防治肝脏损伤的细胞疫苗的制作方法

专利名称：：防治肝脏损伤的细胞疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物技术和医药领域，更具体的，本发明涉及一种防治肝脏损伤的细胞群，其制备方法、用途，以及用所述细胞群所制备的疫苗。
背景技术：
：20世纪以来，肝炎发病率的逐渐攀升成为严重威胁人类健康的疾病之一。从病因学角度来讲，肝炎主要包括病毒性肝炎，酒精性肝炎，自身免疫性肝炎等。在中国，各型肝炎患者正在呈上升趋势，每年有近40万人死于肝脏疾病。肝炎的感染者全球均有分布，从世界人口来讲，60亿人口，当中20亿曾经感染过乙型肝炎(服V)，占全球人口的三分之一，20亿感染过HBV的人中慢性HBV感染病人有3.5到4亿，占全球人口大概6%，亚洲占三分之二，中国占三分之一。如此惊人的数据报道，使得本领域研究人员必须采取有效措施控制疾病的蔓延。刀豆素A诱导的肝炎模型(ConAInducedHepatitis,CIH)是一种模拟急性爆发型肝炎的动物模型。到目前为止，很多的研究都集中于对其发病机制的探讨及寻找对CIH的治疗和预防的方法，主要集中于寻找一些药物。然而本领域目前还没有采用刀豆素A诱导的肝炎模型本身来制备疫苗的方法。
发明内容本发明的目的在于提供一种可用于防治肝脏损伤的细胞群，其制备方法、用途，以及用所述细胞群所制备的疫苗。在本发明的第一方面，提供一种细胞群，所述细胞群来源于经刀豆素A诱导的模式动物，且其中90%以上为单个核细胞，所述细胞群在注射到哺乳动物体内后，能够显著降低哺乳动物患肝损伤后体内谷丙转氨酶水平(使体内谷丙转氨酶水平降低5倍；更优选的，降低6倍；最优选的，降低8倍或8倍以上)。在本发明的另一优选例中，所述细胞群在注射到哺乳动物体内后，还能够抑制哺乳动物患肝损伤后的体内TNF-a、IFN-y或IL-4的水平、抑制哺乳动物患肝损伤后的肝脏组织MIP-la、MCP-l和IP-10的表达、或促进哺乳动物患肝损伤后的脾脏组织颗粒酶B(GranzymeB)的表达。在本发明的另一优选例中，所述的模式动物为鼠。在本发明的另一优选例中，所述的细胞群来源于经刀豆素A诱导的模式动物的脾脏或外周血。在本发明的另一优选例中，所述的细胞群通过以下方法制备获得(a)给予模式动物有效量的刀豆素A，诱导肝损伤的模式动物；(b)取出(a)制备的肝损伤模式动物的脾脏或外周血，从中分离出单个核细胞;和(c)将(b)获得的单个核细胞进行灭活，获得所述的细胞群。在本发明的另一优选例中，在步骤(a)中，刀豆素的用量为15±5mg/kg体重。在本发明的另一优选例中，在给予模式动物刀豆素A后17土3小时，取出模式动物的脾脏或外周血。在本发明的另一优选例中，在步骤(c)中，采用辐照处理进行灭活。在本发明的另一优选例中，所述辐照处理的强度为4000±300rad。在本发明的另一优选例中，所述的细胞群可用于非人哺乳动物肝损伤的预防。在本发明的另一优选例中，所述的非人哺乳动物选自啮齿类动物。在本发明的第二方面，提供所述的细胞群的用途，用于制备预防哺乳动物肝损伤的组合物。在本发明的另一优选例中，所述的细胞群用于降低体内谷丙转氨酶水平；抑制体内TNF-a、IFN-y或IL-4的水平；抑制肝脏组织MIP-1a、MCP-l和IP-10的表达；或促进脾脏组织颗粒酶B的表达。在本发明的另一优选例中，所述的肝损伤为肝炎。在本发明的另一优选例中，所述的哺乳动物包括(但不限于)小鼠、大鼠、牛、羊、狗。在本发明的第三方面，提供一种组合物，所述的组合物含有有效量的所述的细胞群(细胞群中含有如lxio、ixi(T个细胞；更优选的为lxioMxi(^个细胞；最优选的，1X106-1X1()8个细胞；如2xl()6个细胞、lxl()7个细胞)，以及与所述细胞群相容的载体。在本发明的另一优选例中，所述的组合物为疫苗。