本发明涉及医药技术领域，特别涉及黄酮类化合物的应用。
背景技术：
手足口病是由病毒引起的儿童传染病，为我国法定丙类传染病。该病主要感染0-6岁的婴幼儿，以2-3岁儿童感染最为常见，手足口病发病初期在患儿四肢末端以及口腔等出引起疱疹或溃疡，患儿多在1-2周内痊愈。然而，少数病例病情进展迅速，可在发病1-5天左右出现脑膜炎、无菌性脑炎、脑干脑炎、脑脊髓炎、肺水肿以及循环障碍等，极少数病例病情危重，可致死亡，存活病例可留有后遗症。
根据世界卫生组织报告，能够引起手足口病症状的病毒大约有20多种，其中以肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)和柯萨奇病毒A组16型(coxsachievirus A16，CoxA16)最为常见，由这两种病毒感染引起的病例数约占总病例数80％以上。其他能够引起手足口病的病毒主要包括：柯萨奇病毒A组4、5、7、9和10型(CoxA4、CoxA5、CoxA7、CoxA9和CoxA10)，柯萨奇病毒B组2和5型(CoxB2和CoxB5)以及埃可病毒(ECHO)等。
目前，尽管针对EV71病毒的疫苗已经获批上市，但仍没有直接靶向病毒的药物，临床主要采取对症治疗的策略；而广谱抗病毒药物利巴韦林在应用于婴幼儿时有致畸和抑制生长发育的风险。因此，本发明提供的化合物能够在这一方面弥补现有技术的不足。
模型是化合物活性及作用机理的载体，手足口病毒感染可诱导多种细胞凋亡，包括人恶性胚胎横纹肌瘤细胞(RD)、神经上皮瘤细胞(SK-N-MC)、人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH、)成胶质细胞瘤细胞(SF268)、非洲绿猴肾细胞(Vero)、人微血管内皮细胞以及HeLa细胞等，在实际的研究中由于RD细胞和Vero细胞对病毒的敏感性较好，常用于细胞水平的抗病毒研究。在动物模型方面，1-7日龄的小鼠对病毒敏感，常用作动物模型。小鼠接种病毒后3-5天出现拒乳和体重下降等症状，6-8天四肢出现僵直性瘫痪等明显症状，9-13天后根据病情自愈或死亡。
目前，常见的抗手足口病药物有利巴韦林、阿昔洛韦、伐昔洛韦等，但是这些药副作用较强。
近年来，中药抗手足口病的研究逐渐引起人们的关注，而且由于很多中药组分属于天然提取药物，具有副作用小等优点。
二氢黄酮醇(Kanzonol)和新黄烷酮(Shinflavanone)是从中药植物中提取的黄酮类成分，药理研究表明二氢黄酮醇和新黄烷酮具有强心、利尿、降压、抑菌、能增强肌体免疫等多种作用。
目前未见二氢黄酮醇和新黄烷酮在制备治疗手足口病药物中应用的报道。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供一种黄酮类化合物的应用。本发明的目的在于提供黄酮类化合物(Ⅰ)，尤其是二氢黄酮醇和新黄烷酮在制备肠道病毒的抑制剂中的应用，本发明研究表明黄酮类化合物(Ⅰ)对肠道病毒诱导的细胞病变有抑制作用，能提高病毒感染细胞的存活率，抗病毒活性明显。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了黄酮类化合物(Ⅰ)在制备肠道病毒的抑制剂中的应用；
其中，R＝OH或H。
当R＝OH，该黄酮类化合物(Ⅰ)为二氢黄酮醇；当R为H时，该黄酮类化合物(Ⅰ)为新黄烷酮。
在本发明的一些具体实施方案中，所述肠道病毒为柯萨奇病毒。
在本发明的一些具体实施方案中，所述柯萨奇病毒为柯萨奇病毒A16型。
在本发明的另一些具体实施方案中，所述肠道病毒为肠道病毒EV71型。
在本发明的一些具体实施方案中，所述黄酮类化合物(Ⅰ)的活性剂量为50～200mg/kg/d。
