专利名称：：一种抗肺癌a549细胞增殖的中药提取物及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及中药
技术领域：
，具体的说是涉及一种抗肺癌A549细胞增殖的中药提取物及制备方法。
背景技术：
：肺癌(lungcancer)原发于支气管黏膜和肺泡上皮细胞，是当今全球常见恶性肿瘤之一，近年来已居恶性肿瘤之首，特别是随着人口老龄化，城市人口比例逐年升高，城镇工业生产迅速发展，环境污染进一步恶化，吸烟等不良习惯相当普遍等原因，其发病率在我国呈上升趋势[1'2]。据世界卫生组织(WHO)预测，到2025年，我国每年新增的肺癌病死例数将超过100万，患病人数将居世界之首[3]。治疗包括肺癌在内的肿瘤一直是临床医学研究和新药开发的热点，但是传统的放化疗由于缺乏特异性，取得疗效的同时往往给患者带来较大的毒副反应，而中药(包括单味药和中药复方)在这方面已崭露头角，并迅速发挥重要作用，具有广阔的开发前景。
发明内容针对肺癌高发病率及西医西药治疗局限性的现状，本发明目的在于提供一种抑制肺癌A549细胞增殖的中药提取物及制备方法。本发明的目的是通过一下的技术方案来实现的1.处方一种抗肺癌A549细胞增殖的中药提取物，其特征在于该提取物由下列重量配比的原料药所制成猫爪草515g、金荞麦515g、鱼腥草515g、仙鹤草515g、冬瓜子5~15g、山茨菇10~20g、苏木10~20g、红花10~20g、法半夏10~20g、胆南星5~15g、沙参5~15g、玉竹515g、麦冬515g。上述中药提取物的制备方法，其特征在于其方法步骤如下-1)将处方药13味加水煎煮，过滤收集提取液，把提取液浓縮得提取液I;2)取提取液I精制取上述提取液I用石油醚萃取，得精制提取液II:3)精制的提取液n纯化将精制提取液n经大孔树脂柱富集，用蒸馏水洗脱至无色，用乙醇洗脱，收集洗脱液，经浓縮，即得本发明的中药提取物。上述步骤l)中加水的水量为药材量的15~110倍，煎煮0.5-1.0小时，过滤收集提取液浓縮至0.5g生药/ml。上述步骤2)中用与提取液I等量的石油醚萃取56次。上述步骤3)中用10~40%的乙醇洗脱，收集洗脱液浓縮至10g生药/ml、上述的中药提取物在制备治疗抗肺癌药物中的应用。1.1处方来源肺为娇脏，主气，司呼吸，其气宜宣宜降。肺在病理状态下常为"贮痰之器"。肺癌患者的临床主要表现为咳嗽、咯痰，痰多或少，痰色或白或黄或灰黑，痰质或清稀如水、或粘稠浊腻，或痰中夹血，气急，胸闷，胸痛。西医学诊断通过CT、MRI、支气管镜、脱落细胞检查等发现肺部实质性占位病变及恶性细胞。周仲瑛教授为中国著名中医，博士生导师，政府津贴专家，已业医六十余年，医德高尚，技艺精湛，治愈急疑难杂症患者难计其数。近年来，随着肿瘤发病率的增高，肺癌患者急骤增多。周老师结合肺的生理病理特点，经过数十年的临床观察与治疗，认为肺癌的关键癌毒因素在于痰浊、瘀血、气逆；肺之气阴两虚是肺癌发生、复发，转移的关键。因此确立治则为祛邪治标实，固本培正虚。治法重在化痰泄浊，活血祛瘀、行气降逆以及益气养阴。根据病患病期之不同，病理因素的重点而随证治疗。多选用冬瓜子、法夏、胆南星(燥湿化痰)；山茨菇、猫爪草、金荞麦、鱼腥草(软坚散结)，仙鹤草、苏木、红花(活血化瘀)；沙参、玉竹、麦冬(益气养阴)等药物。该抗肺癌有效经验方又名周氏克金岩方(下简称克金岩方)，通过大量临床研究，肺癌的中医治疗在改善患者临床症状，防止复发，稳定瘤体，提高生活质量等方面均有良好的作用，成为肿瘤综合治疗手段中必不可少的组成部分。1.2.药效学研究1.2.1处方提取物制备将上述处方13味药材加10—15倍量水提取0.5—1小时，共3次，合并滤液，减压浓縮至0.5g生药/ml为全方提取物I。1.2.2细胞来源人肺癌A549细胞由南京大学生命科学院惠赠。