一种桑葚提取物及其在制备肝脏细胞损伤抑制剂中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种桑葚提取物及其在制备肝脏细胞损伤抑 制剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 桑葚（Mulberry)为桑科（Moraceae)桑属（Morus)衆果类果树，是重要的第三代 小果类果树。果实未成熟时为绿色，逐渐成长变为白色、红色，成熟后为紫红色或紫黑色，味 酸甜，柔软多汁且营养丰富，富含多糖、蛋白质、多种氨基酸和微量元素，还含有黄酮、多酚、 花色苷等抗氧化活性物质，具有调节免疫力、防止血管硬化和防癌抗癌等功能。
[0003] 如公开号为CN 104289088 A的中国专利文献公开了一种桑葚提取物在制备降糖 药物中的应用。
[0004] 自由基是机体内氧化反应产生的物质，具有很强的氧化性，现代研宄表明，自由基 是引起人体衰老和某些慢性疾病发生的原因之一，当人体内的自由基产生过多或清除过慢 时，就会转而攻击各种细胞器官，损害机体的组织，进而引起慢性疾病及衰老效应并诱发各 种疾病。
[0005] 丙烯酰胺（Acrylamide，AA)俗称丙毒，是一种具有神经毒性和潜在致癌性的化学 物质，它可作为化工原料，而富含淀粉的食品在热加工过程中也会产生丙烯酰胺。研宄表 明，丙烯酰胺具有神经毒性、遗传毒性以及致癌性，国际癌症研宄机构（IARC) 1994年对其 致癌性进行了评价，将丙烯酰胺列为2类致癌物（2A)即人类可能致癌物。张希春等通过AA 与大鼠肝切片共孵育，HPLC-MS/MS检测AA代谢性反应产物环丙氧酰胺（glycidamide，GA) 的生成量，western blot分析细胞色素 P4502E1(CYP2E1)蛋白的表达。剂量组（1.0、2.0、 4. Ommol/L)随着AA浓度的增加，肝切片代谢生成的GA也随之增加，3种剂量组间差异显著 (P<〇.〇5)(张希春，张敏爱.丙烯酰胺肝脏代谢与细胞色素 P4502E1蛋白表达[J].现代 预防医学，2007, 34(5) :910-911.)
[0006] 肝脏是人体生物转化和解毒的重要器官，是AA进入人体后最初的代谢场所，能聚 集高浓度的AA，而肝脏细胞色素 P450中的CYP2E1作为一种代谢外来异物的单氧合酶，可 将AA氧化为GA，GA比AA更具细胞毒性。因此，抑制丙烯酰胺对肝脏损伤的物质具有很大 的研宄意义。
【发明内容】
[0007] 本发明公开了一种桑葚提取物，及其在制备由丙烯酰胺诱导的肝脏细胞氧化损伤 的抑制剂中的新应用。
[0008] 一种桑葚提取物，提取步骤如下：
[0009] 桑葚鲜果依次经胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解后，酶解液经分离得到上清液，所述上清 液经过滤后截留分子量大于5kDa的成分，滤出液再经真空冷冻干燥，得到所述的桑葚提取 物；
[0010] 以质量百分比计，所述桑葚提取物包括：
[0011] 矢车菊-3-0-葡萄糖昔（Cyanidin_3-〇-glucoside) 58%~68% ;
[0012] 矢车菊-3-0-芸香糖苷（Cyanidin-3-〇-rutinoside) 27%~39% ;
[0013] 天竺奏-3-0-葡萄糖昔（Pelargonidin_3-〇-glucoside) 0.87%~4.44% ;
[0014] 天竺葵-3-0-芸香糖苷（Pelargonidin-3-〇-rutinoside) 0· 34% ~1. 48%。
[0015] 本发明通过模拟人体胃肠道消化的方式，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶等提取方式制 备得到桑葚提取物。该桑葚提取物含有人体最终吸收的有效成分，最大限度的保留了有效 成分，其功能性具有实用性；而通过传统方法提取的桑葚产物，进入人体后，一部分有效物 质被人体消化系统分解消化，因而功能性具有不可预测性，不能代表进入人体后的真实情 况。
[0016] 作为优选，桑葚鲜果经胃蛋白酶酶解的具体步骤为：
[0017] 桑葚鲜果与水等质量混合打浆，加入HCl调节pH = 1. 5~2后得到匀浆，再加入 胃蛋白酶，37°C、100~200rpm下水浴振荡2~3h，得到混合浆液。
[0018] 进一步优选，所述HCl的浓度为5mol/L ;
[0019] 所述胃蛋白酶的加入量为5000~7000单位胃蛋白酶/20g匀浆。
[0020] 作为优选，胰蛋白酶酶解的具体步骤为：
[0021] 取经胃蛋白酶酶解得到的混合浆液，加入NaOH调节pH = 6~7,再加入胰液，然后 用NaHC03调节pH至7. 2~7. 5, 37°C，100~200rpm水浴振荡2~3h后，得到酶解液。
[0022] 进一步优选，所述NaOH的浓度为lmol/L，NaHCO^浓度为ImoVL0
[0023] 所述胰液中胰蛋白酶的含量为5~6mg/mL，胆盐的含量为20~30mg/mL ;所述胰 液的加入量为5mL/18mL混合浆液。
[0024] 本发明还公开了所述桑葚提取物在制备肝脏细胞氧化损伤的抑制剂中的新用途， 拓展了桑葚的应用领域。
[0025] 进一步公开了所述的桑葚提取物在制备由丙烯酰胺诱导的肝脏细胞氧化损伤的 抑制剂中的应用。
