一种黑莓提取物及其在制备肝脏细胞氧化损伤抑制剂中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种黑莓提取物及其在制备肝脏细胞氧化损 伤抑制剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 自由基被认为是引起人体衰老和某些慢性疾病发生的原因之一，当人体内的自由 基产生过多或清除过慢时，就会转而攻击各种细胞器官并使之受到损伤，从而加速机体的 衰老过程并诱发各种疾病。
[0003] 肝脏是人体重要的代谢器官，并在身体里面起着去氧化，储存肝糖，分泌性蛋白质 的合成等作用。肝脏如果受到损伤，其功能将会受到抑制。
[0004] 丙稀酰胺（Acrylamide，AA)是一种潜在的具有致癌性的化学物质，是一些富含淀 粉类的食品经高温加工后产生。其被人体吸收后对健康存在潜在威胁。丙烯酰胺具有神经 毒性、生殖毒性、遗传毒性以及致癌性，国际肿瘤研宄机构（IARC)将丙烯酰胺认定为2A类 致癌物。经研宄发现，丙烯酰胺具有一定的全身损伤作用，孙凤祥等（孙凤祥，翟筱，崔群， 丙烯酰胺对染毒小鼠血清生化指标的影响[J].潍坊医学院学报，2002, 24(1) :64-65)以0， 50,100,150mg/kg剂量灌胃染毒，发现丙烯酰胺染毒小鼠的心、肝、肾、脾均受到一定程度的 损伤，同时还发现，小鼠抗氧化功能抑制，认为丙烯酰胺还具有氧化损伤作用。
[0005] 因此，研制一种对肝脏损伤有保护作用的物质，尤其是由丙烯酰胺导致的肝脏损 伤有保护作用的物质是很有必要的。
[0006] 黑莓（Blackberry)为蔷薇科（Rosaceae)悬钩子属（Rubus)衆果类果树，是重要 的第三代小果类果树。果实呈紫黑色，柔软多汁且营养丰富，富含多种氨基酸和微量元素， 还含有黄酮、多酚、花青素、超氧化物歧化酶（SOD)等抗氧化活性物质，具有提高免疫力、降 压、降血脂和抗心律失常等功能。目前，并没有针对黑莓提取物在保护肝脏细胞氧化损伤方 面的研宄。
【发明内容】
[0007] 本发明公开了一种黑莓提取物，模拟人体胃消化的方式，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶 等制备得到。本发明黑莓提取物含有人体最终吸收的有效成分，由于采用体外模拟的方式， 最大限度的保留了有效成分，其功能性具有实用性；而通过传统方法提取的黑莓产物，进入 人体后，会有部分有效物质被人体消化系统分解消化，因而功能性具有不可预测性，不能代 表进入人体后的真实情况。
[0008] 一种黑莓提取物，提取步骤如下：
[0009] 黑莓鲜果依次经胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解后，离心分离得到上清液，所述上清液经 超滤膜过滤后截留分子量大于IOkDa的成分，滤出液经真空冷冻干燥，得到所述的黑莓提 取物；
[0010] 所述黑莓提取物的主要成分：矢车菊素-3-葡萄糖苷（Cyanidin-3-glucoside)， 矢车菊素-3-木糖苷（Cyanidin-3-xyloside)，矢车菊素-3-草酸酰葡萄 糖苷（Cyanidin-3-dioxalylglucoside)，矢车菊素-3-丙二酰葡萄糖苷 (Cyanidin-3-malonylglucoside)，飞燕草素 _3_ 木糖苷（Delphinidin-3-xyloside)和矢 车菊素-3-阿拉伯糖苷（Cyanidin-3-arabinoside)，质量百分含量如下：
[0011] 矢车菊素-3-葡萄糖苷 58.3%?72.5%; 矢车菊素-3-木糖苷 丨丨.6%?丨5.8%; 矢车菊素-3-草酸酰葡萄糖苷 9.8%?14.6%; 矢车菊素-3-丙二酰葡萄糖苷 3.1 %?6.4%; 飞燕草素-3-木糖苷 2.7%?4.1 %; 矢车菊素-3-阿拉伯糖苷 0.3%?0.8%。
