含有小球藻提取物的、用于预防或治疗肝脏疾病的组合物的制作方法

含有小球藻提取物的、用于预防或治疗肝脏疾病的组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种含有小球藻提取物的、用于预防或治疗肝脏疾病的组合物。根据本发明，含有小球藻提取物的组合物可以应用于医疗用品和健康辅食等，并且因为本发明的小球藻提取物在肝功能损伤模型中显示出对肝功能损伤的抑制效果，所以其可以有效地用作预防或治疗肝脏疾病的组合物。
【专利说明】含有小球藻提取物的、用于预防或治疗肝脏疾病的组合物

【技术领域】
[0001] 本发明涉及含有小球藻提取物的、用于预防或治疗肝脏疾病的组合物。

【背景技术】
[0002] 肝脏是非常重要的器官，负责各种代谢、解毒、分解、在体内的合成和分泌，并且特 别地，其功能如下：首先，肝脏具有控制能量代谢的功能，并且其能将从食物吸收的所有养 分代谢为产生能量的原料并将该原料提供给整个身体或储存该原料。第二，肝脏具有合成， 储存和分配约2000种酶、白蛋白、凝血因子的血清蛋白、胆汁酸和脂质如磷脂和胆固醇的 功能。第三，肝脏具有经胆管将各种代谢物分泌到十二指肠的功能，并且由于其免疫功能， 肝脏在维持生命方面起着重要作用。最后，由于其解毒和分解功能，肝脏能解除药物、有毒 物质、酒精等的毒性。然而，由于肝脏的这种解毒功能容易损伤肝细胞，它可能会引起药物 诱导的，毒性或酒精性肝脏疾病。
[0003] 根据临床症状，酒精性肝脏疾病主要可分为酒精性脂肪肝、酒精性肝炎和酒精性 肝硬化，并且酒精性肝脏疾病可能是由于在约10年中每天饮酒60-80克引起的。酒精性脂 肪肝是由于过度饮酒在肝细胞中造成胆固醇和甘油三酯的积累而引起的，并且只要停止饮 用，酒精性脂肪肝就可以恢复，但持续饮用可以使酒精性脂肪肝发展成肝炎。酒精性肝炎是 导致肝细胞坏死和炎症的条件，并且酒精性肝炎表现出各种症状如：疲劳、食欲不振、体重 减轻、黄疸、发热、右上腹疼痛等，并且在约40%的患有酒精性肝炎的患者中，酒精性肝炎可 以发展为酒精性肝硬化。酒精性肝硬化是一种状态，其中肝脏不能恢复正常，并且表现出各 种症状如：全身疲劳、食欲不振、腹水、食管静脉曲张、出血、肝性脑病，昏迷等。酒精性肝硬 化的预后比肝炎病毒引起的肝硬化的预后更差，并且已知在欧洲和美国，最终由肝脏疾病 引起的50%的死亡病例是由于酒精造成的。
[0004] 因此，为了减少酒精性肝脏疾病引起的死亡率，应恰当治疗处于酒精性肝脏疾病 的初始阶段的酒精性脂肪肝。然而，到目前为止，尚未研发出恰当的方法以治疗上述疾病。
[0005] 同时，微藻是通常分布在淡水和海水中的浮游生物，例如，蓝绿藻、硅藻、沟鞭藻、 绿藻、红藻、隐鞭藻（cryptomonadaceae)和隐藻（cryptomonads)，据估计，存在超过200000 种的微藻，其中约35000种遍及全世界。微藻能像普通植物一样进行光合作用并且在其中 合成糖类和蛋白质，负责淡水和海水的初级生产，并作为食物链的生产者起重要作用。
[0006] 小球藻是一种球形的单细胞植物，直径约8 μ m，属于绿藻属，比如绿紫菜。由于小 球藻是无性繁殖，而当光合作用增加细胞材料时，小球藻形成子细胞，因此其繁殖比有性繁 殖更有效。此外，小球藻通过光合作用制造有机物，并且在光合作用期间具有高利用率和高 蛋白质含量。
[0007] 然而，尚未披露小球藻提取物作为药物在肝脏疾病上的临床效果。
[0008] 因此，本发明人鉴定小球藻提取物改善肝损伤指数以完成本发明。


【发明内容】

[0009] 因此，本发明的目的是提供一种含有小球藻提取物的、用于预防或治疗肝脏疾病 的组合物。
[0010] 在本发明的一个方面，提供一种含有小球藻提取物作为活性成分的、用于预防或 治疗肝脏疾病的药物组合物。
[0011] 在本发明的另一方面，提供一种含有小球藻提取物作为活性成分的、用于预防或 改善肝脏疾病的保健功能性食品。