本发明还提供了黄酮类化合物(Ⅰ)在制备预防和/或治疗肠道病毒感染的疾病的药物中的应用；
其中，R＝OH或H。
在本发明的一些具体实施方案中，所述肠道病毒感染的疾病为手足口病。在本发明中，所述肠道病毒为柯萨奇病毒。优选的，所述柯萨奇病毒为柯萨奇病毒A16型。所述肠道病毒还可以为肠道病毒EV71型。
在本发明的一些具体实施方案中，所述药物包括黄酮类化合物(Ⅰ)和药学上可接受的辅料。
在本发明的一些具体实施方案中，所述药物的剂型为任意一种临床可接受的口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药制剂。
在本发明的一些具体实施方案中，所述口服给药剂型中，所述乙酰黄芪苷的质量分数为17.5～88％。
在本发明的一些具体实施方案中，所述药物的口服或注射计量为0.5～2.5mg黄酮类化合物(Ⅰ)/kg人体体重/d。
在本发明的一些具体实施方案中，所述药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂、贴剂。
本发明提供黄酮类化合物(Ⅰ)在制备肠道病毒的抑制剂中的应用，本发明实验结果表明，黄酮类化合物(Ⅰ)对肠道病毒EV71型、柯萨奇病毒A16型诱导的细胞病变均有抑制作用，能提高病毒感染细胞的存活率；同时在体内可以抑制病毒的复制，提高病毒感染动物的生存率，延长感染动物的生存时间，缓解病毒感染引发的病症，从而具有治疗手足口病的作用；并可预防病毒在体内的增殖和扩散，保护正常组织免受损伤，起到预防病毒感染性疾病发生的作用。
本发明的有益效果是：
1、二氢黄酮醇和新黄烷酮是一种天然小分子化合物，二氢黄酮醇对肠道病毒EV71、柯萨奇病毒A16，EC50分别为140.87μmol/L、148.04μmol/L，SI分别为4.54、4.32；新黄烷酮对肠道病毒EV71、柯萨奇病毒A16，EC50分别为35.89μmol/L、3.69μmol/L，SI分别为37.69、3.51。
2、黄酮类化合物(Ⅰ)能够剂量依赖地抑制柯萨奇病毒A16、肠道病毒EV71病毒感染，呈剂量依赖关系。
3、缓解病毒引起的症状、减轻病毒感染导致的死亡；延长病毒感染小鼠生存时间，提高小鼠存活率。
具体实施方式
本发明公开了一种黄酮类化合物的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了黄酮类化合物(Ⅰ)在制备肠道病毒的抑制剂中的应用；
其中，R＝OH或H。
在本发明中，所述黄酮类化合物(Ⅰ)具有式Ⅰ所示结构，属于黄酮苷，药理研究表明，二氢黄酮醇和新黄烷酮具有强心、利尿、降压、抑菌、能增强肌体免疫等多种作用。
所述黄酮类化合物(Ⅰ)优选为黄酮类化合物(Ⅰ)单体和/或黄酮类化合物(Ⅰ)提取物，所述黄酮类化合物(Ⅰ)提取物中，单体黄酮类化合物(Ⅰ)的含量优选在90％以上，本发明可按照常规方法从含有黄酮类化合物(Ⅰ)的中药材或者中药饮片中提取得到，如甘草；也可购买黄酮类化合物(Ⅰ)的市售商品。具体的，在本发明的实施例中，可采用中国药品生物制品检定所提供的黄酮类化合物(Ⅰ)。
本发明中，所述肠道病毒为柯萨奇病毒。优选的，所述柯萨奇病毒为柯萨奇病毒A16型。
在本发明的另一些实施例中，所述肠道病毒为肠道病毒EV71型。
本发明还提供了黄酮类化合物(Ⅰ)在制备预防和/或治疗肠道病毒感染的疾病的药物中的应用。
本发明提供了黄酮类化合物(Ⅰ)在制备治疗手足口病药物中的应用。其中，所述的引起手足口病的病毒包括肠道病毒。优选的，所述的引起手足口病的病毒包括柯萨奇病毒A16型和/或肠道病毒EV71型。
