专利名称：一种提取异养小球藻中性油脂的方法
技术领域：
本发明属于可再生能源领域，特别涉及一种提取异养小球藻中性油脂的方法。具体说是将未经过干燥脱水的小球藻通过球磨机的机械破碎和超声波的辅助传质作用，在弱极性有机溶剂的浸润中，破碎小球藻细胞壁，提取其中的油脂成分，最后经过中性有机溶剂的萃取精炼，得到的中性油脂，然后经转酯化反应可以用于制备生物柴油。
背景技术：
面对世界范围内石化燃料的逐步枯竭，寻找可再生的新一代能源正在成为全世界关注的重点。其中，微藻生物柴油被看作是最有竞争力的能够彻底替代石化燃料并且不影响粮食和其他农产品生产的可再生液体生物燃料。与众多能源植物相比，利用微藻生产液体生物燃料，具备大量吸收二氧化碳，缓解全球的温室效应，生物油脂产量高，培养过程不占用耕地等诸多优点，但目前却没有成功的大规模产业化的范例，市场上也未见藻类生物柴油的供给，其主要原因是产生成本问题。清华大学微藻生物能源实验室吴庆余课题组以优选的淡水绿藻Cholorella protothecoides 0710为藻种，对其进行代谢改造和培养优化，使其产生大量中性油脂， 用以制备生物柴油，该发明已发表多篇论文(l)Xu，H.，Miao, X.L，ffu, Q. Y. (2006)High quality biodiesel production from a microalga Chlorella protothecoides by heterotrophic growth in fermenters. Journal of Biotechnology,126 (4),499-507. (2) Xiong, W. , Li, X. , Xiang, J. , ffu, Q. Y. (2008)High-density fermentation of microalga Chlorella protothecoides in bioreactor for microbio—diesel production. Applied Microbiology and Biotechnology,78(1),29-36. (3)Xiong, W. ,Gao, C. F. ,Yan,D., ffu, C., ffu, Q. Y. (2010)Double C02 fixation in photosynthesis-fermentation model enhances algal lipid synthesis for biodiesel production. Bioresource Technology,101(7), 2287-2293.已申请专利CN101230364A “一种利用异养小球藻高密度发酵生产生物柴油的方法”CN101280328 “一种从自养到异养两步培养小球藻生产生物柴油的方法”。为了降低小球藻生物柴油的总体生产成本，本课题组从生产的各个环节入手，进行工艺改进和优化。目前限制微藻生物柴油的低成本生产的瓶颈之一，是缺乏经济高效规模化提取藻细胞油脂的方法。小球藻呈圆球形，细胞直径在2 μ m左右，其细胞壁较普通微生物的细胞壁厚，整个细胞结构非常稳定和坚固，对破壁技术要求较高，加之小球藻为水生物种，水的存在也不利用中性油脂的提取。小球藻油脂的提油方法主要有干藻提油法和湿藻提油法。将收获回来的湿藻先经过干燥处理，脱去水分。在干燥之后，用亲脂溶剂萃取浓缩的生物质物质从而得到藻油。因此，提油技术的改进，对提高能量利用率，降低生产成本， 至关重要。由于干燥小球藻的过程能耗很高，且需要较长时间，所以出现了利用湿藻来提取其中油脂的方法，即湿藻提取法。需要指出的是，这里所说的湿藻是指经过初步的沉降和离心处理，但是没有经过热烘干的藻，含水量大约为61. 9士3.1% (水分重量/总重量)。目前，在微藻能源领域内，没有可以用于工业化生产的湿藻油脂提取方法。