专利名称：蛇足石杉内生真菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及蛇足石杉内生真菌及其应用。
背景技术：
石杉碱甲作为新一代治疗早老性痴呆的特效药，市场前景非常可观，其衍生物 ZT-1在欧洲EMEA的注册认证正进入III期临床，产品开发也在积极进行。目前，石 杉碱甲主要来源于蛇足石杉(i/w/7e^/a ^rrato)全草。虽然蛇足石杉资源区域广阔，但 分布星散，资源更新周期长，可供商业开采的天然资源比较少。经过多年的大量开采， 中国浙江、江西、福建等省的蛇足石杉资源几近枯竭。湖南、广西、四川等省的资源 也将在两、三年内面临枯竭的危险。这些地区作为蛇足石杉区域化优势品种地位的逐 渐丧失，因而通过直接采收蛇足石杉天然资源已不能满足市场对石杉碱甲的需求。另 一方面，石杉碱甲的化学合成因得率低、成本昂贵，也难以实现产业化。研究者们试 图通过生物技术方法来获得石杉碱甲，因此，近年来这已成为人们关注的课题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于设计一种能够通过微生物发酵产生石杉碱甲类 似物。
本发明提供了一种蛇足石杉内生真菌，命名为内生枝顶孢霉(Arewom'"附
本发明所述的蛇足石杉内生真菌是从蕨类植物蛇足石杉(/m/^rz/a^rrato)植物 活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，经微生物分类学鉴定为内生枝顶孢霉 (爿cremom'ww e"cto如Www)。该菌株已经保藏，保藏日期为2006年11月13 R，保
藏号为CCTCCM206118，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址湖北省武汉 市珞珈山武汉大学，邮编430072。
本发明所述的蛇足石杉内生真菌的固体培养特征为
在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上28t:培养，最初气生菌丝无色，渐变白 色；菌落圆形，白色，绒毛状，边缘不整齐，背面淡黄褐色。
本发明所述的蛇足石杉内生真菌的液体培养特征为-
(1) 培养基PDA，摇瓶培养7天，培养温度28士rC;
(2) 发酵培养特征培养第l-2天，未见明显生长现象；培养第3天，有少许
白色菌丝出现；培养第三天，形成直径l-2mm白色菌丝球；培养第4天菌球直径增 大到2-4mm;培养第5天，菌球数量增多；培养第6天，发酵液黏稠；培养第7天， 菌丝球集结。
本发明所述的蛇足石杉内生真菌的形态特征为
1、 无性世代，菌丝分枝，平滑，有隔，粗1.2-1.5^;在年幼菌落的产孢区域， 菌丝侧生较短的孢子梗，长1(M3^im;分生孢子卵形至梭形，无色， 3.53-5.44x1.16-1.32nm，链状串生。
2、 有性世代，未发现
本发明所述的蛇足石杉内生真菌的18SrDNA碱基序列为 TGCATTATACAGCGAAACTGCGAATGGCTCATTATATAAGTTATCGTTTATTT
CGTGCACTGGTCCGGCCGGGCCTTTCCCTCTGTGGAACCCCATACCCTTCACTG
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本发明的另一目的是提供了蛇石杉内生真菌的应用。
本发明所述的蛇足石杉内生真菌，经发酵可得石杉碱甲类似化合物，其工艺歩骤
如下
菌种活化^种子培养 发酵培养_ 发酵产物细胞破碎 总
生物碱提取~~ HPLC和LC-MS分析 石杉碱甲类似化合物
其中，发酵原料为改良的马铃薯培养基(PDA)，发酵方式为液体摇瓶培养；菌 种活化采用试管斜面培养，培养基为马铃薯葡萄糖固体培养基(固体PDA);种子培
养为马铃薯葡萄糖液体培养基(液体PDA);发酵培养基为改良马铃薯葡萄糖液体培
养基(液体PDA);培养时间菌种斜面培养活化72小时，种子摇床培养72小时， 发酵培养7天；培养温度:试管斜面培养温度为28±1 °C ，种子摇床培养温度为28±1 'C ， 发酵培养温度为28±rc;发酵物提取发酵完毕，收集发酵产物，破碎细胞，用常
规提取方法提取总生物碱，采用HPLC分离获得石杉碱甲类似化合物。
本发明所述的蛇足石杉内生真菌，通过菌株液体发酵能够产生石杉碱甲类似化合 物，是寻找治疗早老性痴呆活性成分石杉碱甲新资源的重要微生物，有较大的应用价 值。
图1为本发明所述的蛇足石杉内生真菌的菌落形态
图2为本发明所述的蛇足石杉内生真菌在100倍显微镜下观察到的菌丝和孢子形
态
图3为本发明所述的蛇足石杉内生真菌在电子显微镜下的菌丝形态
图4为本发明所述的蛇足石杉内生真菌在电子显微镜下观察到的孢子形态
图5为本发明所述的蛇足石杉内生真菌生物碱成分色谱图(a)与石杉碱甲标准
品色谱图(b)的对照
图6为本发明所述的蛇足石杉内生真菌生物碱目标组分紫外吸收光谱图(左)与
石杉碱甲标准品紫外吸收光谱图(右)的对照，两者在Agilent化学工作站上用Match
程序进行匹配比较，匹配因子达994.568。
图7为本发明所述的蛇足石杉内生真菌生物碱目标组分质谱扫描图(上)与石杉
碱甲标准品质谱扫描图(下)，两者的准分子离子峰分别为243.10和243.11，可初步