在本发明中，所述抗手足口病药物包括黄酮类化合物(Ⅰ)和药学上可接受的载体。在本发明中，所述药学上可接受的载体优选包括淀粉、低取代羟丙基纤维素、微粉硅胶、硬脂酸镁、淀粉浆、蔗糖、糊精、羧甲基淀粉钠、滑石粉、聚山梨酯、聚乙二醇、注射用大豆磷脂和注射用甘油中的一种或几种；所述抗手足口病药物为任意一种临床可接受的口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药制剂。优选的，所述抗手足口病药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、煎膏剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂、贴剂。所述口服给药剂型的抗手足口病药物中，黄酮类化合物(Ⅰ)的质量分数为17.5～88％，更优选为20～80％，最优选为25～75％。
本发明中，所述黄酮类化合物(Ⅰ)的活性剂量优选为50-200mg/kg/d；更优选为100-200mg/kg/d。
在本发明中，所述抗手足口病药物每天的口服剂量为0.5～2.5mg黄酮类化合物(Ⅰ)/kg人体体重，更优选为0.625～2.0mg黄酮类化合物(Ⅰ)/kg体重；所述抗手足口病药物每天的注射剂量为0.5～2.5mg黄酮类化合物(Ⅰ)/kg人体体重，更优选为0.625～2.0mg黄酮类化合物(Ⅰ)/kg体重。
本发明对所述包含黄酮类化合物(Ⅰ)的抗手足口病药物的制备方法没有特殊的限制，按照本领域技术人员常用的制药方法即可。
本发明提供了黄酮类化合物(Ⅰ)在制备治疗手足口病药物中的应用,本发明采用了MTT法测定了黄酮类化合物(Ⅰ)对柯萨奇病毒A16型和肠道病毒EV71型的抑制活性，结果表明，二氢黄酮醇对肠道病毒EV71、柯萨奇病毒A16，EC50分别为140.87μmol/L、148.04μmol/L，SI分别为4.54、4.32；新黄烷酮对肠道病毒EV71、柯萨奇病毒A16，EC50分别为35.89μmol/L、3.69μmol/L，SI分别为37.69、3.51。
本发明以灌胃(口服)的方式进行了二氢黄酮醇对肠道病毒EV71型所致小鼠感染的疗效测试，结果表明，二氢黄酮醇在剂量50/100/200mg/kg/day时灌胃给药5天，小鼠的存活率分别为30％、50％和70％，死亡保护率分别为12.5％、37.5％和62.5％，阳性对照药利巴韦林的小鼠存活率为70％，死亡保护率62.5％；本发明以灌胃(口服)的方式进行了二氢黄酮醇对柯萨奇病毒A16型所致小鼠感染的疗效测试，结果表明，二氢黄酮醇在剂量50/100/200mg/kg/day时灌胃(口服)给药5天，死亡保护率分别为14.29％、42.86％和71.43％，阳性对照药利巴韦林的小鼠存活率为80％，死亡保护率71.43％，
本发明以注射的方式进行了二氢黄酮醇对肠道病毒EV71型所致小鼠感染的疗效测试，结果表明，二氢黄酮醇在剂量50/100/200mg/kg/day时注射给药5天，死亡保护率分别为33.33％、55.56％、77.78％；本发明以注射的方式进行了二氢黄酮醇对柯萨奇病毒A16型所致小鼠感染的疗效测试，结果表明，二氢黄酮醇在剂量50/100/200mg/kg/day时注射给药5天，死亡保护率分别为37.50％、50.00％、87.50％。
可见，二氢黄酮醇和新黄烷酮与阳性对照药利巴韦林对柯萨奇病毒A16型和肠道病毒EV71型的抑制效果相似，黄酮类化合物(Ⅰ)可以抑制病毒的复制，提高病毒感染动物的生存率，延长感染动物的生存时间，缓解病毒感染引发的病症，从而具有治疗手足口病的作用。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的黄酮类化合物(Ⅰ)在制备治疗手足口病药物中的应用进行详细描述，但不能将其理解为对本发明保护范围的限定。