本发明提供了一种大量提取小球藻油脂的方法，缩短了生产周期，简化了工艺流程，能够满足工业化应用的要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提取异养小球藻中性油脂的方法，其特征在于，利用球磨机的机械剪切力和超声波的辅助传质，借助弱极性有机溶剂的浸润，破碎干燥小球藻 (干藻粉)细胞壁和未干燥脱水的小球藻(湿藻)细胞壁，使细胞中的油脂释放到有机溶剂中，之后回收有机溶剂，蒸馏精制后得到中性油脂，用以制备生物柴油。以异养发酵培养的大量高油脂含量的小球藻为操作对象，具体步骤如下(1)离心收获异养小球藻细胞；(2)在弱极性有机溶剂中对异养小球藻细胞进行球磨；(3)分离磨介球；(4)在弱极性有机溶剂中超声波破碎异养小球藻细胞壁；(5)离心去除细胞碎片；(6)蒸发去除研磨溶剂；(7)加入抽提溶剂精炼。所述离心收获异养小球藻细胞是对含有小球藻细胞的培养基进行离心，其异养小球藻细胞来自于异养高密度发酵的C. rotothecoides0710藻株，其质量比含油量为 20% -61%之间，其细胞干重为15-108g/L之间；所述进行离心的离心力RCF = 6000g, 4分钟；除去多余液体，使湿藻细胞生物质的含水量介于60% -70% (藻细胞干燥至恒重的重量藻细胞干燥前的重量)；其中湿藻含水量测定方法如下取少量湿藻，测量重量 ml, -50°C冷冻干燥48小时直到恒重，得到干燥的藻粉，测定重量m2，最终得到湿藻的含水量。其含水量ω计算公式m = ml~m2 X 100%
ml经过多次实验测定，绝大多数大容量工业化离心机都能够对液体发酵培养的小球藻进行初步脱水，除去大部分的液体培养基，得到的湿藻质量比含水量约为61. 9士3. 1%, 然后采用但不限于冷冻真空干燥和热烘干干燥藻细胞至恒量，对湿藻进一步干燥脱水，得到质量比含水量小于的干藻粉。所述异养小球藻细胞球磨，将藻粉、研磨溶剂和磨介球放入尼龙球磨罐中，按藻粉 (g)研磨溶剂(ml)磨介球(g)球磨罐容积(ml) = 30 30 (200-400) 500混合，在行星式球磨机上以100rpm-200rpm速度常温球磨；其中，尼龙材质球磨罐为可密封的，研磨溶剂均为分析纯的乙醇、异丙醇或正己烷；磨介球为直径5mm-10mm的氧化锆球；在异养小球藻细胞球磨处理时处理干藻细胞优选球磨2小时，处理湿藻时优选球磨12小时。所述用于洗脱的溶剂均选用分析纯的氯仿、异丙醇和正己烷，研磨溶剂量洗脱溶剂量按体积比选1 10;洗脱时用2mm孔径的筛网过滤分离磨介球。所述超声波破碎藻/溶剂混合物，将球磨罐中的破碎藻细胞和异丙醇混合物按以下条件进行超声功率600W，频率20KHz，工作时间3秒，休息时间3秒，超声总时间40分钟。所述离心去除细胞碎片，选离心力RCF = 6000g，4分钟，使细胞碎片全部沉淀，将上层萃取有小球藻油脂溶剂保留。所述蒸发去除研磨溶剂，65°C减压蒸馏，完全蒸发并回收异丙醇，最后得到粗制小球藻中性油脂。
所述加入抽提溶剂精炼，加入正己烷抽提油脂(抽提溶剂量ml 研磨溶剂量ml =1 1)。静置直到多糖、蛋白质等不溶物完全析出。分液后取上层抽提溶剂，60°C蒸发正己烷后得到粗制的小球藻中性油脂。
本发明的有意效果是它是在本实验室已有的研究成果和专利技术基础上，为满足工业化生产小球藻油脂的应用要求而开发的细胞破碎和油脂提取的方法。本方法利用了工业上经常使用的球磨机和超声波细胞破碎仪，在弱极性溶剂中快速提取小球藻油脂，同时适用于干燥和湿润的两类细胞，提取效率分别达到了 99. 27%和89. 61% (以索式油脂提取法提取到的油脂量为小球藻中性油脂标准含量)。同时用此方法得到的粗制中性油脂，99% 以上的成分可以转化为生物柴油。设备和工艺具备放大的可行性，可以满足工业化应用要求，是一条经济、高效提取藻类油脂的途径。
图1不同研磨溶剂，对中性油脂提取率的影响
图2不同洗涤溶剂，对中性油脂提取率的影响