[0026] 作为优选，所述的抑制剂中桑葚提取物的有效剂量为lmg/mL。
[0027] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0028] 本发明模拟人体胃消化的方式，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶制备桑葚提取物。
[0029] 本发明首次发现了桑葚提取物能够有效抑制丙烯酰胺诱导的氧化损伤，减少活性 氧的生成，具有良好的开发前景。
[0030] 本发明为桑葚提取物提供了新的医疗用途，拓展了一个新的应用领域。
【附图说明】
[0031] 图1为实施例1制备的桑葚提取物对ABTS' +自由基清除能力；
[0032] 图2为实施例1制备的桑葚提取物对丙烯酰胺诱导的HepG2细胞氧化损伤的保护 作用；
[0033] 图3为实施例2制备的桑葚提取物对丙烯酰胺诱导的HepG2细胞活性氧自由基 ROS (DCF荧光）的抑制作用；
[0034] 图4为实施例3制备的桑葚提取物对丙烯酰胺诱导的HepG2细胞核损伤 (Hochest)的抑制作用。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施 例，但本发明的保护范围并不仅限于此：
[0036] 实施例1
[0037] 桑葚鲜果与水等质量混合打浆，用5M盐酸将桑葚匀浆pH调节至2,加入胃蛋白酶 (5000单位胃蛋白酶/20g匀浆），在37°C下，200rpm水浴振荡2. 5h，体外模拟胃消化的产物 继续用IM NaOH调pH至6,加入5mL胰液（胰液中胰酶含量为6mg/mL，胆盐含量为20mg/ mL)，再用IM NaHCOJjf pH至7. 2,在37°C下，IOOrpm水浴振荡3h，体外模拟肠消化结束后， 在8000rpm条件下离心10min，上清液即为桑葚粗提取物。上清液利用Millipore Pellicon 超滤系统，将上述提取液泵至截留分子量为5kDa的再生纤维素超滤膜表面，收集滤液，真 空冷冻干燥，得到桑葚提取物。
[0038] 经液相色谱测试可知，该桑葚提取物的主要成分如下表所示：
[0039] 表 1
[0040]
[0041] 实施例2
【主权项】
1. 一种桑葚提取物，其特征在于，提取步骤如下： 桑葚鲜果依次经胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解后，酶解液经分离得到上清液，所述上清液经 过滤后截留分子量大于5kDa的成分，滤出液再经真空冷冻干燥，得到所述的桑葚提取物； 以质量百分比计，所述桑葚提取物包括：
2. 根据权利要求1所述的桑葚提取物，其特征在于，桑葚鲜果经胃蛋白酶酶解的具体 步骤为： 桑葚鲜果与水等质量混合打浆，加入HC1调节pH= 1. 5~2后得到匀浆，再加入胃蛋 白酶，37°C、100~200rpm下水浴振荡2~3h，得到混合浆液。
3. 根据权利要求2所述的桑葚提取物，其特征在于，所述HC1的浓度为5mol/L; 所述胃蛋白酶的加入量为5000~7000单位胃蛋白酶/20g匀浆。
4. 根据权利要求1所述的黑莓提取物，其特征在于，胰蛋白酶酶解的具体步骤为： 取经胃蛋白酶酶解得到的混合浆液，加入NaOH调节pH= 6~7,再加入胰液，然后用 NaHC03调节pH至7. 2~7. 5, 37°C，100~200rpm水浴振荡2~3h后，得到酶解液。
5. 根据权利要求4所述的桑葚提取物，其特征在于，所述NaOH的浓度为lmol/L，NaHCO3 的浓度为lm〇l/L〇
6. 根据权利要求4所述的桑葚提取物，其特征在于，所述胰液中胰蛋白酶的含量为5~ 6mg/mL，胆盐的含量为20~30mg/mL; 所述胰液的加入量为5mL/18mL混合浆液。
7. -种根据权利要求1所述的桑葚提取物在制备肝脏细胞氧化损伤的抑制剂中的应 用。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的肝脏细胞氧化损伤由丙烯酰胺诱 导。
9. 根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述的抑制剂中桑葚提取物的有效剂 量为lmg/mL。
【专利摘要】本发明公开了一种桑葚提取物，按质量百分含量计，该桑葚提取物包括：矢车菊-3-O-葡萄糖苷(58％～68％)、矢车菊-3-O-芸香糖苷(27％～39％)、天竺葵-3-O-葡萄糖苷(0.87％～4.44％)、天竺葵-3-O-芸香糖苷(0.34％～1.48％)。提取步骤为：桑葚鲜果依次经胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解后，离心分离得到上清液，所述上清液经超滤膜过滤后截留分子量大于5kDa的成分，滤出液经真空冷冻干燥，得到所述的桑葚提取物。本发明还公开了该桑葚提取物在制备由丙烯酰胺诱导的肝脏细胞氧化损伤的抑制剂中的应用。
【IPC分类】A61K36-605, A61P1-16, A61K31-7048
【公开号】CN104840523
【申请号】CN201510221689
【发明人】陈卫, 张凌霞, 鲍涛
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年5月4日