本发明提供的黄酮类化合物的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1二氢黄酮醇对EV71和CoxA16病毒感染细胞的保护作用
1、实验材料：
柯萨奇病毒A16型(CoxA16)和肠道病毒71型(EV71)，由中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究免疫学研究室提供，由江苏康缘现代中药研究院保存，在Vero细胞培养内传代，-80℃保存。
非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)，购于美国ATCC细胞库，由江苏康缘现代中药研究院保存。
DMEM培养基，购自南京凯基生物科技发展有限公司，批号：20141024，细胞生长液中含10％胎牛血清、1×105U/L青霉素、100mg/L链霉素。细胞维持液中除含2％胎牛血清外，其它同细胞生长液。利巴韦林，购自哈药三精制药，国药准字H19993937，规格：1ml:0.1g，批号：140312。
M2e型酶标仪，Molecular Devices；移液器，eppendorf公司；生物安全柜，购自Heal Force公司，型号：HFsafe-1200；二氧化碳培养箱，购自Thermo Scientific公司，型号：FormaSteri-Cycle 371。
2、实验方法：
Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)用含2％胎牛血清的DMEM培养基按5×104个/ml浓度接种96孔培养板，每孔100μl，置37℃ 5％CO2培养箱中培养过夜形成细胞单层。弃上清后，用PBS将细胞洗涤1次，以洗去残留的胎牛血清，加入用不含胎牛血清的DMEM培养基稀释至100TCID50各株病毒(EV71和CoxA16)，每孔100μl，35℃孵育2h后，弃去病毒液。用2％胎牛血清的DMEM培养基将二氢黄酮醇配制成不同浓度，分别加入单层Vero细胞中，设3个复孔，Vero细胞于37℃、5％CO2培养箱中培养48h，每日观察细胞病变现象。48h后，弃上清后，加入100μl 10％甲醛固定1h，0.1％(w/v)结晶紫染色15min，酶标仪570nm测定吸光度。实验共重复3次。计算病毒抑制率，并计算二氢黄酮醇对两种病毒的EC50(半数有效浓度)、SI(选择指数)。
表1二氢黄酮醇体外抗病毒试验(μM)
表1结果显示：二氢黄酮醇在体外对EV71和CoxA16病毒所致细胞病变具有明显抑制作用，其EC50分别为140.87、148.04μM，SI分别为4.54、4.32；具备应用于抗手足口病毒感染治疗的体外药效学基础。
实施例2二氢黄酮醇口服给药对EV71感染的治疗作用
1、实验材料：
肠道病毒71型(EV71)，由中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究免疫学研究室提供，由江苏康缘现代中药研究院保存，在Vero细胞培养内传代，-80℃保存。
SPF级怀孕15-16日BALB/c孕鼠，购自南京市江宁区青龙山实验动物繁育场，饲养在IVC系统中(温度18～28℃，40～70％相对湿度，机械送排风；明暗周期：12h/12h；150～300Lux照度)，取3日龄新生乳鼠开展实验。
利巴韦林，购自哈药三精制药，国药准字H19993937，规格：1ml:0.1g，批号：140312。
2、实验方法：
