的磷酸化作用以及p38mapk抑制剂对bcl-2的磷酸化的抑制作用图；

图7为cce9诱导hela229细胞中bcl-2的构象变化图；

图8为cce9诱导hela229细胞中bax的激活图；

图9a为p38mapk抑制剂抑制bcl-2的构象变化图；

图9b为敲低p38表达抑制cce9诱导的bcl-2的构象变化图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆：实验室手册》(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明中使用的试剂：

所采用的夹氧杂蒽酮类化合物cce9其结构如下：

实施例1-4、6-9中所述10μmcce9溶液由cce9溶解于99.9％dmso溶液(dmso终浓度<0.1％)，配制10mmcce9溶液，用1μlcce9溶液加入1mlmem培养基中配制得到。

实施例5中所述10μmcce9溶液由cce9溶解于99.9％dmso溶液(dmso终浓度<0.1％)，配制10mmcce9溶液，用1μlcce9溶液加入1mldmem培养基中配制得到。

实施例1cce9诱导肿瘤细胞凋亡

1、细胞培养

选择子宫颈癌细胞株hela229(atcc)，采用10％小牛血清的mem培养基，在恒温37℃、5％co2培养箱中取出培养于24孔组织培养板中，24小时后换液和进行加药(不含血清)处理。cce9溶解于99.9％dmso溶液(dmso终浓度<0.1％)，配制10mmcce9溶液，用1μlcce9溶液加入1mlmem培养基中，cce9终浓度为10μm,处理细胞3小时和6小时，对照组用同样浓度dmso溶液处理6小时。

2、dapi染色细胞核

反应板中各孔溶液的总体积均为1ml。细胞经处理后，pbs洗3次，4％多聚甲醛固定，1％triton穿膜，最后加入50μg/mldapi加入100μg/mldnase-freernasea37℃染细胞核20分钟。甘油封片，荧光显微镜下观察细胞核形态，结果如图1a所示。至少300个细胞，多于5个随机视然野，由两个不同的观察者记数，计算凋亡的百分比，结果如图1b所示。

由图1a可见，用10μm的cce9溶液作用hela229细胞3小时和6小时，作用3小时的hela229细胞明显发生凋亡，作用6小时的hela229细胞数量比作用3小时的hela229细胞更少，且细胞质更皱，凋亡细胞根据形态上典型的细胞质皱缩，膜起泡以及核凝缩、破碎加以识别。

由图1b统计结果显示，在对照组hela229细胞极少发生凋亡的情况下(4.7％)，作用cce9溶液3小时后凋亡率达到17％，且随着作用时间的延长，6小时后凋亡hela229细胞达到34.3％，hela229细胞凋亡显著增加。

3、cce9诱导hela229细胞、a549细胞和hepg2细胞的papr切割

聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶(poly(adp-ribose)polymerase，parp)的切割是早期凋亡的标记。parp的切割可以通过其抗体加以识别。选择子宫颈癌细胞株hela229(atcc)，用10％小牛血清的mem培养基，肺癌细胞株a549(atcc)和肝癌细胞株hepg2(atcc)，用10％小牛血清的dmem培养基，恒温37℃、5％co2培养箱中取出培养于12孔组织培养板中，24小时后换液和进行加药(不含血清)处理。cce9溶解于99.9％dmso溶液(dmso终浓度<0.1％)，配制10mmcce9溶液，用1μlcce9溶液加入1mlmem培养基中，cce9终浓度为10μm,处理0.25、0.5、1、3小时和6小时，对照组用同样浓度dmso处理6小时。细胞以ripa细胞裂解液(50mmtris-hclph7.4，1％np-40，0.25％na-deoxycholate，150mmnacl)裂解30分钟，以相同上样量，8％sds-page电泳，转膜，以5％脱脂奶粉的tbst(50mmtris-hcl(ph7.4)，150mmnacland0.1％tween-20)室温封闭1小时，4℃过夜孵育一抗anti-parp(1:1000稀释)，室温孵育二抗1小时，ecl显色，曝光。结果如图1c所示。