1.2.3A549细胞的增殖抑制作用取对数生长期A549细胞，消化、重悬，调节细胞浓度为5xl0MVmL，接种至96孔培养板，每孔0.2mL，继续培养24小时后，每6孔为一组，吸弃细胞培养液，每组添加由细胞培养液配制成提取物I，每孔0.2mL，另有6孔对照组，每孔加入0.2mL细胞培养液。分别于培养24小时后，吸弃培养液，每孔添加新细胞培养液0.2mL，并加入20nL5mg/mL的MTT(用PBS配制)，继续培养4小时后，吸弃培养液，每孔加入0.15mLDMSO，振摇30min，充分溶解细胞内生成的紫色甲臜结晶，于490nm下测定每孔吸光度(OD值)。结果见表l。提取物I可显著抑制A549细胞的增殖作用。表lMTT法检测提取物I对A549细胞的增殖抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注与对照组比较，*:p<0.05,**:p<0.012.部位提取物2.1部位提取物制备提取物I用等量石油醚萃取5—6次，水层为精制提取物II。提取物II经大孔树脂富集，水洗无色后，收集10%—40%乙醇洗脱液，浓缩为提取物III(10g生药/ml)。2.2药效实验2.2.1A549细胞的增殖抑制作用方法同上。结果见表2，不同浓度提取物III对A549细胞增殖有不同程度的抑制作用。表2MTT法检测提取物III对A549细胞的增殖抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注:与对照组比较，*:/<0.05,2.2.2A549克隆形成实验克隆形成实验6孔板，每孔200个细胞，待细胞贴壁后加含药DMED，浓度分别为表中所示，继续培养6-10d，至对照组形成30-50个细胞/克隆时结束实验。Giemsa染色15min，PBS洗1次，镜检，计算克隆数。结果见表3，不同浓度提取物III有显著的克隆形成抑制作用，并有量效关系。表3提取物III对A549细胞克隆形成实验<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注与对照组比较，*:p<0.05，**:p<0.012.2.3流式细胞检测以5xl()S个/ml的密度接种A549细胞于6孔板中，每孔2.5ml。待细胞贴壁后换不含血清的培养液饥饿24h，再分别用含有终浓度为100、10、l叱/ml提取物m的培养液继续培养，继续培养72h收集细胞，PBS洗2次，调整细胞密度为lxl(^个/ml，PI染液避光染色30min，400目尼龙网过滤，采用流式细胞仪进行检测，分析细胞周期各时相分布百分比。结果见表4，提取物III具有显著促进A549细胞凋亡的作用。表4流式细胞检测不同浓度提取物III对A549细胞周期的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*:与对照组相比，；K0.05;**:与对照组相比，"O.Ol本发明提供的一种抗肺癌的中药提取物。由处方药猫爪草5—15g、金荞麦5—15g、鱼腥草5—15g、仙鹤草5—15g、冬瓜子5—15g、山茨菇10—20g、苏木10—20g、红花10—20g、法半夏10—20g、胆南星5—15g、沙参5—15g、玉竹5—15g、麦冬5—15g提取得到。该处方药是由我国名中医周仲瑛教授积数十年的临床观察和治疗的经验方，又名周氏克金岩方，经药效学试验结果表明，该处方药提取物对肺癌A549细胞的增殖有显著的抑制作用。具体实施例方式实施例1:抗肺癌A549细胞增殖的中药提取物及其制备方法(一)处方冬瓜子10g、法半夏12g、胆南星10g、山茨菇12g、猫爪草10g、金荞麦10g、鱼腥草10g，仙鹤草15g、苏木12份g、红花15g、沙参10g、玉竹10g、麦冬10g。(二)制法1、处方提取物制备取冬瓜子10g、法半夏12g、胆南星10g、山茨菇12g、猫爪草10g、金荞麦10g、鱼腥草10g，仙鹤草15g、苏木12份g、红花15g、沙参10g、玉竹10g、麦冬10g，加15倍量水煎煮0.5小时，过滤收集提取液，浓縮得全方提取物I(0.5g生药/ml)。