3日龄BALB/c乳鼠按窝随机分为正常组、模型组、利巴韦林颗粒组100mg/kg/d、二氢黄酮醇低剂量组50mg/kg/d，中剂量组100mg/kg/d，高剂量组200mg/kg/d，每组10只，除正常对照组外，其余各组腹腔注射EV71病毒悬液(107TCID50)进行感染，0.1mL/只，各给药组以灌胃给药，每次0.1ml，连续5天，每次给药或感染后均用75％乙醇喷洒乳鼠包裹垫料后，放回笼中与母鼠共同饲养，正常对照组和病毒对照组给予蒸馏水。感染后每日观察乳鼠的生存状态，共观察14d，并根据下列标准评分，计算感染的严重程度0分：健康；1分：弓背、竖毛(长出毛后观察)、消瘦、活动减少等；2分：后肢力量减弱；3分：单侧后肢麻痹或瘫痪；4分：双侧后肢麻痹或瘫痪；5分：濒死或死亡。计算各组死亡率和生命延长率并用SPSS软件进行统计分析。
表2二氢黄酮醇灌胃给药对EV71感染BALB/c乳鼠感染程度的影响(n＝10)
P与模型组比较
表3二氢黄酮醇灌胃给药对EV71感染Babl/c乳鼠的死亡保护作用
**P<0.01，*P<0.05与模型组比较
表2结果显示，二氢黄酮醇各剂量组灌胃给药后，可以显著减缓EV71和CoxA16病毒感染乳鼠引起的消瘦，后肢力量减弱，单侧后肢瘫痪等症状，其感染程度积分与模型组比较均具有显著性差异；表3结果显示，二氢黄酮醇高、中、低剂量的死亡保护率分别为62.50％、37.50％、12.5％，生命延长率分别为78.45％、52.36％、32.16％，表明二氢黄酮醇各剂量组感染程度均明显减少EV71病毒感染乳鼠死亡率和感染程度，延长其生存时间，与模型组比较具有显著性差异，提示二氢黄酮醇对手足口病毒感染具有治疗作用。
实施例3二氢黄酮醇口服给药对CoxA16感染的治疗作用
1、实验材料：
柯萨奇病毒A16型(Cox A16)，由中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究免疫学研究室提供，由江苏康缘现代中药研究院保存，在Vero细胞培养内传代，-80℃保存。
SPF级怀孕15-16日BALB/c孕鼠，购自南京市江宁区青龙山实验动物繁育场，饲养在IVC系统中(温度18～28℃，40～70％相对湿度，机械送排风；明暗周期：12h/12h；150～300Lux照度)，取3日龄新生乳鼠开展实验。
二氢黄酮醇，由江苏康缘药业股份有限公司自制，纯度97.64％。利巴韦林，购自哈药三精制药，国药准字H19993937，规格：1ml：0.1g，批号：140312。
2、实验方法：
3日龄BALB/c乳鼠按窝随机分为正常组、模型组、利巴韦林颗粒组200mg/kg/d、二氢黄酮醇低剂量组50mg/kg/d，中剂量组100mg/kg/d，高剂量组200mg/kg/d，每组10只，除正常对照组外，其余各组腹腔注射CoxA16病毒悬液(107TCID50)进行感染，0.1mL/只，各给药组以灌胃给药，每次0.1ml，连续5天，每次给药或感染后均用75％乙醇喷洒乳鼠包裹垫料后，放回笼中与母鼠共同饲养，正常对照组和病毒对照组给予蒸馏水。感染后每日观察乳鼠的生存状态，共观察14d，并根据下列标准评分，计算感染的严重程度0分：健康；1分：弓背、竖毛(长出毛后观察)、消瘦、活动减少等；2分：后肢力量减弱；3分：单侧后肢麻痹或瘫痪；4分：双侧后肢麻痹或瘫痪；5分：濒死或死亡。计算各组死亡率和生命延长率并用SPSS软件进行统计分析。
表4二氢黄酮醇灌胃给药对CoxA16感染BALB/c乳鼠感染程度的影响(n＝10)
P与模型组比较
表5二氢黄酮醇灌胃给药对CoxA16感染Babl/c乳鼠的死亡保护作用
**P<0.01，*P<0.05与模型组比较
表4结果显示，二氢黄酮醇各剂量组灌胃给药后，可以显著减缓CoxA16病毒感染乳鼠引起的消瘦，后肢力量减弱，单侧后肢瘫痪等症状，其感染程度积分与模型组比较均具有显著性差异；表5结果显示，二氢黄酮醇高、中、低剂量的死亡保护率分别为71.43％、42.86％、14.29％，生命延长率分别为80.45％、55.37％、35.18％，表明二氢黄酮醇各剂量组感染程度均明显减少CoxA16病毒感染乳鼠死亡率和感染程度，延长其生存时间，与模型组比较具有显著性差异，提示二氢黄酮醇对手足口病毒感染具有治疗作用。