【专利附图】

【附图说明】
[0012] 结合附图，通过展示但不限制本发明的示例性实施例，详细描述本发明的上述和 其它特征。
[0013] 图1为小球藻乙醇提取物和叶绿素 a在TLC上的分离和纯化结果（A :小球藻乙醇 提取物，B :B十绿素 a); 图2为醌还原酶活性馏分和叶绿素 a在TLC上的分离和纯化结果（A :醌还原酶活性馏 分，B :叶绿素 b，C :叶绿素 a); 图3展示了醌还原酶活性馏分（CH1)和叶绿素 a在可视光区域（400?800nm)的最大 吸收波长的图； 图4为叶绿素 a和小球藻乙醇提取物在HPLC上的分离结果； 图5为在HPLC上检测到的叶绿素 a根据其浓度的标准曲线； 图6为肝损伤诱导的动物模型的血液中的ALT(U/L)浓度的结果； 图7为肝损伤诱导的动物模型的血液中的AST (U/L)浓度的结果； 图8为肝损伤诱导的动物模型的血液中的y-GT(U/L)浓度的结果； 图9为肝损伤诱导的动物模型的血液中的LDH(U/L)浓度的结果； 图10为肝损伤诱导的动物模型的肝胞液中的S0D活性浓度的结果； 图11为肝损伤诱导的动物模型的肝胞液中的CAT活性浓度的结果； 图12为肝损伤诱导的动物模型的肝胞液中的GPx活性浓度的结果； 图13为肝损伤诱导的动物模型的肝胞液中的ADH活性浓度的结果； 图14为肝损伤诱导的动物模型的肝胞液中的ALDH活性浓度的结果； 图15为肝损伤诱导的动物模型的肝的组织学分析结果（Sul :萝卜硫素）；以及 图16为肝脏解毒酶及抗氧化酶NQ0-1、H0-1、GT和GSTP的基因表达结果。