在本发明的第四方面，提供一种制备所述的细胞群的方法，所述方法包括步骤(a)给予模式动物有效量的刀豆素A，诱导肝损伤的模式动物；(b)取出(a)制备的模式动物的脾脏或外周血，从中分离出单个核细胞；和(C)将(b)获得的单个核细胞进行灭活，获得所述的细胞群。在本发明的另一优选例中，当从模式动物的脾脏分离单个核细胞时，将模式动物的脾脏置于PBS中，研磨获得细胞悬液，除去细胞悬液中的红细胞，获得单个核细胞悬液。在本发明的另一优选例中，当从模式动物的外周血分离单个核细胞时，将外周血用肝素抗凝，采用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞。在本发明的第五方面，提供一种刀豆素A诱导的肝炎模型的用途，用于制备所述的细胞群。在本发明的另一优选例中，所述的刀豆素A诱导的肝炎模型用于制备防治哺乳动物肝损伤的物质。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。图l显示了3个处理组(分别是对照组，CV组和na'iveCV组)的小鼠血浆ALT的水平，与对照组相比，***P<0.001。图2显示了3个处理组(分别是对照组，CV组和na'iveCV组)的肝脏组织切片的服E染色和TUNEL染色结果。图3A显示了分别给予低剂量(CV(L))和高剂量(CV(H))的CV后，小鼠血浆ALT水平，与对照组相比，*P<0.05，**P〈0.01;图3B显示了分别给予单次(CV-1)和2次(CV-II)CV注射后，小鼠血浆ALT水平。图4显示了CV对于血浆中TNF-a、IFN-y和IL-4的水平的影响，与对照组相比，***P〈0.001。图5显示了CV对于肝脏组织中MIP-la、MCP-1和IP-10的表达的影响。图6显示了Cv对于脾脏中GranzymeB的表达的影响。图7A显示了3个处理组(分别是对照组，PBLCV组和na'ivePBLCV组)的小鼠血浆ALT的水平；图7B显示了2个处理组(分别是对照组，PBLCV组)的肝脏组织切片的服E染色和TUNEL染色结果。具体实施例方式本发明人经过长期而广泛的研究，首次采用刀豆素A诱导的肝炎模型(ConAInducedH印atitis，CIH)制备出一种可用于防治肝损伤的细胞群(减弱的致病性淋巴细胞)，所述的细胞群可用于免疫哺乳动物(如制备成疫苗)，达到防治肝损伤的目的。并且，采用本发明的方法，无需进行免疫细胞的体外扩增，即可获得足够量的细胞疫苗。基于此完成了本发明。如本发明所用，所述的"细胞群"或"淋巴细胞群"是指从肝损伤小鼠的脾脏或外周血中分离出单个核细胞经灭活后获得可用于预防肝损伤的细胞群体。如本发明所用，所述的"细胞疫苗"或"淋巴细胞疫苗"是指从肝损伤小鼠的脾脏或外周血中分离出单个核细胞经灭活后，与与其相容的载体(如PBS等)混合后获得的可用于预防肝损伤的疫苗。本发明人致力于应用CIH疾病来源的致病性淋巴细胞经过灭活制成疫苗以研究疫苗对于肝损伤的保护作用。CIH是一种模拟急性爆发性肝炎的动物模型。通过一定剂量刀豆素A的注射，异常激活淋巴细胞，在短时间内引起血清谷丙转氨酶活性急剧增加，肝脏正常结构的破坏和大量肝实质细胞凋亡，同时淋巴细胞分泌的细胞因子TNF-ci和IFN-Y对肝脏病变过程起到了重要的作用。这种动物模型与急性爆发性肝炎有较多相似的地方，成为研究预防和治疗免疫介导的肝损伤非常有用的动物模型。根据本发明人的研究证明，自体淋巴细胞的应答与CIH的致病机理相关。研究发现在CIH和急性肝炎发生时，机体免疫系统异常活化，大量淋巴细胞扩增，迅速攻击肝脏正常组织结构和实质细胞。这些参与致病性的多种淋巴细胞可产生促炎性因子，促进肝脏组织的病理损伤，并且急性肝炎还可以反复发作慢性迁延为慢性肝炎。本发明人利用CIH动物模型，通过将发病小鼠中分离出来的致病性淋巴细胞，经体外灭活后，回输至健康小鼠，证实了本发明的细胞群(即减弱的致病性淋巴细胞)对于免疫介导的肝损伤有显著的保护作用。