实施例4新黄烷酮对EV71和CoxA16病毒感染细胞的保护作用
1、实验材料：
柯萨奇病毒A16型(Cox A16)和肠道病毒71型(EV71)，由中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究免疫学研究室提供，由江苏康缘现代中药研究院保存，在Vero细胞培养内传代，-80℃保存。
非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)，购于美国ATCC细胞库，由江苏康缘现代中药研究院保存。
DMEM培养基，购自南京凯基生物科技发展有限公司，批号：20141024，细胞生长液中含10％胎牛血清、1×105U/L青霉素、100mg/L链霉素。细胞维持液中除含2％胎牛血清外，其它同细胞生长液。新黄烷酮，由江苏康缘药业股份有限公司自制，纯度98.97％。利巴韦林，购自哈药三精制药，国药准字H19993937，规格：1ml：0.1g，批号：140312。
M2e型酶标仪，Molecular Devices；移液器，eppendorf公司；生物安全柜，购自Heal Force公司，型号：HFsafe-1200；二氧化碳培养箱，购自Thermo Scientific公司，型号：FormaSteri-Cycle 371。
2、实验方法：
新黄烷酮毒性测定Vero细胞用胰酶消化后，调整细胞密度至1×105个/ml，每孔100μl接种96孔培养板，置37℃ 5％CO2培养箱中培养2h后弃上清，加入200μl含新黄烷酮(DMSO溶)培养基(药物从400μM起4倍稀释7个梯度，2.5％FBS)，设对照组(含1/1000DMSO)，每组3个复孔，培养72h后MTS试剂盒测定细胞活力，490nm检测吸光度，计算各剂量新黄烷酮对细胞毒性。在GraphPad Prism5统计软件中，运用非线性回归构建各药物剂量与毒性效应关系曲线，计算新黄烷酮对Vero细胞的最大无毒浓度(TC0)和半数毒性浓度(TC50)。
新黄烷酮对EV71和CoxA16致细胞病变作用的影响取已长满单层细胞的培养板，吸弃培养液，以100TCID50对应的病毒攻击量加入细胞，每孔100μl，Vero细胞用含2％胎牛血清的DMEM培养基按5×104个/ml浓度接种96孔培养板，每孔100μl，37℃ 5％CO2培养箱吸附2h后，弃去病毒液。用2％胎牛血清的DMEM培养基将新黄烷酮配制成最大无毒浓度，加入单层Vero细胞中，设6个复孔。利巴韦林为阳性对照药物，同时设细胞对照组(不加病毒不加药)、病毒对照组(加病毒但不加药物)和空白对照组(无细胞，不加病毒不加药)。37℃、5％CO2培养箱中培养72h后MTS试剂盒测定细胞活力，490nm检测吸光度A。按下列公式计算新黄烷酮对病毒的抑制率。
病毒抑制率＝(A490药物-A490病毒)/(A490正常-A490病毒)×100％
EC50和SI测定Vero细胞用含2％胎牛血清的DMEM培养基按5×104个/ml浓度接种96孔培养板，每孔100μl，置37℃5％CO2培养箱中培养过夜形成细胞单层。弃上清后，用PBS将细胞洗涤1次，以洗去残留的胎牛血清，加入用不含胎牛血清的DMEM培养基稀释至100TCID50病毒，每孔100μl，35℃孵育2h后，弃去病毒液。用2％胎牛血清的DMEM培养基将新黄烷酮配制成不同浓度，分别加入单层Vero细胞中，设3个复孔，Vero细胞于37℃、5％CO2培养箱中培养48h，每日观察细胞病变现象。48h后，弃上清后，加入100μl 10％甲醛固定1h，0.1％(w/v)结晶紫染色15min，酶标仪570nm测定吸光度。实验共重复3次。计算病毒抑制率，并计算新黄烷酮对两种流感病毒细胞的EC50(半数有效浓度)和SI(选择指数)。