【具体实施方式】
[0014] 下文更详细地描述了本发明的优选实施例，以使本领域技术人员能实施并使用本 发明。
[0015] 本发明试剂包括含有小球藻提取物作为活性成分的、用于预防或治疗肝脏疾病的 组合物。更具体地，本发明涉及含有小球藻提取物的、用于预防或治疗肝脏疾病的药物组合 物。
[0016] 本发明的小球藻可以是浓缩的淡水小球藻，并且浓缩的淡水小球藻粉末可以用有 机溶剂提取以获得小球藻提取物。更具体地，该提取物可以为Cp 4醇、乙酸乙酯或己烷的 提取物，并且具体地，该提取物可以为乙醇提取物。
[0017] 根据本发明的组合物诱导醌还原酶的活性，因此，该组合物可以展示出肝功能改 善效果。
[0018] 肝脏疾病可包括脂肪肝，肝炎和肝硬化。在根据本发明的一个实施例中，由于因肝 损伤而增高的肝损伤指标（ALT、AST、Y-GT和LDH)得到改善，所以可以通过该组合物抑制 肝功能损伤。
[0019] 小球藻提取物可以含有叶绿素 a，并且叶绿素 a可具有预防或治疗肝脏疾病的效 果。
[0020] 在用于预防或治疗肝脏疾病的本发明的药物组合物中，基于总组合物，可以使用 的小球藻提取物的浓度为0. Olmg至10g。
[0021] 然而，上述组成并不是限制性的，并且取决于患者的健康状况，以及疾病的种类和 严重程度，该组成是可改变的。
[0022] 含有本发明的提取物的组合物可进一步包括常用于制备药物组合物的适当的载 体、赋形剂或稀释剂。
[0023] 的组合物可以制备成口服药物比如粉末、颗粒、片剂、胶囊、悬浮液、乳液、糖浆和 气溶胶；外用药、或栓剂或无菌注射液。可以包括在含有本发明提取物的组合物中的载体、 赋形剂和稀释剂可以包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖 醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚 乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁或矿物油。当制备成 药物时，可以添加稀释剂或赋形剂如常用的填充剂、膨胀剂、配合剂、保湿剂、崩解剂或表面 活性剂。口服固体产品包括片剂、丸剂、粉末、颗粒、胶囊，及其它。固体产品可以通过将提 取物与至少一中或多种赋形剂比如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶混合而制备。不仅可以 使用简单的赋形剂而且可以使用润滑剂如硬脂酸镁滑石粉。对于口服液产品、悬浮液、经 口液体的制备，可以使用乳液或糖浆，但也可以使用常用的简单的稀释剂，如水和液体石蜡 以及各种赋形剂如保湿剂、甜味剂、添味剂或防腐剂。非口服产品可包括无菌水悬浮液、非 水溶剂、悬浮液、乳液、冻干产品或栓剂。对于非水溶剂和悬浮液，可使用丙二醇、聚乙二 醇、植物油如橄榄油、或可注射酯如油酸乙酯。对于栓剂基质，可以使用半合成脂肪酸酯 (witepsol)、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂酸酯（laurin fat)、甘油明胶或其它。
[0024] 本发明的提取物的服用剂量可根据患者的健康状况和体重、疾病的严重程度，剂 型，给药途径和时期而改变，但该剂量可以由本领域技术人员适当选择。然而，为了获得理 想的效果，本发明的提取物能以单次或多次剂量，数量为每天〇. 〇lmg/kg至10g/Kg，优选 lmg/kg至lg/kg，给药。因此，没有上述剂量并不限制本发明的范围。
[0025] 本发明的组合物通过各种途径向哺乳动物，如大鼠、小鼠、家畜或人给药。例如，可 以经口、经直肠、或静脉（IV)、肌肉（頂)、皮下、子宫硬膜或脑室注射给药。
[0026] 此外，本发明涉及一种含有小球藻提取物作为活性成分的、用于预防或改善肝脏 疾病的保健功能性食品。
[0027] 该小球藻提取物可以包括叶绿素 a，并且叶绿素 a在预防和改善肝脏疾病中具有 积极的效果。
[0028] 此外，本发明涉及一种含有小球藻提取物作为活性成分的、用于预防或改善肝脏 疾病的食品或食品添加剂。
[0029] 含有本发明的提取物的组合物可以用于预防或改善肝脏疾病的各种形式的药物、 食品，和饮料中。本发明的提取物可以添加至各种食品中，比如糖果、饮料、口香糖、茶、复合 维生素、以及健康辅食，并且可以以粉末、颗粒、片剂、胶囊，或饮料的形式使用。
[0030] 因为本发明的提取物几乎没有毒性或不良影响，所有其可以安全地长期用于预防 的目的。
[0031] 本发明的提取物可以添加至用于预防或改善肝脏疾病的各种食品或饮料中。此 时，食物或饮料中的提取物的量一般占总食品重量的0. 01至15重量％。对于保健饮料组 合物，可以在l〇〇ml中添加0. 02至10g，优选0. 3至lg的提取物。
[0032] 对于保健饮料组合物，只有提取物是具有规定比例的基本成分，并且在液体成分 上无特殊限制。如普通饮料一样，可以添加各种香料和天然碳水化合物。上述的天然碳水 化合物的例子是单糖、二糖如葡萄糖和果糖，多糖如麦芽糖和蔗糖，普通的糖如糊精和环糊 精，以及糖醇如木糖醇、山梨醇，和赤藓醇。除了上面提到的香料之外，可以使用天然香料 (索马甜、甜叶菊提取物（即，莱鲍迪甙A，甘草甜素））和合成香料（S卩，糖、阿斯巴甜）。对 于上述天然碳水化合物组合物，通常每l〇〇ml可以使用约1至20g，优选5至12g的本发明 组合物。
[0033] 除上述之外，本发明的组合物可含有多种养分、维生素、矿物质（电解质）、合成和 天然调味剂、着色剂、补充剂（如奶酪，巧克力）、果胶酸和果冻酸盐、褐藻酸和褐藻酸盐、有 机酸、保护胶体增稠齐?、ph调节齐?、稳定齐?、防腐齐?、甘油、乙醇、用于碳酸饮料的碳酸化物， 及其它。此外，本发明的组合物可以含有果肉以生产天然果汁、果汁饮料、和植物饮料。这 些成分可以单独使用或组合使用。这些添加剂的比例不是重要的，但一般可以按重量比在 每100份中使用0至20份的本发明组合物。
[0034] 下文，通过更详细的实施例和实验解释本发明。以下的实施例为了进一步描述本 发明，并且不以任何方式限制本发明的范围。本发明的实施例仅提供给本领域普通技术人 员作为说明的目的。 实施例
[0035] 实施例1 :浓缩的淡水小球藻的乙醇提取物 将500Μ199. 9%乙醇（Daejeong，韩国）加入100g浓缩的粉末状淡水小球藻中，并在黑 暗条件下搅拌。接着，每12小时将得到的混合物提取两次，并降低压力浓缩，以获得乙醇提 取物。然后，用定量的浓缩的乙醇提取物测量醌还原酶的活性。
[0036] 实施例2 :利用薄层色谱法从小球藻分离及纯化用于预防和治疗肝脏疾病的材料 利用薄层色谱法（TLC)鉴定馏分的成分。在TLC上分离小球藻乙醇提取物。TLC可以将有机 溶剂提取物分馏成非极性或极性材料，并利用洗脱剂（己烷：乙酸乙酯：丙酮=7 :3 :0. 1) 分离小球藻乙醇提取物和叶绿素 a(图1)。叶绿素3的^值为0.8。测量所述分离出的小 球藻乙醇提取物馏分的醌还原酶活性，并且结果列于表2。结果，小球藻乙醇提取物馏分中 Rf值为〇. 8的馏分显示出最高的活性。以相同的条件在TLC上分离出最活跃的小球藻乙醇 提取物馏分，结果，分离出与叶绿素 a(CHl和CH2)具有相同的&值的馏分。测量每个馏分 的活性，并且结果如表3所示。在可见光区域（400?800nm)检测CH1馏分和叶绿素 a的吸 光度，结果，这两种材料的最大吸收波长为660nm(图3)。另外，在HPLC上分离小球藻乙醇 提取物和叶绿素 a，并比较结果。利用洗脱溶剂A溶液（75:25(V/V)甲醇/水）在C18 0DS 柱（4.6 X 250mm，5 μ m)以1.0M1/分钟的流速持续30分钟，50%浓度梯度，进行分析。检测 波长为660nm。结果，在小球藻乙醇提取物中鉴定出与叶绿素 a相同的馏分（图4)。此外， 根据浓度在HPLC上检测作为标准材料的叶绿素 a，结果如图5所示。小球藻乙醇提取物中 叶绿素 a的含量的计算结果是lg提取物中叶绿素 a的含量为10. 0±2.0%。这意味着lg 干燥的小球藻中叶绿素 a的含量为1. 5±2. 0%，并且用于预防或治疗肝脏疾病的本发明的 材料估计是以叶绿素 a为基础的材料。
[0037] 实施例3 :提取物的醌还原酶活性 对分离出的馏分中的乙醇提取物和成分，分析醌还原酶活性的诱导。为了测量从小球 藻中获得的馏分的醌还原酶活性的诱导作用，使用白色大鼠的肝癌细胞系（HepalclC7)进 行实验。
[0038] 首先，a-MEM(极限必需培养基）/10% FBS (胎牛血清）溶液与肝细胞培养液混合 以使细胞数目为IX 1〇5个细胞/Ml,并且将100 μ 1得到的溶液加入到96孔板中，然后在 5%0)2和371：的条件下，培养24小时。细胞稳定后，按照从3. 125至200yg/Ml以两倍增 长的7种不同的浓度加入来自小球藻的提取物的化合物和从提取物中获得的馏分，然后在 5% C02和37°C的条件下，培养24小时。完成培养后，用PBS (磷酸盐缓冲盐水）溶液洗涤 细胞，用80 μ 1含有0. 08%毛地黄皂苷和2mM EDTA的溶液裂解细胞膜以获得蛋白质溶液。
[0039] 50μ 1蛋白质溶液与200μ 1反应溶液A(49M1 25mM Tris缓冲液，34 mg BSA， 0. 34M11. 5 %吐温-20溶液，0. 34M1辅酶溶液，100个单位葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，15 mg MTT，50 μ 150mM甲萘醌）混合在一起，并用酶标仪测量610nm的吸光度增加率。用Bradford 溶液测量在595nm的蛋白量。在反应溶液A中，辅酶溶液由150mM葡萄糖-6-磷酸，4. 5mM NADP和0· 75mM FAD组成，并且MTT为3- (4, 5-二甲基噻唑-2-基）-2, 5-二苯基四唑溴的 缩写。该提取物和馏分的醌还原酶活性用CD来表示（该CD即样品的浓度，其中，被该样品 处理过的细胞的醌还原酶活性变成两倍）。表1展示了乙醇提取物的醌还原酶活性。 表1