因此，本发明提供一种细胞群，所述细胞群来源于经刀豆素A诱导的模式动物，且其中90%以上为单个核细胞，所述细胞群在注射到哺乳动物体内后，能够显著降低哺乳动物患肝损伤后体内谷丙转氨酶水平。更特别的，所述细胞群在注射到哺乳动物体内后，还能够抑制哺乳动物患肝损伤后的TNF-a、IFN-Y或IL-4的水平；抑制哺乳动物患肝损伤后的肝脏组织MIP-la、MCP-1或IP-10的表达；或促进哺乳动物患肝损伤后的脾脏组织颗粒酶B的表达。适用于制备所述细胞群的模式动物为啮齿类动物，更优选的，所述的模式动物为鼠。作为本发明的一种方式，应用经刀豆素A诱导的模式动物的疾病起源部位(肝脏)的淋巴细胞进行灭活，作为疫苗，来防治肝损伤。作为本发明的另一种方式，应用经刀豆素A诱导的模式动物的外周血中淋巴细胞经过灭活处理，作为疫苗，来防治肝损伤。上述两种方式得到了基本相同的效果。并且，基于达到基本相同的效果，后一种方式所用细胞量比前一种方式所用细胞量明显减少(减少约2-10倍)。因此，从发病小鼠的外周血中获取致病性淋巴细胞作为疫苗来预防C]:H的发生，对于临床上应用此法预防肝炎更为方便、安全、实用。作为本发明的一种优选方式，所述的细胞群通过以下方法制备获得(a)给予模式动物有效量的刀豆素A，诱导肝损伤的模式动物；(b)取出(a)制备的肝损伤模式动物的脾脏或外周血，从中分离出单个核细胞;禾口(c)将(b)获得的单个核细胞进行灭活，获得所述的细胞群。本发明还提供了所述的细胞群的用途，用于制备预防哺乳动物肝损伤的组合物。本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如1X10、1X10^个细胞；更优选的为1X105-1X1()9个细胞；最优选的，1X106-1X1()8个细胞；如2xl()6个细胞、1"07个细胞)的所述的细胞群，以及与所述的细胞群相容的载体。更优选的，所述的组合物为疫苗。本发明的组合物可直接用于肝损伤的预防或治疗。此外，还可同时与其它治疗剂或辅剂联合使用。通常，可将本发明的细胞群配制于无毒的、惰性的和与所述的细胞群相容的介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。如本文所用，术语"含有"表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。如本文所用，术语"有效量"或"有效剂量"是指可对哺乳动物产生功能或活性的且可被哺乳动物所接受的量。如本文所用，"与所述细胞群相容的"的成分是适用于哺乳哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语"与所述细胞群相容的载体"指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂，也即属于一种药学上可接受的载体。该术语指这样一些药剂载体它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.,N.J.1991)中可找到关于与所述细胞群相容的载体的充分说明。在组合物中与所述细胞群相容的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。本发明的组合物含有安全有效量的所述的细胞群以及与所述细胞群相容的载体。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效在使用本发明的组合物时，是将安全有效量的本发明的细胞群施用于哺乳动物，其中所述的安全有效量通常每次约lxl06-lxl(T个细胞/千克体重，优选的每次约1"07-1><109个细胞/千克体重。适合的接种次数通常为1-4次，优选的为2-3次。