表6新黄烷酮体外抗病毒试验(μM)
表7新黄烷酮对EV71和Cox A16致细胞病变的抑制率(％)
*P<0.05，**P<0.01，与病毒对照比较；△P<0.05，△△P<0.01，与利巴韦林比较
表6结果显示：新黄烷酮对肠道病毒型EV71、CoxA16病毒具有一定的抑制作用，EC50分别为35.89、37.69μM，SI分别为3.69、3.51；表7结果显示：新黄烷酮在最大无毒浓度下对EV71和Cox A16均由明显的抑制作用，与病毒对照组比较有显著的统计学差异。实验结果表明新黄烷酮对以上毒株体外复制具有抑制作用，提高了病毒感染细胞的存活率。
实施例5新黄烷酮对肠道病毒EV71感染的治疗作用
1、实验材料：
肠道病毒71型(EV71)，由中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究免疫学研究室提供，由江苏康缘现代中药研究院保存，在Vero细胞培养内传代，-80℃保存。
SPF级怀孕15-16日BALB/c孕鼠，购自南京市江宁区青龙山实验动物繁育场，饲养在IVC系统中(温度18～28℃，40～70％相对湿度，机械送排风；明暗周期：12h/12h；150～300Lux照度)，取3日龄新生乳鼠开展实验。
新黄烷酮，由江苏康缘药业股份有限公司自制，纯度98.97％。利巴韦林，购自哈药三精制药，国药准字H19993937，规格：1ml:0.1g，批号：140312。2、实验方法：
3日龄BALB/c乳鼠按窝随机分为正常组、模型组、利巴韦林组100mg/kg/d、新黄烷酮低剂量组50mg/kg/d，中剂量组100mg/kg/d，高剂量组200mg/kg/d，每组10只，除正常对照组外，其余各组腹腔注射肠道病毒EV71病毒液(107TCID50)进行感染，0.1mL/只，各给药组以灌胃给药，每次0.1ml，连续5天，每次给药或感染后均用75％乙醇喷洒乳鼠包裹垫料后，放回笼中与母鼠共同饲养，正常对照组和病毒对照组给予蒸馏水。感染后每日观察乳鼠的生存状态，共观察14d，并根据下列标准评分，计算感染的严重程度0分：健康；1分：弓背、竖毛(长出毛后观察)、消瘦、活动减少等；2分：后肢力量减弱；3分：单侧后肢麻痹或瘫痪；4分：双侧后肢麻痹或瘫痪；5分：濒死或死亡。计算各组死亡率和生命延长率并用SPSS软件进行统计分析。
表8新黄烷酮治疗给药对肠道病毒EV71感染BALB/c乳鼠感染程度的影响(n＝10)
*P<0.05，**P<0.01，与模型组比较
表8结果显示，新黄烷酮各剂量组进行治疗性给药后，可以显著减缓肠道病毒EV71感染乳鼠引起的消瘦，后肢力量减弱，单侧后肢瘫痪等症状，其感染程度积分与模型组比较均具有显著性差异。
表9新黄烷酮治疗给药肠道病毒EV71感染乳鼠生存率与生存时间(n＝10)
*P<0.05，**P<0.01，与模型组比较
表9结果显示，新黄烷酮高、中、低剂量的死亡保护率分别为77.78％、55.56％、33.33％，生命延长率分别为48.96％、40.39％、28.89％，表明新黄烷酮各剂量组感染程度均明显减少肠道病毒EV71感染乳鼠死亡率和感染程度，延长其生存时间，与模型组比较具有显著性差异，提示新黄烷酮对肠道病毒EV 71感染具有治疗作用。
实施例6新黄烷酮对柯萨奇病毒A16型感染的治疗作用
1、实验材料：
柯萨奇病毒A16型(Cox A16)，由中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究免疫学研究室提供，由江苏康缘现代中药研究院保存，在Vero细胞培养内传代，-80℃保存。