【权利要求】
1. 一种含有小球藻提取物作为活性成分的、用于预防或治疗肝脏疾病的药物组合物。
2. 根据权利要求1所述的用于预防或治疗肝脏疾病的药物组合物，其特征在于，所述 提取物为Cr4醇、乙酸乙酯或己烷的提取物。
3. 根据权利要求1所述的用于预防或治疗肝脏疾病的药物组合物，其特征在于，所述 组合物诱导醌还原酶活性。
4. 根据权利要求1所述的用于预防或治疗肝脏疾病的药物组合物，其特征在于，在总 组合物中所述小球藻提取物的量为〇. Olmg至10g。
5. -种含有叶绿素 a的、用于预防或治疗肝脏疾病的药物组合物。
6. -种含有小球藻提取物作为活性成分的、用于预防或改善肝脏疾病的保健功能性食 品。
7. 根据权利要求6所述的用于预防或改善肝脏疾病的保健功能性食品，其特征在于， 所述保健功能性食品为粉末、颗粒、片剂、胶囊或饮料类。
8. -种含有叶绿素 a的、用于预防或改善肝脏疾病的保健功能性食品。
【文档编号】A61K9/16GK104093411SQ201180074500
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2011年11月25日 优先权日:2011年10月28日
【发明者】卞熙国, 钱重均, 金世权, 李廷权 申请人:江陵原州大学校产学协力团