[0012] 作为优选，黑莓鲜果经胃蛋白酶酶解的具体步骤为：
[0013] 黑莓鲜果与水等质量混合打浆，加入HCl调节pH = 1. 5?2后得到匀浆，再加入 胃蛋白酶，37°C、200?300rpm下水浴振荡2?3h，得到混合浆液；
[0014] 进一步优选，所述HCl的浓度为5mol/L ;
[0015] 所述胃蛋白酶的加入量为6000?8000单位胃蛋白酶/20g匀浆。
[0016] 作为优选，胰蛋白酶酶解的具体步骤为：
[0017] 取经胃蛋白酶酶解得到的混合浆液，加入NaOH调节pH = 6?7,再加入胰液，然 后用NaHCO3调节pH至7. 4, 37°C，200?300rpm水浴振荡2?3h后，再经5000?8000rpm 下离心6?IOmin得到上清液。
[0018] 进一步优选，所述NaOH的浓度为lmol/L，NaHCOj^浓度为lmol/L ;
[0019] 所述胰液中胰蛋白酶的含量为4mg/mL，胆盐的含量为30?40mg/mL ;所述胰液的 加入量为6mL/18mL混合浆液。
[0020] 本发明还公开了所述黑莓提取物在制备肝脏细胞氧化损伤的抑制剂中的新用途， 拓展了黑莓的应用领域。
[0021] 进一步公开了所述的黑莓提取物在制备由丙烯酰胺诱导的肝脏细胞氧化损伤的 抑制剂中的应用。
[0022] 作为优选，所述的抑制剂中黑莓提取物的有效剂量为0. 5mg/mL。
[0023] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0024] 本发明模拟人体胃消化的方式，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶制备黑莓提取物。
[0025] 本发明首次发现了黑莓提取物能够有效抗丙烯酰胺诱导的氧化损伤，减少活性氧 的生成，是一个具有良好开发前景的化合物；
[0026] 本发明为黑莓提取物提供了新的医疗用途，拓展了一个新的应用领域。
【附图说明】
[0027] 图1为实施例1制备的黑莓提取物对丙烯酰胺诱导的HepG2细胞氧化损伤的保护 作用；
[0028] 图2为实施例1制备的黑莓提取物对丙烯酰胺诱导的HepG2细胞活性氧自由基 ROS (DCF荧光）的抑制作用；
[0029] 图3为实施例2制备的黑莓提取物对丙烯酰胺诱导的HepG2细胞线粒体膜电位 (MMP)的保护作用；
[0030] 图4为实施例2制备的黑莓提取物对丙烯酰胺诱导的H印G2细胞谷胱甘肽（GSH) 含量降低的抑制作用；
[0031] 图5为实施例3制备的黑莓提取物对丙烯酰胺诱导的HepG2细胞核损伤 (Hochest)的抑制作用。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施 例，但本发明的保护范围并不仅限于此：
[0033] 实施例1
[0034] 黑莓鲜果与水等质量混合打浆，用5M HCl将黑莓匀浆酸化至pH = 1. 5,加入胃蛋 白酶（6000单位胃蛋白酶/20g匀浆），在37°C，300rpm水浴振荡3h，模拟胃消化后，继续用 IM NaOH调pH至6,每18ml混合浆液加入6mL胰液（胰液中胰酶含量为4mg/mL，胆盐含量 为 40mg/mL)，再用 IM NaHCOjjf pH 至 7. 4,在 37°C，300rpm 水浴振荡 2h，6000rpm 条件下离 心lOmin，上清液即为黑莓粗提取物。利用Millipore Pellicon超滤系统，将上清液泵至 截留分子量为IOkDa的再生纤维素超滤膜表面，收集滤出液，真空冷冻干燥，得到黑莓提取 物。
[0035] 经液相色谱测试可知，该黑莓提取物的主要成分如下表所示：