SPF级怀孕15-16日BALB/c孕鼠，购自南京市江宁区青龙山实验动物繁育场，饲养在IVC系统中(温度18～28℃，40～70％相对湿度，机械送排风；明暗周期：12h/12h；150～300Lux照度)，取3日龄新生乳鼠开展实验。
新黄烷酮，由江苏康缘药业股份有限公司自制，纯度98.97％。利巴韦林，购自哈药三精制药，国药准字H19993937，规格：1ml：0.1g，批号：140312。2、实验方法：
3日龄BALB/c乳鼠按窝随机分为正常组、模型组、利巴韦林组100mg/kg/d、新黄烷酮低剂量组50mg/kg/d，中剂量组100mg/kg/d，高剂量组200mg/kg/d，每组10只，除正常对照组外，其余各组腹腔注射柯萨奇病毒A16型(Cox A16)病毒液(107TCID50)进行感染，0.1mL/只，各给药组以灌胃给药，每次0.1ml，连续5天，每次给药或感染后均用75％乙醇喷洒乳鼠包裹垫料后，放回笼中与母鼠共同饲养，正常对照组和病毒对照组给予蒸馏水。感染后每日观察乳鼠的生存状态，共观察14d，并根据下列标准评分，计算感染的严重程度0分：健康；1分：弓背、竖毛(长出毛后观察)、消瘦、活动减少等；2分：后肢力量减弱；3分：单侧后肢麻痹或瘫痪；4分：双侧后肢麻痹或瘫痪；5分：濒死或死亡。计算各组死亡率和生命延长率并用SPSS软件进行统计分析。
表10新黄烷酮治疗给药对柯萨奇病毒A16型感染BALB/c乳鼠感染程度的影响(n＝10)
*P<0.05，**P<0.01，与模型组比较
表10结果显示，新黄烷酮各剂量组进行治疗性给药后，可以显著减缓柯萨奇病毒A16型感染乳鼠引起的消瘦，后肢力量减弱，单侧后肢瘫痪等症状，其感染程度积分与模型组比较均具有显著性差异。
表11新黄烷酮治疗给药后柯萨奇病毒A16型感染乳鼠生存率与生存时间(n＝10)
*P<0.05，**P<0.01，与模型组比较
表11结果显示，新黄烷酮高、中、低剂量的死亡保护率分别为87.50％、50.00％、37.50％，生命延长率分别为41.43％、28.04％、22.12％，表明新黄烷酮各剂量组感染程度均明显减少柯萨奇病毒A16型(Cox A16)感染乳鼠死亡率和感染程度，延长其生存时间，与模型组比较具有显著性差异，提示新黄烷酮对柯萨奇病毒A16型(Cox A16)感染具有治疗作用。
实施例7二氢黄酮醇在制备胶囊剂药物中的应用
将350g二氢黄酮醇和32g淀粉、6g低取代羟丙基纤维素、4.5g微粉硅胶、1.5g硬脂酸镁、及适量10％淀粉浆混合，装入胶囊，得到二氢黄酮醇的胶囊制剂1000粒。每日3次，每次1粒。
实施例8新黄烷酮在制备颗粒剂药物中的应用
将350g新黄烷酮和1000g蔗糖及500g糊精混合，按照常规方法制成1000包新黄烷酮颗粒剂。每日3次，每次1粒。
实施例9二氢黄酮醇在制备片剂药物中的应用
将350g二氢黄酮醇和50g淀粉、7.5g羧甲基淀粉钠、0.8g滑石粉、50g糊精、0.8g硬脂酸镁及适量10％淀粉浆适混合，按照常规方法制成二氢黄酮醇片剂1000片。每日3次，每次1片。
实施例10新黄烷酮在制备丸剂药物中的应用
将350g新黄烷酮和12g聚乙二醇-6000、80.5g聚山梨酯-80、适量液状石蜡混合，按照常规方法制成新黄烷酮丸剂1000粒。每日3次，每次1粒。
实施例11二氢黄酮醇在制备注射剂药物中的应用
将200g二氢黄酮醇和15g注射用大豆磷脂、25g注射用甘油，注射用水定容至1000mL，按照常规方法制成二氢黄酮醇注射剂1000支。每日1次，每次1支，至少采用250mL 5％葡萄糖注射液稀释后静脉滴注。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。