本发明涉及植物化学及医药领域，具体涉及中药苦参的多种有效单体成分在制备心肌保护药物中的应用。
背景技术：
心肌缺血是指心脏的血液灌注减少，导致心脏的供氧减少，心肌能量代谢不正常，不能支持心脏正常工作的一种病理状态。持续性的心肌缺血可导致心肌坏死、心律失常、心力衰竭，是造成患者死亡的直接原因之一。缺血性心脏病具有发病急、进展快、危害大的特点，因此，寻找防治缺血性心脏病的措施及药物是心血管领域的研究热点。
目前保护心脏，减少心肌缺血损伤最有力的方法是缺血预适应，但因伦理道德及使用不便等原因限制其临床运用。随着对缺血预适应本质、特点和作用机理的不断认识和研究，人们期望用药物代替缺血刺激，促使机体释放生物活性物质或直接激活机体保护机制而产生心脏对缺血、缺氧的耐受。随着人们回归自然热潮的兴起，从天然植物和中药中挖掘和开发低毒高效，治疗和保护缺血心肌的药物已成为研究热点。
苦参为豆科槐属植物苦参Sophora flavescens Ait.的干燥根，具有清热燥湿、杀虫、利尿等功效。苦参属于清热药中的清热燥湿药，用于热痢，便血，黄疸尿闭，赤白带下，阴肿阴痒，湿疹，湿疮，皮肤瘙痒，疥癣麻风；其主要药理作用有抗心肌纤维化，抗心律失常，抗肿瘤，抗炎，抗病原微生物，抗肝损伤以及对免疫系统和神经系统的调节作用等，已广泛应用于心血管病的防治。
苦参化学成分主要为生物碱和黄酮类化合物。近年研究证明苦参黄酮类成分具有广泛的药理作用，包括抑菌、抗心律失常、抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗炎、抗疟、降糖、神经保护等(中成药，2016，38(5)：1119-1123；吉林医药学院学报，2013，34(3)：222-224)；此外还发现苦参总黄酮具有抗心肌纤维化的作用(中草药，2015，46(20)：3055-3059；中药药理与临床，2013，29(4)：76-78)，是苦参治疗心脏相关疾病的主要物质基础之一。
尽管苦参总黄酮具有心肌保护活性，但苦参酮、降苦参酮、苦参醇A 3种化合物的心肌保护活性至今未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供苦参有效成分在制备心肌保护药物中的应用。
本发明的技术方案是，提供一种一类二氢黄酮化合物在制备心肌保护药物中的应用，其化学结构如下，
其中，R1表示R2表示取代基为任意位置的-OCH3或-OH中的一个或两个；R3表示取代基为任意位置的一个或两个-OH。
进一步的，提供一种一类二氢黄酮化合物在制备心肌保护药物中的应用，其化学结构如下，
其中，R1表示R2表示-OCH3或-OH；R3表示取代基为-H或-OH。
进一步的，本发明所研究的3种化合物涉及苦参中分离、制备得到的3种二氢黄酮成分，它们的化学结构如下，可从天然药物中分离制备得到，也可通过化学合成制备得到。
(化合物1)苦参酮：
(化合物2)降苦参酮：
(化合物3)苦参醇A：
本发明通过考察化合物对缺氧/复氧致损伤的乳鼠原代心肌细胞存活率的影响，以及对缺血再灌注大鼠心肌梗死面积的影响，首次发现苦参酮、降苦参酮、苦参醇A具有心肌保护作用。
本发明通过考察化合物对缺血再灌注大鼠心肌梗死面积的影响，首次发现苦参酮、降苦参酮、苦参醇A 3个化合物的组合具有心肌保护作用。
本发明通过药理实验发现苦参中3个单体成分及其组合的心肌保护药理活性，能用于制备具有相应作用的药物，有利于进行新型心肌保护药物的研发。
具体实施方式
为了更好地解释本发明可用于制备镇痛抗炎药物的实质内容，以下通过具体实验实施例来作进一步的阐释。以下实施例均为说明性的，并不对本发明做任何限定。
实施例1：受试单体化合物对缺氧/复氧致损伤的乳鼠原代心肌细胞存活率的影响
1材料、试剂及仪器
1.1动物
SD乳鼠(<24h)，SPF级，北京维通利华实验动物技术有限公司，质量合格证编号：11400700074853。
1.2主要材料与试剂