当然，具体的接种剂量和接种次数还应考虑所施与的哺乳动物的种类、体重、年龄、健康状况等因素，这些都是本领域熟练人员既能范围内的。作为本发明的实例，经过含本发明的细胞群的疫苗预处理的小鼠，在诱导CIH后其小鼠血浆中谷丙转氨酶(ALT)的活性降低到500U/L以下(正常小鼠ALT值约为50U/L，CIH小鼠ALT平均值在5000U/L以上)，比药物(比如EGCG、LLDT-8等，这些药物约可使ALT值降至800-2000U/L)预防和治疗的效果更为有效，毒副作用更低。肝脏的病理分析也显示，在采用本发明的细胞疫苗处理后的小鼠几乎看不到明显的肝脏正常结构的破坏和肝实质细胞的凋亡，说明本发明的疫苗效果极其优异。此外，本发明人的研究证明了采用所述的疫苗处理后的小鼠，血浆中TNF-ct、IFN-y和IL-4的分泌和肝脏中淋巴细胞趋化因子的表达，与对照组相比，也显著降低。此外，本发明也显示了疫苗接种次数以及接种剂量对于预防疾病发生的影响，疫苗接种2次的效果明显优于接种1次。因此，较佳地，本发明的细胞疫苗适合的接种次数为1-4次，更佳的为2-3次。虽然本发明的疫苗经验证可用于非人哺乳动物，但是其对于非人哺乳动物极好的预防效果和实用性提示进一步的针对人的临床研究。本发明的主要优点在于(1)本发明所获得的细胞群的预防肝损伤的效果大大优于其它药物，且毒副作用低。(2)采用刀豆素A诱导的肝炎模型(CIH)来制备疫苗，制备条件简单、成本低廉，无需进行免疫细胞的体外扩增，具有获取方法简便、快速、获取量大的特点，避免了从患病的哺乳动物体内获得单个核细胞存在的种种局限(比如无法获得足够量的细胞等)。(3)采用本发明的方法，可获得大量的单个核细胞，从而用于制备成细胞疫苗，克服了本领域通常难以从致病个体获得足够量免疫细胞(如淋巴细胞)且难以获得针对性的细胞的缺陷。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1淋巴细胞疫苗的制备制备CIH模型刀豆素A(15mg/kg体重，购自Sigma公司)或PBS尾静脉注射C57BL/6小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)，以诱导CIH模型。疫苗1的制备在诱导CIH模型17小时后，取出小鼠的脾脏，置于PBS中，通过尼龙的筛网研磨脾脏获得细胞悬液，加入红细胞裂解液去除红细胞，获得单个核细胞悬液，将细胞的浓度调为5X107200yl禾卩IX107200u1，辐照4000rad后作为脾脏来源的淋巴细胞疫苗(CV)。疫苗2的制备在诱导CIH模型17小时后，取出小鼠脾脏之前，通过心脏采血的方式，获取小鼠的外周血，用肝素进行抗凝，之后采用Ficoll密度梯度离心分离单个核细胞，从分离层中获取外周血中的淋巴细胞调至浓度为2X107200ul，4000rad辐照后作为外周血来源的淋巴细胞疫苗(PBLCV)。实施例2细胞疫苗可以降低血浆中谷丙转氨酶(ALT)的水平细胞疫苗按照实施例1中所述的方法进行准备，将C57BL/6小鼠分为三组，每组四只对照组注射PBS;致病性淋巴细胞处理组注射CV;未致敏的淋巴细胞处理组注射采用如前述疫苗1的制备方法，但从未诱导CIH的小鼠脾脏中分离出来的淋巴细胞(na'iveCV)。小鼠在第0天和第7天通过尾静脉注射分别接受PBS、na'iveCV、以及CV。也即对照组的小鼠仅接受了PBS的注射；na'iveCV组的小鼠接受了来自于健康小鼠的辐照脾脏淋巴细胞(1X107细胞/小鼠)；CV组的小鼠接受来自CIH的小鼠的辐照脾脏淋巴细胞(1X107细胞/小鼠)。在第14天，所有的小鼠均给予15mg/kg体重刀豆素A的尾静脉注射。17-20小时后，取出小鼠的血浆测量ALT的水平(ALT的测量采用丙酮酸氧化酶法，参照上海伊华科技有限公司的ALT测量试剂盒的说明书)。