与甘蓝未熟抽薹基因相连锁的分子标记及其建立方法

专利名称：与甘蓝未熟抽薹基因相连锁的分子标记及其建立方法
技术领域：
本发明涉及分子标记的建立方法，尤其涉及与甘蓝未熟抽薹基因相连 锁的分子标记的建立方法。
背景技术：
甘蓝(Bmw/ca O/eracea L. Var. Ojp/tota L.)是十字花科芸薹属的二年生 蔬菜作物，在我国分布相当广泛。近年来，春甘蓝种植面积增加较快，但 由于种植的一些春甘蓝品种耐未熟抽薹性较差，再加上春季经常出现倒春 寒现象和长期阴天寡照天气，使得栽培的春甘蓝品种经常发生未熟抽薹现 象，从而严重地影响了甘蓝的品质和产量。据调査，1998 2005年间南方地 区春甘蓝未熟抽薹率总在15%~50%之间，有些农户有时达100%。
当前，国内应用的耐未熟抽薹甘蓝品种主要是以"中甘11号"、"8398" 为代表的春甘蓝品种， 一般适合我国北方地区气候条件及栽培方式，引种 到黄河以南及长江中下游地区，大都表现不耐寒、易未熟抽薹， 一般在1 月份采用保护地育苗，在5月份上市，效益不高；而以"争春"、"春丰" 为代表的适合露地越冬的耐未熟抽薹春甘蓝品种，又存在着熟性偏迟，中 心柱偏长，叶球不够紧实等问题，在3-4月份上市的春甘蓝品种尚是空缺。 因此，尽快选育出耐未熟抽薹、早熟、品质优良的春甘蓝新品种已成为甘 蓝生产中迫切需要解决的一大课题。
但是，目前耐未熟抽薹甘蓝新品种的选育都是依靠传统的育种方法， 需要跨年度进行耐未熟抽薹性状的选择鉴定，周期长，工作量大。另外，
耐未熟抽薹性状受遗传背景及环境因素影响较大，给依靠表型选择造成了 困难。近几年发展起来的分子标记辅助育种技术，为植物育种学家提供了 一条新的途径。该技术是将分子标记技术与传统育种学相结合，用稳定、
可靠的DNA分子标记代替易受环境影响的表型标记，对育种材料进行筛 选。利用分子标记辅助育种的关键是筛选到与目标基因紧密连锁的分子标 记，因此，开发研究一种与甘蓝未熟抽薹基因相连锁的分子标记的建立方 法，以满足有关方面的需要，将具有十分重要的意义。

发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种与甘蓝未熟抽薹基因相连锁的 分子标记及其建立方法，以满足有关方面的需要。
本发明的技术构思是这样的
本发明根据"群体分离分组法(bilked segregant analysis, BSA)"的原
理，利用甘蓝易未熟抽薹材料与耐未熟抽薹材料的杂交分离群体，通过 RAPD技术开展甘蓝未熟抽薹性状分子标记研究，寻找与甘蓝未熟抽薹基 因连锁的RAPD标记，以用于甘蓝未熟抽薹的早期鉴定和针对该特性的分 子标记辅助育种。
本发明所说的与甘蓝未熟抽薹基因相连锁的分子标记，其特征在于， 所述的分子标记S97靴和U16446，是用下述方法得到的
(1)、按照王小佳主编的《蔬菜育种学》(中国农业出版社2000年出版) 所叙述的甘蓝杂交和自交方法，将上海市农业科学院园艺研究所甘蓝课题 组选育的甘蓝易未熟抽薹亲本2002-45和耐未熟抽薹亲本2002-90进行杂 交，得到F1代，再经过自交获得F2分离群体。
(2) 、用SDS方法(在本文的具体实施方式
中有详细描述)提取F2代 单株的DNA，并选取10株典型的发生未熟抽薹的单株DNA等量混合为未 熟抽薹池(F池)，选取10株正常生理发育而包球成熟的单株DNA混合为耐 未熟抽薹池(R池)；
(3) 、利用两个基因池筛选引物，再利用获得的候选引物对F2代单株进 行PCR扩增，验证多态片段的稳定性；
(4) 、筛选出的分子标记S97股和U16446，经过连锁性鉴定，与甘蓝未 熟抽薹基因相连锁。
经上海生工生物工程有限公司测序分析，S97392的DNA序列为:
GTCGT
经上海生工生物工程有限公司测序分析，U16446的DNA序列为:
2、与甘蓝未熟抽薹基因相连锁的分子标记是采用RAPD分子标记进行 筛选的，具体的方法是
(1) 、基因池间DNA多态性分析