受试化合物对照品(苦参酮、降苦参酮、苦参醇A、葛根素)购自成都普菲德生物技术有限公司；DMEM/F12培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；WST-8试剂盒(北京钮因华信科技发展有限公司)；0.06％胰蛋白酶(美国Gibco公司)；0.06％Ⅰ型胶原酶(美国Sigma公司)；5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu，美国Invitrogen公司)；双抗(青霉素/链霉素，北京钮因华信科技发展有限公司)。
1.3主要仪器
5％CO2培养箱(日本三洋公司)；三气细胞培养箱(日本三洋公司)；酶标仪(M5，美国Molecular Devices公司)；96孔细胞培养板(美国Costar公司)。
2.方法
2.1受试样品溶液配制
取各受试化合物对照品适量溶于DMSO，取DMSO溶解的受试样品用生理盐水稀释到所需要浓度。
2.2乳鼠心肌细胞原代培养
乳鼠酒精消毒，开胸剪下心室。置于预冷PBS液中洗净余血。将心肌剪碎成1mm3，置于酶中消化(胶原酶与胰酶1:1，终浓度为0.06％)，放入转子机械搅拌加速消化。
第一次消化约5min，弃去消化液。从第二次消化开始收集消化液，每次5min，取上清至完全培养基中终止消化，共收集7次。800rpm离心3min收集细胞。20％胎牛血清D/F12培养基(终浓度100μM Brdu，100UI双抗)重悬细胞，过200目筛网至培养皿中，进行差速贴壁生长(成纤维细胞先贴壁，心肌细胞贴壁较慢)。
培养1.5h后收集细胞悬液(未贴壁细胞)，细胞计数并调整细胞浓度为5×104/mL，接种0.2mL/孔于96孔培养板，置5％CO2培养箱中培养。48h后倒置显微镜下可见孔内心肌细胞有规律的集体跳动即培养成功。每2-3天更换新鲜的20％胎牛血清D/F12培养基(终浓度100μM Brdu，100UI双抗)，细胞可在14天内保持活力用于实验。
2.3建模及给药
更换N2饱和的PBS缓冲液，放入三气细胞培养箱，缺氧2h，更换完全培养基，同时加入样品，5％CO2培养箱复氧1h。同时设定正常组(细胞+生理盐水，5％CO2正常培养3h)，模型组(细胞+生理盐水，方法同建模)和空白组(无细胞+生理盐水)。
2.4细胞存活率测定(CCK-8法)
更换100μL/孔无血清培养基，加10μl/孔CCK-8原液，5％CO2培养箱中共孵育2h，450nm处测定吸光度。
2.5计算与统计
细胞存活率(活细胞相对数量％)＝A(加药)-A(空白)/A(0加药)-A(空白)×100；
SPSS17.0软件计算并统计，ANOVA单因素方差分析显著性差异(P<0.05)。
3实验结果
化合物对缺氧/复氧致损伤的乳鼠心肌细胞存活率的影响如表1。葛根素(阳性对照)可发挥心肌细胞保护作用，本研究发现其可显著提高缺氧/复氧致损伤的心肌细胞存活率，说明细胞病理模型可靠；同葛根素一样，苦参酮、降苦参酮及苦参醇A 3种化合物均可显著提高缺氧/复氧致损伤的心肌细胞存活率，表明该3种化合物均有心肌保护活性。
表1受试化合物对缺氧/复氧致损伤的乳鼠心肌细胞存活率的影响(n＝3，)
与模型组比较，*P<0.05。
实施例2：受试单体化合物对缺血再灌注大鼠心肌梗死面积的影响
1材料、试剂及仪器
1.1动物
健康雄性Wistar大鼠48只，体重200±20g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。实验前，所用动物均进行一周的适应性饲养。在适应性饲养期间，动物自由取食，自由饮水。饲养室内保持安静，室内温度维持在23–25℃，湿度55％～75％，日光灯照明，每天24h中保持12h照明12h黑暗。
1.2主要材料与试剂
受试化合物对照品(苦参酮、降苦参酮、苦参醇A)购自成都普菲德生物技术有限公司；地奥心血康软胶囊购自成都地奥制药集团有限公司；伊文思蓝(Evans blue)和氯化三苯基四氮唑(TTC)购自Sigma公司。
1.3主要仪器
HX–200动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司)，BL–420F生物机能实验系统、YPJO1型压力换能器(成都医疗仪器厂)，image–pro plus 7.0图像分析软件(太原塞恩思科技发展有限公司)。
2.方法