结果显示，通过给健康小鼠预先接种细胞疫苗，与对照组和接受na'ive细胞疫苗的小鼠相比，可以显著降低CIH诱导后血浆中的ALT的水平，结果如图1，与对照相比，***P〈0.001。实施例3细胞疫苗可以减少肝脏的损伤细胞疫苗按照实施例1中所述的方法进行准备，将C57BL/6小鼠分为三组，每组四只对照组注射PBS;致病性淋巴细胞处理组注射CV;未致敏的淋巴细胞处理组注射na'iveCV。小鼠在第0天和第7天通过尾静脉注射分别接受PBS、na'iveCV、以及CV。也即对照组的小鼠仅接受了PBS的注射；na'iveCV组的小鼠接受了来自于健康小鼠的辐照脾脏淋巴细胞(1X107细胞/小鼠)；CV组的小鼠接受了来自CIH的小鼠的辐照脾脏淋巴细胞。在第14天，所有的小鼠均给予15mg/kg刀豆素A的尾静脉注射。17-20小时后，取出小鼠的肝脏，用4%多聚甲醛进行固定。对肝脏的组织切片进行常规的服E染色和TU腦EL染色，通过光学显微镜对其进行检查。结果如图2所示，在对照组小鼠和接受na'ive细胞疫苗处理的小鼠，CIH诱导后其肝脏出现大量的炎性浸润和肝细胞凋亡，然而接受了细胞疫苗预处理的小鼠，其肝脏部位少见炎性浸润和肝细胞凋亡。实施例4细胞疫苗的保护作用呈剂量和频率依赖性1.剂量依赖测试细胞疫苗按照实施例1中所述的方法进行准备，将C57BL/6小鼠分为三组，每组四只-对照组注射PBS;致病性淋巴细胞处理组l:注射低剂量(5XlCf细胞/小鼠)CV，即CV(L);致病性淋巴细胞处理组2:注射高剂量(为1X10'细胞/小鼠)CV，即CV(H)。各组小鼠在第0天和第7天通过尾静脉注射分别给予不同剂量的CV，其中CV(L)的为5Xl(T细胞/小鼠，CV(H)的为1X107细胞/小鼠。在第14天，所有的小鼠均给予尾静脉注射的15mg/kg刀豆素A。17-20小时后，取出小鼠的血浆测量ALT的水平。结果如图3A，可以看到，健康小鼠经过高剂量CV(lXl(T细胞/小鼠)预先处理后，CIH诱导后血浆中ALT的水平与接受低剂量CV(5X106细胞/小鼠)的小鼠相比明显降低。因此，本发明的细胞疫苗对于CIH的保护作用显示了明显的剂量依赖性。2.注射频率依赖测试细胞疫苗按照实施例1中所述的方法进行准备，将C57BL/6小鼠分为三组，每组四只对照组注射PBS;致病性淋巴细胞处理组l:1次注射CV(CV-1);致病性淋巴细胞处理组2:2次注射CV(CV-I1)。对照组的小鼠仅接受PBS的注射，其它两组小鼠分别接受不同次数的疫苗接种。CV-I组小鼠仅在第0天接受一次CIH的小鼠的辐照脾脏淋巴细胞(1X107细胞/小鼠)；CV-II组小鼠分别在第0天和第7天接受两次CIH的小鼠的辐照脾脏淋巴细胞(1X107细胞/小鼠)，间隔7天。第14天，所有的小鼠均给予15mg/kg刀豆素A的尾静脉注射。17-20小时后，取出小鼠的血浆测量ALT的水平。结果见图3B，从图中可以看到，在第0天和第7天给小鼠预先接种细胞疫苗，对于CIH的保护作用明显好于给小鼠单次接种细胞疫苗的效果，ALT的水平降低的更为显著。图中，与对照相比，*p〈0.05，**p〈0.01。实施例5细胞疫苗可以抑制血浆中TNF-a、IFN-y和IL-4的水平细胞疫苗按照实施例1中所述的方法进行准备，将c57bl/6小鼠分为两组，每组四只-对照组注射PBS;致病性淋巴细胞处理组注射CV。小鼠在第0天和第7天通过尾静脉注射分别接受PBS以及CV。在第14天，所有的小鼠均给予15mg/kg刀豆素A的尾静脉注射。在注射刀豆素A2小时后，取出小鼠血浆，通过ELISA方法分别检测TNF-a和IL-4，以一抗(TNF-a和IL-4的一抗均购自R&D公司)包板室温过夜，洗板后以1%BSA，5%蔗糖封闭，洗板后加标本孵育2小时，洗板后加生物素标记的二抗(均购自R&D公司)孵育2小时，洗板后以链霉素亲和素标记的辣根过氧化物酶45分钟，最后加底物显色。本检测方法采用R&D的ELISA试剂盒，完全按照说明书进行。