图3电子扫描显微镜下观察到的细胞破碎情况，其中，A、C是未进行球磨的小球藻细胞，B、D是提取油脂后的小球藻细胞碎片；A、B是2000倍放大，C、D是15000倍放大。
具体实施方式
本发明提供了一种提取异养小球藻中性油脂的方法，利用球磨机的机械剪切力和超声波的辅助传质，借助弱极性有机溶剂的浸润，破碎小球藻细胞壁，以异养发酵培养的大量高油脂含量的小球藻为操作对象，分干藻和湿藻两条路线分别进行，它是在已有的研究成果和专利技术基础上，利用球磨机的机械剪切力和超声波的辅助传质，借助弱极性有机溶剂的浸润，破碎小球藻细胞壁的工艺，能从大量高含油量的小球藻细胞中提取用于制备生物柴油的中性油脂，以满足工业化应用要求。下面举实施例对本发明予以进一步说明。
实施例1
异养小球藻选用C. protothecoides 0710 (清华大学生命科学学院微藻生物能源实验室申请的“一种利用异养小球藻高密度发酵生产生物柴油的方法CN101230364A”)，通过高密度异养发酵技术使其富含大量中性油脂。藻细胞密度高于sogr1的发酵液以离心力 6000g离心4分钟，使异养小球藻细胞充分沉淀，去除上清液，加入少量清水，震荡使细胞重悬，再以离心力6000g离心4分钟，使异养小球藻细胞充分沉淀，去除上清液，再重复一次上述操作，达到充分去除培养液、洗涤藻细胞的目的。取湿藻30.00g，-50°C冷冻干燥48小时直到恒重，得到干燥的藻粉重10. 23g，得到湿藻的含水量为65. 9wt%。
取IOg干藻粉和IOg 二氧化硅混合，放入高速粉碎机中充分研磨，进行索式油脂提取(参见国家标准NY/T 4-1982)，得到5. 089g藻油，则含油量为50. 89wt%，以此作为小球藻细胞内的中性油脂标准含量。
实施例2
将湿藻_50°C冷冻干燥48小时至恒重，得到干燥的藻粉(含水量< )。在行星式球磨机上进行干藻粉球磨将30g干藻粉、分别和30ml研磨溶剂(乙醇、异丙醇或正己烷)混合，再分别加入200g、400g (直径5mm-10mm)的氧化锆磨介球，放入容积500ml的球磨罐中，适当混勻后，安装在行星式球磨机上进行对比实验，以IOOrpm转速分别球磨0. 5、1、 2、4、6小时。加入300ml抽提溶剂(氯仿、异丙醇或正己烷)到球磨罐中，用2mm孔径的滤网过滤分离磨介球，得到藻碎片/溶剂混合物。将藻碎片/研磨溶剂混合物以6000g离心力离心4分钟，保留上层液体，65°C减压蒸馏，直至溶剂完全去除。加入30ml正己烷抽提油脂。静置直到多糖、蛋白质等不溶物完全析出。分液后取上层液体，蒸发溶剂后得到粗油。 通过对比提取率，最后优选2小时为最佳球磨时间，异丙醇为最佳研磨溶剂，200g磨介球为最适装载量，得粗油15. 161g。油脂提取率=15. 161g/(30X50. 89% ) = 99. 27%
实施例3
未经干燥处理的湿藻，球磨优化如下将30g湿藻(含水量为61. 9士3. )，分别和30ml研磨溶剂(乙醇、异丙醇或正己烷)混合，再分别加入200g、400g (直径5mm-10mm) 的磨介球到容积500ml的球磨罐中，适当混勻后，安装在行星式球磨机上进行对比实验，以 IOOrpm转速分别球磨6、12、M小时。加入300ml抽提溶剂(氯仿、异丙醇或正己烷)到球磨罐中，用2mm孔径的滤网过滤分离磨介球，得到藻碎片/溶剂混合物。将此混合物按照以下条件进行超声波破碎功率600W，频率20KHz，工作时间3秒，间隔时间3秒，总时间40分钟。随后将藻碎片/研磨溶剂混合物以6000g离心力离心4分钟，保留上层溶剂，65°C减压蒸馏，直至溶剂完全蒸发。加入30ml正己烷抽提油脂。静置直到多糖、蛋白质等不溶物完全析出。分液后取上层液体，蒸发溶剂后得到粗油。通过对比提取率，最后优选12小时为最佳球磨时间，异丙醇为最佳研磨溶剂，200g磨介球为最适装载量，得粗油4. 665g。油脂提取率=4. 665g/(30gX (1-65. 9% ) X50. 89% ) = 89. 61%
实施例4