[0036] 表 1
[0037]
[0038] 实施例2
【主权项】
1. 一种黑莓提取物，其特征在于，提取步骤如下： 黑莓鲜果依次经胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解后，离心分离得到上清液，所述上清液经超滤 膜过滤后截留分子量大于lOkDa的成分，滤出液经真空冷冻干燥，得到所述的黑莓提取物； 所述黑莓提取物的主要成分：矢车菊素-3-葡萄糖苷，矢车菊素-3-木糖苷，矢车菊 素-3-草酸酰葡萄糖苷，矢车菊素-3-丙二酰葡萄糖苷，飞燕草素-3-木糖苷和矢车菊 素-3-阿拉伯糖苷，质量百分含量如下： 矢车菊素-3-葡萄糖苷 58.3%?72.5%; 矢车菊素-3-木糖苷 11.6%?15.8%; 矢车菊素-3-草酸酰葡萄糖苷 9.8%?14.6%; 矢车菊素-3-丙二酰葡萄糖苷 3.1%?6.4%; 飞燕草素-3-木糖苷 2.7%?4.1%; 矢车菊素-3-阿拉伯糖苷 0.3%?0.8%。
2. 根据权利要求1所述的黑莓提取物，其特征在于，黑莓鲜果经胃蛋白酶酶解的具体 步骤为： 黑莓鲜果与水等质量混合打浆，加入HC1调节pH= 1. 5?2后得到匀浆，再加入胃蛋 白酶，37°C、200?300rpm下水浴振荡2?3h，得到混合浆液。
3. 根据权利要求2所述的黑莓提取物，其特征在于，所述HC1的浓度为5mol/L; 所述胃蛋白酶的加入量为6000?8000单位胃蛋白酶/20g匀浆。
4. 根据权利要求1所述的黑莓提取物，其特征在于，胰蛋白酶酶解的具体步骤为： 取经胃蛋白酶酶解得到的混合浆液，加入NaOH调节pH= 6?7,再加入胰液，然后用 NaHC03调节pH至7. 4, 37°C，200?300rpm水浴振荡2?3h后，再经5000?8000rpm下离 心6?lOmin得到上清液。
5. 根据权利要求4所述的黑莓提取物，其特征在于，所述NaOH的浓度为lmol/L，NaHCO3 的浓度为lm〇l/L〇
6. 根据权利要求4所述的黑莓提取物，其特征在于，所述胰液中胰蛋白酶的含量为 4mg/mL，胆盐的含量为30?40mg/mL; 所述胰液的加入量为6mL/18mL混合浆液。
7. -种根据权利要求1所述的黑莓提取物在制备肝脏细胞氧化损伤的抑制剂中的应 用。
8. -种根据权利要求1所述的黑莓提取物在制备由丙烯酰胺诱导的肝脏细胞氧化损 伤的抑制剂中的应用。
9. 根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述的抑制剂中黑莓提取物的有效剂 量为 0. 5mg/mL。
【专利摘要】本发明公开了一种黑莓提取物，按质量百分含量计，该黑莓提取物的组成为：矢车菊素-3-葡萄糖苷58.3％～72.5％；矢车菊素-3-木糖苷11.6％～15.8％；矢车菊素-3-草酸酰葡萄糖苷9.8％～14.6％；矢车菊素-3-丙二酰葡萄糖苷3.1％～6.4％；飞燕草素-3-木糖2.7％～4.1％和矢车菊素-3-阿拉伯糖苷0.3％～0.8％。提取步骤为：黑莓鲜果依次经胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解后，离心分离得到上清液，所述上清液经超滤膜过滤后截留分子量大于10kDa的成分，滤出液经真空冷冻干燥，得到所述的黑莓提取物。本发明还公开了该黑莓提取物在制备肝脏细胞氧化损伤的抑制剂中的应用。
【IPC分类】A61K31-7048, A61K36-73, A61P1-16
【公开号】CN104606306
【申请号】CN201510018395
【发明人】陈卫, 鲍涛, 郑晓冬
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年1月14日