如图1c所示，10μmcce9溶液作用3小时，就可引起子宫颈癌细胞株hela229中parp的切割；a549肺癌细胞在10μmcce9溶液作用6小时，发生parp切割；hepg2肝癌细胞在10μmcce9溶液作用1小时中可观察到了同样的parp切割作用。

由图1a、图1b、图1c可得，cce9可诱发子宫颈癌细胞、肝癌细胞和肺癌细胞明显发生凋亡。

实施例2annexin-v/pi双染检测cce9诱导hela229子宫颈癌细胞的凋亡

在无血清mem(购买自hyclone)培养基中，用10μmcce9溶液作用hela229细胞6小时，以不加cce9溶液的细胞为对照。细胞根据vybrantapoptosisassaykit#2操作手册染色pi和annexin-v，用流式细胞仪(beckmancoultercytoflex)分析。用beckmancoultercytexpert软件分析，结果如图2所示。

由图2可以看出，对照组中只有1.87％的hela229细胞早期凋亡，而用10μmcce9溶液处理的实验组有19.85％的hela229细胞早期凋亡。因此可得，cce9可诱发hela229细胞明显发生凋亡。

实施例3cce9对hela229细胞中p38mapk的激活作用

1、细胞培养

选择子宫颈癌细胞株hela229(atcc)，用10％小牛血清的mem培养基，恒温37℃、5％co2培养箱中取出培养于12孔组织培养板中，24小时后换液和进行加药(不含血清)处理。cce9溶解于99.9％dmso溶液(dmso终浓度<0.1％)，配制10mmcce9溶液，用1μlcce9溶液加入1mlmem培养基中，使得cce9终浓度为10μm,以10μmcce9溶液处理0.25、0.5、1、3小时和6小时，对照组用同样浓度dmso处理6小时。

2、westernblotting分析p38mapk的激活

细胞以ripa细胞裂解液(50mmtris-hclph7.4，1％np-40，0.25％na-deoxycholate，150mmnacl)裂解30分钟，以相同上样量，10％sds-page电泳，转膜，以5％脱脂奶粉的tbst(50mmtris-hcl(ph7.4)，150mmnacland0.1％tween-20)室温封闭1小时，4℃过夜孵育一抗anti-p-p38(1:1000稀释)，室温孵育二抗1小时，ecl显色，曝光。结果如图3所示。

如图3所示，从左往右的泳道依次代表cce9溶液处理hela229细胞的时间分别为0h，0.25h，0.5h，1h，3h，6h。由0.25h对应的泳道开始出现条带，且随着时间的增加条带颜色越来越深，说明10μmcce9溶液作用25分钟，就可引起子宫颈癌细胞株hela229中p38的激活，且随作用时间的增加，激活程度逐渐增强。因此，cce9能够快速而且有效的激活p38mapk，且这种激活都呈时间依赖型的规律。

实施例4cce9对hela229细胞的凋亡作用依赖于p38mapk的激活

1、p38mapk抑制剂sb203580抑制cce9诱导的肿瘤细胞凋亡

在无血清mem(购买自hyclone)培养基中，在p38mapk抑制剂sb203580、sp600125存在、缺少的情况下，用10μmcce9溶液作用hela229细胞3小时，以不加cce9溶液的细胞为对照。westernblotting分析parp的切割，方法同实施例1中3的实验方法，结果如图4a所示。

如图4a所示：不进行任何处理的对照组、只加sb203580实验组、同时加入sb203580和cce9溶液处理的实验组p-p38对应的泳道未出现条带，只加入sp600125的实验组中p-p38对应的泳道出现一小段条带，只加入cce9溶液和同时加入cce9溶液与sp600125的实验组中p-p38对应的泳道出现长且粗的条带。由此可得。只加入cce9溶液和同时加入cce9溶液与sp600125的实验组中很多parp切割；而只加入sb203580和同时加入cce9溶液与sb203580的实验组parp切割的量很少；只加入sp600125的实验组中parp切割的量比只加入sb203580多。由图4a可得，sb203580可以很大程度的抑制cce9诱导的parp切割，而sp600125(jnk抑制剂)只具有微弱的影响。