10倍体系放大实验中处理干藻粉的具体流程如下将300g干藻粉(含水量 < 和300ml异丙醇(因球磨后温度较高，正己烷易挥发，综合考虑提取率和回收率， 优选异丙醇)混合，再加入2kg不同直径(5mm-10mm)的磨介球放入容积5L的球磨罐中， 适当混勻后，安装在行星式球磨机上进行球磨，以200rpm转速分别球磨2小时。加入3L 异丙醇到球磨罐中，用2mm孔径的滤网过滤分离磨介球，得到藻碎片/溶剂混合物。接下来按照小型优化实验的操作进行粗油的提取，最后得粗油130. lg。油脂提取率=130. Ig/ (300gX50. 89% ) = 85. 2%
实施例5
10倍体系放大实验在卧式球磨机中进行，处理湿藻的具体流程如下将300g湿藻(含水量为61.9 士 3.1%)和300ml异丙醇(因球磨后温度较高，正己烷易挥发，综合考虑提取率和回收率，优选异丙醇)混合，再加入2kg不同直径(5mm-10mm)的磨介球放入容积5L的球磨罐中，适当混勻后，安装在行星式球磨机上进行球磨，以200rpm转速分别球磨12小时。加入3L异丙醇(因超声时温度较高，正己烷易挥发，综合考虑提取率和回收率，优选异丙醇)到球磨罐中，用2mm孔径的滤网过滤分离磨介球，得到藻碎片/溶剂混合物。之后采用循环式超声波破碎仪对混合物进行超声破碎，超声条件如下功率 600W，频率20KHz，工作时间3秒，间隔时间3秒，总时间40分钟，循环流速IL分钟Λ接下来按照小型优化实验的操作进行粗油的提取，最后得粗油37. 6g。油脂提取率=37. 6g/ (300gX (1-65. 9% ) X50. 89% ) = 72. 3%
实施例6
取球磨处理前的小球藻细胞和提取油脂后的小球藻细胞碎片，分别用(ν/ν) 50%, 75%、90%和100%的乙醇进行梯度脱水，每种浓度处理1小时，最后静置使乙醇自然挥发。 将脱水后的样品置于导电胶上，喷镀一层薄金制片，放入扫描电子显微镜进行观察。观测如图2所示，其中A、C是未进行球磨的小球藻细胞，B、D是提取油脂后的小球藻细胞碎片；Α、 B是2000倍放大，C、D是15000倍放大。
实施例7
用气相色谱法分析提取的粗油中可转化为生物柴油的组份比例。先配制酯化反应液甲醇 CH3OH, 97% (ν/ν) ；^cH2SO4, 3% (ν/ν)；癸酸 CH3 (CH2) 8C00H2，反应在防爆酯化管内进行，取10 15mg精制的小球藻油脂(主要成分甘油三酯)，作为标准；取 20 30mg的待测粗油，作为分析样品，记下分组数据。分别精确加入2ml酯化液和2ml 氯仿，密封酯化管，100°c加热4小时。静置至室温，加入2ml蒸馏水后再次密封，充分震荡后静置分层，待测。用取样针取分层液下层溶剂1 μ 1，加入气相色谱(美国agilent， HP-119091Z-413HP-130m,0. 32mm, 0. 25um_60 至 325/；350)升温程序从 80°C开始，以每分钟 30°C升温到120°C，然后以每分钟20°C的速度将温度上升到300°C。注射口温度100°C。得到峰图后，各组分相对百分含量采用峰面积积分法计算，其成分如表1所示。
表1不同方法提取的细胞粗油转化为生物柴油的组成成分与含量
权利要求
1.一种提取异养小球藻中性油脂的方法，其特征在于，利用球磨机的机械剪切力和超声波的辅助传质，借助弱极性有机溶剂的浸润，破碎干燥小球藻细胞壁和湿藻细胞壁，提取其中的中性油脂；以异养发酵培养的大量高油脂含量的小球藻为操作对象，具体步骤为 ⑴离心收获异养小球藻细胞；⑵对异养小球藻细胞进行球磨破碎；⑶分离磨介球；⑷ 在弱极性有机溶剂中超声波破碎异养小球藻细胞壁；(5)离心去除细胞碎片；(6)蒸发去除研磨溶剂；(7)加入抽提溶剂精炼。