结果如图4A和4B所示。在注射刀豆素A8小时后，取出小鼠的血浆，通过ELISA方法分别检测IFN-y的分泌水平，以一抗(IFN-y的一抗购自R&D公司)包板室温过夜，洗板后以1%BSA、5%蔗糖封闭，洗板后加标本孵育2小时，洗板后加生物素标记的二抗(购自R&D公司)孵育2小时，洗板后以链霉素亲和素标记的辣根过氧化物酶反应45分钟，最后加底物显色。本检测方法采用R&D的ELISA试剂盒，完全按照说明书进行。结果如图4C所示。由图4A-4C所示，在诱导CIH之前给予小鼠接种细胞疫苗可以显著抑制TNF-a、IFN-Y和IL-4在血浆中的水平，与对照组相比，可以分别抑制80%、80%和60%，显示了细胞疫苗可以通过抑制炎性因子的分泌发挥对于CIH的保护作用。与对照相比，***P<0.001。实施例6细胞疫苗可抑制肝脏组织中MIP-1a、MCP-1和IP-10的表达细胞疫苗按照实施例1中所述的方法进行准备，将C57BL/6小鼠分为两组，每组四只对照组注射PBS;致病性淋巴细胞处理组注射CV。小鼠在第0天和第7天通过尾静脉注射分别接受PBS以及CV。第14天，所有的小鼠均给予15mg/kg刀豆素A的尾静脉注射。17-20小时后，麻醉小鼠，灌注后取出肝脏组织，提取RNA。通过Real-timePCR的方法检测A)MIP-1a,B)MCP-l和C)IP-IO的表达水平。腿抽提采用Qiagen公司的试剂盒(RNeasyMiniKit)进行RNA的抽提，主要步骤如下(1)取包含>5乂106个单个核细胞的脾脏细胞于E卯endorf管中，2000转/min，离心3min，离心后去上清；(2)加入350ul裂解液(RLT)，吹打几次，充分裂解；(3)裂解后加入350^1的70%酒精，反复吹打，充分混匀；(4)将700ti1的总液体转移到柱子上，12000转/min，室温下离心15sec，去液体；(5)加入RW1溶液350ul，12000转/min，室温下离心15sec，离心后去液体；(6)加入RNase-freeDNase(尽量直接加到膜上)，室温放置15min;(7)加入RW1溶液350ul，12000转/min，室温下离心15sec，离心后去液体(8)换套管，加入RPE溶液50012000转/min，室温下离心15sec，离心后去液体；(9)加入RPE溶液500ul，12000转/min，室温下离心2min，离心后去液体；(10)换Eppendorf管，加入无RNase的水30u1，12000转/min，室温下离心lmin;(11)加入无RNase的水30u1，12000转/min，室温下离心lmin;(12)收集得到60ul含有RNA的溶液；(13)分光光度仪上测定RNA浓度；(14)-80。C冻存。逆转录1采用Qiagen公司的逆转录试剂盒(SensiscriptRTKit)，体系为20pd，具体如1表l:表l<table>complextableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>混匀后离心，进行如下反应:37°Clh，93°C5min，4°C。Real-timePCR(1)将上述逆转录产物的cDNA，用高压水按l:4比例稀释。(2)将荧光染料SYBRGreen和目的基因IP-IO和内参actin的引物按5HiSYBRGreen+0.15ii1引物混匀，短暂离心。(3)加样在RealTimePCR检测板(384孔)中每孔4.85"1cDNA+5.15SYBRGreen和引物混合物，加好后离心，在384孔板上盖上膜，尽量密封。(4)封膜后，将384孔板放入RealTimePCR仪(ABI7900)进行PCR反应，具体程序如下①50°C2min，②95°ClOmin，③95°C15sec，60°C60sec，回到步骤3，共40个循环。