认定两者是同一组分。
具体实施例方式
实例1:
(1) 取本发明的蛇足石杉内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌
丝，接入已灭菌的固体PDA培养基试管，于28士rC活化培养72小时；
(2) 取活化培养后的菌种，无菌条件下，转接入已灭菌的液体PDA种子培养 基中，28il'C下140rpm摇床培养72小时，得种子；
(3) 配制好的改良PDA液体培养基，按20%装料比，分装入500ml的三角瓶 中，灭菌处理，冷却备用。无菌条件下，按照10%的接种量接入2F09P03B种子，28±rC 下140rpm摇床培养7天；
(4) 发酵完毕，收集培养物，调PH值至4.0左右，破碎细胞，静置过夜，调 PH值至10.0左右，离心收集上清液，调PH值至9.0，按l/2比例用氯仿萃取5次， 收集萃取液，8(TC回收氯仿，用甲醇溶解残留物得到石杉碱甲类似物。
(5) HPLC色谱条件如下色谱柱——Kromasil C18反相柱(4.6x250mmx5nm)， 流动相——CH3CN-KH2PO4(0.02mol/L) 10:90，流速——1.0mL/min，检测波长310画。
(6) LC-MS检测色谱条件色谱柱——BDS Hypersil C18反相柱(2.1mm
xl00mmx3nm )， 流动相-H20(1% formic acid)- methanol ， 梯度洗脱-=
-[10.00:80.0]-[15.00:5.0〗，流速——0.2mL/min，进
样量-0.5pL。质谱检测参数-shealth flow rate(arb)~60， aux gas flow rate(arb) _5，
I spray voltage(kv) —5.00, capillary temp(。C) —275.00， capillary voltage(v) —31.00， tube lens offset(v卜l 0.00。
(7) 经以上HPLC和LC-MS分析，表明本发明的蛇足石杉内生真菌菌种液体 发酵能够产生石杉碱甲类似化合物。
权利要求
1.一种蛇足石杉内生真菌，其特征在于它的命名为内生枝顶孢霉Acremoniumendophytium，其保藏登记号为CCTCC M 206118。
2. 根据权利要求l所述的一种蛇足石杉内生真菌，其特征在于它的显微形态为菌丝分枝，平滑，有隔，粗1.2-1.5pm;在年幼菌落的产孢区域，菌丝侧生较短的孢 子梗，长10-13fim;分生孢子卵形至梭形，无色，3.53-5.44xU6-1.32pm，链状串生。
3. 根据权利要求l所述的一种蛇足石杉内生真菌，其特征在于它的固体培养为 在PDA培养基上28'C培养，最初气生菌丝无色，渐变白色；菌落圆形，白色，绒毛 状，边缘不整齐，背面淡黄褐色。
4. 根据权利要求l所述的一种蛇足石杉内生真菌，其特征在于它的液体培养为(1) 培养基PDA，摇瓶培养7天，培养温度28士rC;或(2) 发酵培养特征培养第1_2天，未见明显生长现象；培养第3天，有少许 白色菌丝出现；培养第三天，形成直径l-2mm白色菌丝球；培养第4天菌球直径增 大到2-4mm;培养第5天，菌球数量增多；培养第6天，发酵液黏稠；培养第7天， 菌丝球集结。
5. 根据权利要求1所述的一种蛇足石杉内生真菌，其特征在于它的基因组18S rDNA碱基序列为AACTACCACCCAGGGCCGGATATAGCTGTCCAAATTCGAG 。
6. —种如权利要求1所述的蛇足石杉内生真菌在制备石杉碱甲类似物中的应用， 其特征在于该制备方法包括下列步骤-(1) 取本发明的蛇足石杉内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌 丝，接入已灭菌的固体PDA培养基试管，于28土rC活化培养72小时；(2) 取活化培养后的菌种，无菌条件下，转接入已灭菌的液体PDA种子培养 基中，28士rC下140rpm摇床培养72小时，得种子；(3) 配制好的改良PDA液体培养基，按20%装料比，分装入500ml的三角瓶 中，灭菌处理，冷却备用。无菌条件下，按照10%的接种量接入种子，28士rC下140rpm 摇床培养7天；(4) 发酵完毕，收集培养物，调PH值至4.0左右，破碎细胞，静置过夜，调PH值至10.0左右，离心收集上清液，调PH值至9.0，按l/2比例用氯仿萃取5次， 收集萃取液，8(TC回收氯仿，用甲醇溶解残留物得到石杉碱甲类似物。
全文摘要
本发明公开了一种蛇足石杉内生真菌，它是从蕨类植物蛇足石杉(huperzia serrata)植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，经微生物分类学鉴定为内生枝顶孢霉(Acremonium endophytium)。该菌株保藏号为CCTCC M 206118。本发明通过蛇足石杉内生真菌菌株液体发酵，产生了石杉碱甲类似化合物，是寻找治疗早老性痴呆活性成分石杉碱甲新资源的重要微生物。
文档编号C12N1/14GK101195804SQ200610119149
公开日2008年6月11日 申请日期2006年12月5日 优先权日2006年12月5日
发明者周吉燕, 王峥涛, 胡之璧, 黎万奎 申请人:上海中医药大学