2、处方提取物精制取全方提取液I用等量石油醚萃取5次，得精制提取物II。3、部位提取物制备精制提取物II经大孔树脂柱富集，蒸馏水洗脱至无色后，用40%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓縮至10g生药/ml，即得抗肺癌A549细胞增殖的中药提取物m。实施例2:抗肺癌A549细胞增殖的中药提取物及其制备方法(一)处方冬瓜子5g、法半夏20g、胆南星5g、山茨菇10g、猫爪草5g、金荞麦5g、鱼腥草5g，仙鹤草10g、苏木20g、红花10g、沙参5g、玉竹15g、麦冬15g。1、处方提取物制备-取冬瓜子5g、法半夏20g、胆南星5g、山茨菇10g、猫爪草5g、金荞麦5g、鱼腥草5g，仙鹤草10g、苏木20g、红花10g、沙参5g、玉竹15g、麦冬15g，加IO倍量水煎煮I小时，过滤收集提取液，浓缩得全方提取物I(0.5g生药/ml)。2、处方提取物精制取全方提取物I用等量石油醚萃取6次，得精制提取物II。3、部位提取物制备精制提取物II经大孔树脂柱富集，蒸馏水洗脱至无色后，用35%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至10g生药/ml，即得抗肺癌A549细胞增殖的中药提取物m。权利要求1.一种抗肺癌A549细胞增殖的中药提取物，其特征在于该提取物由下列重量配比的原料药所制成猫爪草5～15g、金荞麦5～15g、鱼腥草5～15g、仙鹤草5～15g、冬瓜子5～15g、山茨菇10～20g、苏木10～20g、红花10～20g、法半夏10～20g、胆南星5～15g、沙参5～15g、玉竹5～15g、麦冬5～15g。2.—种制备权利要求1所述中药提取物的方法，其特征在于其方法步骤如下1)将处方药13味加水煎煮，过滤收集提取液，把提取液浓縮得提取液I;2)取提取液I精制取上述提取液i用石油醚萃取，得精制提取液n;3)精制的提取液n纯化将精制提取液n经大孔树脂柱富集，用蒸馏水洗脱至无色，用乙醇洗脱，收集洗脱液，经浓縮，即得本发明的中药提取物。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤l)中加水的水量为药材量的10~15倍，煎煮0.51.0小时，过滤收集提取液浓縮至0.5g生药/ml。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤2)中用与提取液I等量的石油醚萃取56次。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤3)中用1040%的乙醇洗脱，收集洗脱液浓縮至10g生药/ml。6.如权利要求1所述的中药提取物在制备治疗抗肺癌药物中的应用。全文摘要一种抗肺癌A549细胞增殖的中药提取物，它是由原料药猫爪草、金荞麦、鱼腥草、仙鹤草、冬瓜子、山茨菇、苏木、红花、法半夏、胆南星、沙参、玉竹、麦冬按一定重量配比制成；其制法是首先将上述13味原料药加水煎煮，过滤收集提取液，浓缩得全方提取液I；然后取提取液I用石油醚萃取，得精制提取液II；最后将精制提取液II经大孔树脂柱富集、蒸馏水洗脱后，用乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩至10g生药/ml，即得中药提取物，经药效学试验结果表明该中药提取物对肺癌A549细胞的增殖有显著的抑制作用。文档编号A61P35/00GK101391042SQ200810195060公开日2009年3月25日申请日期2008年10月28日优先权日2008年10月28日发明者叶丽红,周仲瑛,怡孙,莲尹,旭张,阳美平申请人:南京中医药大学