采用的引物如表2:表2<table>complextableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>结果如图5所示，与对照组相比，接受细胞疫苗CV的小鼠在诱导CIH后，MIP-la、MCP-1和IP-10mRNA在肝脏中的表达显著降低。因此，细胞疫苗可以通过抑制趋化因子的表达来发挥对CIH的保护作用。实施例7细胞疫苗可以使脾脏中颗粒酶BmRNA的表达上调细胞疫苗按照实施例1中所述的方法进行准备，将C57BL/6小鼠分为两组，每组四只对照组注射PBS;致病性淋巴细胞处理组注射CV。小鼠在第0天和第7天通过尾静脉注射分别接受PBS以及CV。第14天，所有的小鼠均给予15mg/kg刀豆素A的尾静脉注射。17-20小时后，处死小鼠，取出脾脏，采用常规的RNA提取方法提取脾脏淋巴细胞的RNA。通过ReaHimePCR的方法检测granzymeB的表达7夂平(Real-timePCR的方法同上)。结果如图6所示，与对照组相比，接受细胞疫苗CV的小鼠在诱导CIH后，脾脏淋巴细胞中granzymeB的表达水平明显升高，显示了细胞疫苗可能通过诱导了细胞毒作用发挥其对CIH的保护作用。实施例8外周血淋巴细胞疫苗可以保护小鼠，抑制CIH的发生细胞疫苗按照实施例1中所述的方法进行准备，将C57BL/6小鼠分为三组，每组四只对照组注射PBS;致病性淋巴细胞处理组注射外周血来源的淋巴细胞疫苗(PBLCV)。未致敏的淋巴细胞处理组注射采用如前述疫苗2的制备方法，但从未诱导CIH的小鼠外周血中分离出来的淋巴细胞(na'ivePBLCV)。小鼠分为三组，每组四只。小鼠在第0天和第7天通过尾静脉注射分别接受PBS、na'ivePBLCV以及从PBLCV。也即对照组的小鼠仅接受PBS的注射；na'ivePBLCV组的小鼠接受来自于健康小鼠的辐照外周血淋巴细胞(2X106细胞/小鼠)；PBLCV组的小鼠接受来自CIH的小鼠的辐照外周血淋巴细胞(2X106细胞/小鼠)。第14天，所有的小鼠均给予15mg/kg刀豆素A的尾静脉注射。17-20小时后，取出小鼠的血浆测量ALT的水平。结果如图7A所示，与对照相比，**P<0.01。取出肝脏组织，对肝脏的组织切片进行服E染色和TUNEL染色，通过光学显微镜对其进行检査，结果如图7B所示。如图所示，本发明人可以看到外周血来源的细胞疫苗同样也可以保护小鼠免受CIH的破坏作用，主要表现在血浆中ALT水平的明显降低，以及肝脏组织中炎性浸润和细胞凋亡的明显抑制，显示了与脾脏细胞来源的细胞疫苗的相似作用。而且，这种外周血来源的细胞疫苗只需要极低的细胞量即可以发挥保护作用，且未发现对受试动物本身可见的毒副作用。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>巾国科学院上海生命科学研究院<120〉防治肝脏损伤的细胞疫苗<130〉066572<160〉10<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>21<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc一feature<223〉引物〈400〉1tgtccaccttccagcagatgt21<210〉2<211〉23<212〉隨<213〉人T.序列<220><221〉raise—feature<223>引物<柳〉2agctcagtaacagtccgcctaga23<210>3<211>21<212>靈<213〉人T.