2.根据权利要求1所述提取异养小球藻中性油脂的方法，其特征在于，所述离心收获异养小球藻细胞是对含有小球藻细胞的培养基进行离心，其异养小球藻细胞来自于异养高密度发酵的Chlorella. Protothecoides 0710藻株，其含油量为20wt % -6Iwt %，其细胞干重在15-108g/L之间；所述进行离心的离心力RCF = 6000g，4分钟；除去多余液体，使藻细胞生物质质量比含水量介于60% -70%之间。
3.根据权利要求1所述提取异养小球藻中性油脂的方法，其特征在于，所述异养小球藻细胞球磨，将干藻粉、研磨溶剂和磨介球放入尼龙球磨罐中，按藻粉(g)研磨溶剂 (ml)磨介球(g)球磨罐容积(ml) = 30 30 (200-400) 500混合，在行星式球磨机上以100rpm-200rpm速度常温球磨；其中，尼龙材质球磨罐为可密封的，研磨溶剂均为分析纯的乙醇、异丙醇或正己烷；磨介球为直径5mm-10mm的氧化锆球；在对异养小球藻细胞进行球磨处理时处理干藻粉细胞优选球磨2小时，处理湿藻时优选球磨12小时。
4.根据权利要求1所述提取异养小球藻中性油脂的方法，其特征在于，所述用于洗脱的溶剂选用分析纯的氯仿、异丙醇或正己烷；研磨溶剂量洗脱溶剂量按体积比选1 10 ； 洗脱时用2mm孔径的筛网过滤分离氧化锆磨介球。
5.根据权利要求1所述提取异养小球藻中性油脂的方法，其特征在于，所述在弱极性有机溶剂中超声波破碎异养小球藻细胞壁是将球磨罐中的破碎藻细胞和异丙醇混合物按以下条件进行超声功率600W，频率20KHz，工作时间3秒，休息时间3秒，超声总时间40分钟。
6.根据权利要求1所述提取异养小球藻中性油脂的方法，其特征在于，所述离心去除细胞碎片，选离心力RCF = 6000g，4分钟，使细胞碎片全部沉淀，将上层萃取有小球藻油脂溶剂保留。
7.根据权利要求1所述提取异养小球藻中性油脂的方法，其特征在于，所述步骤(6)蒸发去除研磨溶剂为65°C减压蒸馏，完全蒸发并回收异丙醇，最后得到粗制小球藻中性油脂。
8.根据权利要求1所述提取异养小球藻中性油脂的方法，其特征在于，所述步骤(7)加入抽提溶剂精炼为加入正己烷抽提油脂，抽提溶剂量(ml)研磨溶剂量(ml)=l 1，静置直到多糖及蛋白质完全析出，分液后取上层抽提溶剂，60°C蒸发正己烷后得到粗制的小球藻中性油脂。
9.根据权利要求1所述提取异养小球藻中性油脂的方法，其特征在于，所述湿藻细胞生物质含水量=湿藻细胞干燥至恒重的重量湿藻细胞干燥前的重量。
10.根据权利要求1所述提取异养小球藻中性油脂的方法，其特征在于，所述湿藻的含水量测定为取少量湿藻，测量重量ml，-50°c冷冻干燥48小时直到恒重，得到干藻粉，测定重量m2，最终得到湿藻的含水量；其含水量ω计算公式经过多次测定，大容量离心机能够对异养发酵得到的小球藻进行初步脱水，去除绝大部分的液体培养基，得到质量比含水量61. 9士3. 1 %的湿藻细胞，然后采用冷冻真空干燥或热烘干的干藻粉细胞至恒量，使其进一步干燥脱水，得到质量比含水量小于1 %的干藻粉。
全文摘要
本发明公开了属于可再生能源领域的一种提取异养小球藻中性油脂的方法。该方法是以生物反应器中发酵培养的大量异养小球藻为原料，通过球磨机的机械破碎和超声波的辅助传质作用，在弱极性有机溶剂的浸润中，破碎干燥小球藻细胞壁和未干燥脱水的小球藻细胞壁，最后经过中性有机溶剂提炼，得到粗制小球藻中性油脂。对于完全干燥的藻细胞，中性油脂的提取率达到了99.27％，而对于含水的藻细胞，中性油脂的提取率达到了89.61％，用此方法得到的中性油脂，可以直接用以制备生物柴油，缩短了小球藻中性油脂提取的时间，具备工业化生产的潜力，为大规模生产生物柴油提供大量的原料油脂，是快速和简便的小球藻中性油脂提取途径。
文档编号C11B1/10GK102559376SQ201210030370
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月10日 优先权日2012年2月10日
发明者刘敏盛, 卢悦, 吴庆余, 戴俊彪 申请人:新奥科技发展有限公司, 清华大学