采用上海生工生物工程有限公司合成的lObp寡核苷酸作为随机引物， 在Mastercycler 5333型PCR仪上进行PCR扩增，PCR反应体系为20 pl， 其中25 mmol/L MgCl22.0nl， 10 X PCR Buffer 2.0 pl， 10 mmol/L dNTP 0.5 pl， 5U/pLTaqE0.5 ^， 20ng/>1 Primer 2.0 pl， 1 Ong/pl模板DNA 3 pl ，灭菌 双蒸水10pl，加盖一滴矿物油进行扩增。扩增程序为94"C预变性5 min; 94。C变性lmin， 37""C退火1 min， 72。C延伸1.5 min， 40个循环;72。C延伸 10 min后15。C保存。RAPD扩增产物电泳分析采用浓度为15 g/L的琼脂糖 凝胶(含0.15 ng/L EB)，电泳缓冲液为lxTAE，保持90 V恒压(4 5 V/cm) 电泳1.5 2h，凝胶成像仪成像分析。
(2) 、分子标记的连锁性鉴定
在同一条件下鉴定F2代分离群体的未熟抽薹发生情况。用 Mapmaker/3.0软件对分离群体单株的未熟抽薹性和分子标记的分离数据进 行连锁分析，利用Kosambi函数将重组率转化为遗传图距cM(centimorgan)。 所说的Mapmaker/3.0软件在生物谷网站(http:〃www.bioon.com/Soft)可以下尊。
本发明的与甘蓝未熟抽薹基因相连锁的分子标记，可用于甘蓝未熟抽 薹的早期鉴定和针对该特性的分子标记辅助育种。 有益效果
本发明利用分子标记方法得到两个与甘蓝未熟抽薹基因紧密连锁的分子标记，可以用于甘蓝未熟抽薹的早期鉴定和针对该特性的分子标记辅助 育种，有效地克服了常规鉴定方法所需时间周期长的缺点。同时也可利用 这两个标记进一步克隆未熟抽薹基因、并对其进行结构和功能分析，这对 于进一步了解甘蓝未熟抽薹的分子遗传学机理有积极意义。因此，本研究 结果在甘蓝育种实践及抽薹理论研究上都很有价值。


图l:候选引物部分F2单株验证结果。
图中A、 B、 C、 D分别为引物S20、 S86、 S97、 U16对部分单株扩增 的结果，泳道1~20为未熟抽薹植株，泳道21 29为正常植株。
具体实施例方式
、
本发明的具体实施程序是利用甘蓝易未熟抽薹亲本2002-45与耐未熟 抽薹亲本2002-90进行杂交得到Fl代，再经过自交获得F2分离群体。提 取F2分离群体单株数共计117株，其中未熟抽薹单株90株，正常包球的 耐未熟抽薹单株27株。
1、提取DNA
按如下程序提取甘蓝单株材料的基因组DNA:
取新鲜组织2g，在液氮中研磨成粉，置于50ml离心管，加入8ml提 取液(100mMTrispH8.0， 50mMEDTA， 500mMNaCl， 1.5%SDS)， 65°C 情况下30分钟，不时颠倒混匀，加2.5ml5M乙酸钾冰浴10分钟，加5 ml 氯仿，颠倒混匀，10000rmp离心8分钟，取上清移入新管，加2 / 3体积预 冷异丙醇，颠倒混匀，-20°。置1-2小时，挑出絮状白色DNA， 70%乙醇洗 1-2次，吹干，溶于100ul(或适量)TE中，并在1%琼脂糖凝胶上电泳，用
标准XDNA作对照，估算甘蓝DNA样品的浓度，获得高纯度甘蓝DNA。 从提取的样品中选取10株典型的发生未熟抽薹的单株DNA等量混合为未 熟抽薹池(F池)，选取10株正常生理发育而包球成熟的单株DNA混合为耐 未熟抽薹池(R池)。
2、随机扩增多态性DNA(RAPD)分析
(1) 、 PCR扩增
RAPD引物购自上海生工生物工程公司，共计260个。
反应体系为20 pl，其中25 mmol/LMgCl22.0^il， 10XPCR Buffer 2.0 pl，
10 mmol/L dNTP 0.5 pl， 5 U/ Taq E 0.5 pi, 20ng / pi Primer 2.0 (il， 10ng/ pi
模板DNA 3^1，灭菌双蒸水lO(il，加盖一滴矿物油，在Mastercycler 5333
型PCR仪上进行扩增。
反应程序为94""C预变性5 min; 94。C变性1 min， 37。C退火1 min， 72
。C延伸1.5 min， 40个循环；72"延伸10 min后15。C保存。
(2) 、电泳检测
RAPD扩增产物电泳检测采用浓度为15 g/L的琼脂糖凝胶(含0.15 ng/L EB)，电泳缓冲液为lxTAE，保持90 V恒压(4 5 V/cm)电泳1.5 2h，凝胶 成像仪成像分析。
(3) 、引物筛选结果