2、敲低p38表达抑制cce9诱导的肿瘤细胞凋亡

在hela229细胞中转入p38mapk的特异sirna(5’-cugagaaacauauugugaudtdt-3’；5’-cuuguaagaucacucuuaadtdt-3’；5’-gaagcaaugggaauuuacadtdt-3’，购自sigma)48小时，用10μmcce9溶液作用hela229细胞3小时，以不加cce9溶液的细胞为对照。westernblotting分析parp的切割，方法同实施例1中3的实验方法，结果如图4b所示。

如图4b所示，在hela229细胞中转入p38mapk的特异sirna的实验组中p38mapk的不表达，无parp切割。因此可得降低细胞中p38mapk的表达能够显著的抑制cce9诱导的肿瘤细胞中的parp切割。

以上结果均说明p38mapk在cce9诱导的肿瘤细胞凋亡中发挥重要的作用。

实施例5流式细胞仪分析annexin-v/pi双染检测敲除细胞中的bcl-2抑制cce9诱导的肿瘤细胞凋亡

在无血清dmem(购买自hyclone)培养基中，用10μmcce9溶液分别作用mef细胞和mefbcl-2敲除细胞(bcl-2-/-mef)6小时，以不加cce9溶液的细胞为对照。细胞根据vybrantapoptosisassaykit#2操作手册染色pi和annexin-v，用流式细胞仪(beckmancoultercytoflex)分析。用beckmancoultercytexpert软件分析，结果如图5所示，mef细胞的对照组2.8％细胞早期凋亡，mef细胞加cce9溶液处理的实验组16.51％的细胞早期凋亡；mefbcl-2敲除细胞的对照组3.62％细胞早期凋亡，mefbcl-2敲除细胞加cce9溶液处理的实验组3.73％的细胞早期凋亡。

因此由图5可得，在mefbcl-2敲除细胞(bcl-2-/-mef)中，cce9并不能诱导细胞发生凋亡。

实施例6cce9对hela229细胞中bcl-2的磷酸化作用以及p38mapk抑制剂对bcl-2的磷酸化的抑制作用

在无血清mem(购买自hyclone)培养基中，在p38mapk抑制剂sb203580存在、缺少的情况下，用10μmcce9溶液作用hela229细胞3小时，以不加cce9溶液的细胞为对照。细胞以ripa细胞裂解液(50mmtris-hclph7.4，1％np-40，0.25％na-deoxycholate，150mmnacl)裂解30分钟，加入bcl-2的抗体(购买自santacruz)10μl，于4℃摇床孵育2小时，然后加入30μlproteina/gagarose，4℃摇床孵育1-2小时；然后4℃2000转离心2分钟，小心的洗去上清，再用冰凉的细胞裂解液1ml在4℃摇床上洗涤至少3次，每次5分钟，最后在4℃2000转离心2分钟，收集珠子。向离心管中加入适量的2×sdsloadingbuffer于100℃中变性10分钟。以相同上样量，12％sds-page电泳，转膜，以5％脱脂奶粉的tbst(50mmtris-hcl(ph7.4)，150mmnacland0.1％tween-20)室温封闭1小时，4℃过夜孵育一抗anti-p-thr(1:1000稀释)或anti-p-ser(1:1000稀释)，室温孵育二抗1小时，ecl显色，曝光。结果如图6所示。

如图6所示，cce9可以诱导bcl-2依赖于丝氨酸和苏氨酸的磷酸化，而p38mapk的抑制剂sb203580可以抑制cce9诱导的bcl-2磷酸化。从而，cce9能够诱导依赖于p38mapk的bcl-2磷酸化。