序列<220>〈221〉misc—feature<223〉引物<400>3aaaaacctggatcggaaccaa<210>4<211〉22〈212〉DNA<213>人丁序列<220><221〉raise—feature<223〉引物<400>4egggtcaacttcacattcaaag<210>5<211>21〈212>DNA〈213>人工序列<220><221>misc—feature〈223〉引物<400>5caccctctgtcacctgctcaa<210>6<211〉21<212>廳<213>人丁序列<220><221〉tnisc一feature<223>引物<400>6atggcgctgagaagacttggt<210>7<211>20<212〉DNA〈213〉人工序列<220><221〉misc—feature<223>引物<400〉7gccgtcattttctgcctcat<210〉8<211〉18<212〉靈<213〉人工序列〈220〉<221〉misc一feature<223>引物<400〉8ggcccgtcatcgatatgg18<210>9<211>21<212〉廳<213>人工序列<220〉<221>misc—feature<223〉引物〈400〉9acagaaggatcgggagtgtga21<210>10<211〉19<212>DNA<213>人工序列<220><221〉misc一feature<223>引物<400〉10cccgaaaggaagcacgttt19权利要求1.一种细胞群，其特征在于，所述细胞群来源于经刀豆素A诱导的模式动物，且其中90％以上为单个核细胞，所述细胞群在注射到哺乳动物体内后，能够显著降低哺乳动物患肝损伤后体内谷丙转氨酶水平。2.如权利要求l所述的细胞群，其特征在于，所述细胞群在注射到哺乳动物体内后，还能够抑制哺乳动物患肝损伤后的TNF-a、IFN-Y或IL-4的水平；抑制哺乳动物患肝损伤后的肝脏组织MIP-1a、MCP-1或IP-10的表达；或促进哺乳动物患肝损伤后的脾脏组织颗粒酶B的表达。3.如权利要求l所述的细胞群，其特征在于，所述的模式动物为鼠。4.如权利要求l所述的细胞群，其特征在于，所述的细胞群来源于经刀豆素A诱导的模式动物的脾脏或外周血。5.如权利要求l所述的细胞群，其特征在于，所述的细胞群通过以下方法制备获得(a)给予模式动物有效量的刀豆素A，诱导肝损伤的模式动物；(b)取出(a)制备的肝损伤模式动物的脾脏或外周血，从中分离出单个核细胞；和(c)将(b)获得的单个核细胞进行灭活，获得所述的细胞群。6.权利要求l所述的细胞群的用途，其特征在于，用于制备预防哺乳动物肝损伤的组合物。7.—种组合物，其特征在于，所述的组合物含有有效量的权利要求1所述的细胞群，以及与所述细胞群相容的载体。8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述的组合物为疫苗。9.一种制备权利要求l所述的细胞群的方法，其特征在于，所述方法包括步骤(a)给予模式动物有效量的刀豆素A，诱导肝损伤的模式动物；(b)取出(a)制备的模式动物的脾脏或外周血，从中分离出单个核细胞；和(c)将(b)获得的单个核细胞进行灭活，获得所述的细胞群。10.—种刀豆素A诱导的肝炎模型的用途，其特征在于，用于制备权利要求1所述的细胞群。全文摘要本发明公开了一种细胞群，所述细胞群来源于经刀豆素A诱导的模式动物，且其中90％以上为单个核细胞，所述细胞群在注射到哺乳动物体内后，能够显著降低体内谷丙转氨酶水平。本发明还公开了所述细胞群的制备方法以及含有所述细胞群的组合物。本发明所获得的细胞群的预防肝损伤的效果大大优于其它药物；并且，采用本发明的方法可获得大量的单个核细胞且制备简便、获得量大、无需体外培养，从而可用于制备成细胞疫苗，克服了本领域通常难以从致病个体获得足够量免疫细胞且难以获得针对性的细胞的缺陷。文档编号C12N5/06GK101195814SQ20061011932公开日2008年6月11日申请日期2006年12月8日优先权日2006年12月8日发明者徐凌云,梅云华,莹王申请人:上海交通大学医学院;中国科学院上海生命科学研究院