根据"群体分离分组法(bilked segregant analysis, BSA)"原理，先利 用F、 R两基因池对260个引物进行筛选，其中ll个引物对基因池无扩增 产物，16个引物扩增产物的条带数少于4条，其它233个引物在两池间能 扩增产生丰富、清晰的条带，即有效引物比例为89.6%。 233个有效引物扩 增产生条带约1200条，平均每个引物扩增出条带5.2条。
233个有效引物中有217个引物对基因池扩增谱带完全一致，16个引 物能扩增产生多态性，经反复验证，只有4个引物即S20、 S86、 S97、 U16 (S20: GGACCCTTAC; S86: GTGCCTAACC; S97: ACGACCGACA;賜: CTGCGCTGGA)表现出稳定的多态性，且差异条带都出现在F池扩增产物 中，引物S20、 S86、 S97均产生1条差异条带，片段大小约为600bp、 500bp、 400bp，引物U16扩增产生2条差异条带，大小约为450bp、 550bp，因此 将S20、 S86、 S97、 U16确定为甘蓝未熟抽薹基因RAPD标记候选引物。 3、候选引物单株验证
利用分离群体中的单株DNA对候选引物进一步验证，结果见附图1， 图中A、 B、 C、 D分别为引物S20、 S86、 S97、 U16对部分单株扩增的结 果，泳道1~20为未熟抽薹植株，泳道21 29为正常植株。由图可见，4引 物在多数单株上能扩增产生与基因池间一致的多态性，可见扩增产生的特 征片段与甘蓝未熟抽薹基因存在连锁关系，可确定其为甘蓝未熟抽薹基因 的RAPD标记。但各标记在分离群体中并非表现为全有和全无的差别，有 少数发生未熟抽薹的单株上未能扩增出差异条带，同样也有少数正常植株 扩增产生差异条带，即存在一定的交换率，且各标记的交换率不同，说明 各标记与甘蓝未熟抽薹基因连锁程度不同。
对5个连锁标记在所有单株中出现情况进行分析，统计未熟抽薹植株 有标记、未熟抽薹植株无标记、正常植株有标记、正常植株无标记的单株 数，计算出标记符合率、交换率，并利用Kasambi公式计算单个标记与甘 蓝未熟抽薹基因的遗传距离。引物S97、 U16相对引物S20、 S86显示出较
为整齐的多态性，其中标记S97靴和U16446与未熟抽薹基因遗传距离分别
为8.58cM和10.45cM。
序列表
<110>上海市农业科学院
<120>与甘蓝未熟抽薹基因相连锁的分子标记及其建立方法
<130>S
<160>2
<170>Patent In versinon 3.1
<210>1
<211>392bp
<212>DNA
〈213〉甘蓝CBrow7cfl O/eracea L. Var. Ca/ z'/"to L)
<220>
<221>CDS
<400> 1
ACG ACC GAC AGC CAC GTC TTC AGC GAC CAG GTT CAC GGG CCT GTG 45 GCC CCA ACT GAG CCC CGA AAT CAG AAG GTG CGA AGT TAG CTG ATG 90 AAA CCG TGT CGA GCA TGT CAT CTA CTC ATT AGA TGG ATT GAA GCG 135 ATA TTT CGT CAG TTT TCA AGA TGA TTC ACT TTA ACT ATC TTC CAT ATC 183 ACG CGA GCC CAC TTG GGC GAC GCT TCA AAG CTG ATA GGA AAC AGA 228 CCG AAA TGC CGA CAC TTC TCG CGA TAC AGG CAA GCC CTC GCC ACG 273 AAC ACT CGA CCT CCC GCA AGC TCT CGG CGG TAT TCG TTG AGA AAT 318 GGC TGG CCG CAC ACC CCG GCG GTA AAG CCA TTG AAC GCG ATC TGA 363 TTA AGA CCA ATC TGC CGT TTG TCG GTC GT 392
<210>2
<211>446bp
<212>DNA
〈213〉甘蓝CSrassi'ca L Var. Capi.toto L.)