2.1分组与给药方法Wistar大鼠，随机分成6组，每组6只，即假手术组(生理盐水)、缺血再灌注损伤组(生理盐水)、地奥心血康组(70mL/kg)、苦参酮组(50mg/kg)、降苦参酮组(50mg/kg)、苦参醇A组(50mg/kg)；各组大鼠均以10mL/kg的剂量灌胃给药，连续7d，每天1次，于末次给药1h后开始造模。
2.2建立缺血再灌注损伤模型各组大鼠以20％乌拉坦腹腔注射麻醉，仰卧位固定。用针形电极刺入四肢皮下，以标准Ⅱ导联监测心电图。颈部备皮，作纵向正中切口，分离气管、右侧颈总动脉，行气管插管、右颈总动脉插管，接人工呼吸机通气，频率为60次/min，呼吸比率为2︰1，潮气量8mL/kg(随大鼠体重调节)。于胸骨左侧第三、四肋间打开胸腔暴露心脏，在肺动脉圆锥左缘与左心耳右缘之间，用6/0无损伤缝合线平左心耳下缘2mm处进针，进针深度1～2mm，宽度2～3mm，然后将缝合线穿于自制的冠脉阻断塑料管。除假手术组不结扎外，其他组均结扎冠状动脉左前降支30min后，松开结扎线再灌注60min。实验中以心电图ST段明显抬高并与T波融合、心肌颜色变浅红色为结扎成功的标志；放松结扎线后ST段降低1/2以上及心肌逐渐红润为再灌注成功的标志。
2.3心肌梗死面积测定将冠状动脉左前降支原位重新结扎，于颈总动脉注入2％的伊文思蓝1.5mL，待大鼠巩膜蓝染后迅速取下心脏，置于4℃生理盐水中洗净心腔残余染液，剪去心底组织、心耳及右心室，锡箔纸包裹，置于–80℃保存。
将各实验组大鼠心脏自心尖向心底平行于房室沟方向切成6片(1～1.5mm厚)。在1％TTC(37℃，pH7.4)中避光孵育15min后，用10％甲醛溶液固定48h。染成蓝色的区域代表非缺血区，红色区域代表危险区(AAR)，白色区域为梗死区(An)。拍照后利用图像分析软件image–pro plus 7.0分析、计算心肌梗死面积。
危险区面积百分比(AAR/LV，％)＝(危险区总面积/左心室区面积)100％
心肌梗死面积百分比(An/AAR，％)＝(梗死区面积/危险区总面积)100％
2.4统计学处理各组数据采用均数±标准差表示，采用SPSS 11.0统计软件分析处理数据，采用单因素方差分析进行组间比较，P<0.05认为有统计学差异。
3实验结果
结果见表2，AAR/LV代表各组间冠脉结扎所致的缺血损伤程度；An/AAR表示心肌梗死面积大小。各组间AAR差异无显著性，表明各组动物的缺血程度大体相当，具有可比性。地奥心血康(阳性对照)可保护缺血再灌注损伤心肌，本研究发现其可显著减小大鼠心肌梗死面积(与模型组比较，An/AAR显著降低)，说明动物模型可靠；同地奥心血康一样，苦参酮、降苦参酮及苦参醇A 3种化合物均可显著减小缺血再灌注所致心肌梗死面积，说明3种化合物具有心肌保护作用。
表2受试单体化合物对心肌缺血再灌注大鼠梗死范围的影响(n＝6)
与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。
实施例3：受试化合物组合对缺血再灌注大鼠心肌梗死面积的影响
1材料、试剂及仪器
材料、试剂及仪器均同实施例2。
2.方法
Wistar大鼠，随机分成6组，每组6只，即假手术组(生理盐水)、缺血再灌注损伤组(生理盐水)、地奥心血康组(70mL/kg)、受试化合物组合(苦参酮︰降苦参酮︰苦参醇A＝3︰2︰1)低、中、高剂量组(15mg/kg、30mg/kg、60mg/kg)；各组大鼠均以10mL/kg的剂量灌胃给药，连续7d，每天1次，于末次给药1h后开始造模。其余方法同实施例2。
3实验结果
结果见表3，AAR/LV代表各组间冠脉结扎所致的缺血损伤程度；An/AAR表示心肌梗死面积大小。各组间AAR差异无显著性，表明各组动物的缺血程度大体相当，具有可比性。地奥心血康(阳性对照)可保护缺血再灌注损伤心肌，本研究发现其可显著减小大鼠心肌梗死面积(与模型组比较，An/AAR显著降低)，说明动物模型可靠；同地奥心血康一样，受试化合物组合中、高剂量组均可显著减小缺血再灌注所致心肌梗死面积，说明该化合物组合具有心肌保护作用。
表3受试化合物组合对心肌缺血再灌注大鼠梗死范围的影响(n＝6)
与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。