实施例7cce9诱导hela229细胞中bcl-2的构象变化

在无血清mem培养基中，用10μmcce9溶液作用hela229细胞2小时，以不加cce9溶液的细胞为对照。细胞用4％甲醛(pbs中)室温固定10分钟，0.1％tritonx-100+0.1mgycine冰上穿膜30分钟，5mg/mlbsa室温封闭1小时，一抗anti-bcl-2(bh3),(用5mg/mlbsa稀释1：50-100)(购自abcom)一个特异识别bcl-2的bh3结构域的抗体，只有bcl-2的构像发生改变后才能够被bcl-2(bh3)抗体所识别，在湿盒中室温孵育1-3小时，二抗(5mg/mlbsa稀释1：50-100)湿盒中室温黑暗中孵育1-3小时，dapi(1μg/mlinpbs)室温孵育1－5分钟，封片，在lsm-510共聚焦显微镜(carlzeiss,oberkochen,germany)观察，并拍照。结果如图7所示。

如图7所示，虽然hela229细胞中有高表达的bcl-2蛋白，但对照组细胞中的bcl-2无法被bcl-2(bh3)抗体染色，说明hela229胞中bcl-2的bh3结构域隐藏在蛋白分子的内部。细胞经cce9处理后，呈显bcl-2(bh3)抗体染色阳性。说明cce9可以诱导bcl-2构象改变。

实施例8cce9诱导hela229细胞中bax的激活

在无血清mem培养基中，用10μmcce9溶液作用hela229细胞2小时，以不加cce9溶液的hela229细胞为对照。如实施例7所述方法，用anti-bax(6a7),一个特异识别激活bax的抗体，染色。在lsm-510共聚焦显微镜(carlzeiss,oberkochen,germany)观察，并拍照。结果如图8所示。

如图8所示，虽然hela229细胞中有高表达的bax蛋白，但对照组hela229细胞中的bax无法被bax(6a7)抗体染色，cce9处理引起hela229细胞中bax(6a7)的强染色，说明cce9可以激活bax。

实施例9cce9诱导的bcl-2的构象变化依赖于p38mapk的激活

1、p38mapk抑制剂抑制bcl-2的构象变化

在无血清mem(购买自hyclone)培养基中，在p38mapk抑制剂sb203580存在、缺少的情况下，用10μmcce9溶液作用hela229细胞2小时，以不加cce9溶液的细胞为对照。实验方法同实施例7，免疫荧光染色法检测bcl-2的构象改变情况，结果如图9a所示。

如图9a所示：虽然hela229细胞中有高表达的bcl-2蛋白，但对照组hela229细胞中的bcl-2无法被bcl-2(bh3)抗体染色，hela229细胞经cce9处理后，呈显bcl-2(bh3)抗体染色阳性，而同时经cce9和sb203580处理的hela229细胞呈显bcl-2(bh3)抗体染色阴性，由此可得sb203580可以很大程度的抑制cce9诱导的bcl-2的构象变化。

2、敲低p38表达抑制cce9诱导的bcl-2的构象变化

在hela229细胞中转入p38mapk的特异sirna48小时，用10μmcce9溶液作用hela229细胞3小时，以不加cce9溶液的细胞为对照。用实施例7所述方法，免疫荧光染色法检测bcl-2的构象改变情况，结果如图9b所示。

如图9b所示：虽然hela229细胞中有高表达的bcl-2蛋白，但对照组hela229细胞中的bcl-2无法被bcl-2(bh3)抗体染色，hela229细胞经cce9处理后，呈显bcl-2(bh3)抗体染色阳性，而同时经cce9处理和转入p38mapk的特异sirna的细胞呈显bcl-2(bh3)抗体染色阴性。由此可得，降低hela229细胞中p38mapk的表达能够显著的抑制cce9诱导的bcl-2的构象变化。

以上结果均说明p38mapk在cce9诱导的bcl-2的构象变化中发挥重要的作用。

综上所述，本发明的夹氧杂蒽酮类化合物cce9通过激活p38mapk，使得bcl-2发生磷酸化，导致bcl-2构象改变，激活bax，从而诱导肿瘤细胞的凋亡。因此，夹氧杂蒽酮类化合物cce9可以用于制备治疗癌症的以bcl-2为作用靶点的药物。另外，bcl-2磷酸化可以作为作用靶点用于筛选夹氧杂蒽酮类化合物。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。