<220>
<221>CDS <400>2
ACA TAA CCG CTC TGC TCT TCA AGC AAA TTG AGA ACG GTG ACT GGG 93
TTC CCG CAT CCA CGC CGC AAA CGC CTG CAC ATA CTC CAA CCC GGC 282
ATG CTC TTG CGC CAC GTC GAG CCA ATA CCC AAA CGG CCC CGT CAC 327 CTC GAT ATC GGA AAA CTG CGC GAG ACT TCC ATC GGC CAG TTC TTC GAC 375
GAT CAT GTT GCG ATC GAC GAT CGC CAG CCC CGC GCC TTT GCG CGC 420
GGC GCG AAT CGC CTG CTC CAG CGC AG 44权利要求
1.一种与甘蓝未熟抽薹基因相连锁的分子标记，其特征在于，所述的分子标记S97392和U16446，是用下述方法得到的(1)、利用甘蓝易未熟抽薹亲本2002-45与耐未熟抽薹亲本2002-90进行杂交得到F1代，再经过自交获得F2分离群体；(2)、用SDS方法提取F2代单株的DNA，并选取10株典型的发生未熟抽薹的单株DNA等量混合为未熟抽薹池(F池)，选取10株正常生理发育而包球成熟的单株DNA混合为耐未熟抽薹池(R池)；(3)、利用两个基因池筛选引物，再利用获得的候选引物对F2代单株进行PCR扩增；(4)、筛选出分子标记S97392和U16446。
2、 根据权利要求1所述的与甘蓝未熟抽薹基因相连锁的分子标记，其 特征在于，是采用RAPD分子标记进行筛选的，具体的方法是(1)、基因池间DNA多态性分析以10bp寡核苷酸作为随机引物，进行PCR扩增，PCR反应体系为20 pl， 其中25 mmol/LMgCl2 2.0^1， 10 X PCR Buffer 2.0 |xl， 10 mmol/L dNTP 0.5 pl， 5 U/ (iL Taq E 0.5 |il， 20ng / pi Primer 2.0 |il， lOng/ (il模板DNA 3 jil，灭菌 双蒸水10 pl，加盖一滴矿物油进行扩增，扩增程序为94'C预变性5 min; 94-C变性lmin， 37"C退火1 min， 72。C延伸1.5 min， 40个循环；72。C延伸 10 min后15"C保存。RAPD扩增产物电泳分析采用浓度为15 g/L的琼脂糖 凝胶(含0.15 ng/L EB)，电泳缓冲液为lxTAE，保持90 V恒压(4 5 V/cm) 电泳1.5 2h，凝胶成像仪成像分析；(2)、分子标记的连锁性鉴定在同一条件下鉴定F2代分离群体的未熟抽薹发生情况，用 Mapmaker/3.0软件对分离群体单株的未熟抽薹性和分子标记的分离数据进 行连锁分析，利用Kosambi函数将重组率转化为遗传图距cM(centimorgan)。
3、 一种与甘蓝未熟抽薹基因相连锁的分子标记，其特征在于所说的分 子标记为S97w和U16446。
4、 根据权利要求3所述的与甘蓝未熟抽薹基因相连锁的分子标记的应 用，其特征在于，用于甘蓝未熟抽薹的早期鉴定和针对该特性的分子标记 辅助育种。
全文摘要
本发明公开了一种与甘蓝未熟抽薹基因相连锁的分子标记的建立方法。本发明克服常规标记方法工作量大、易受环境影响、育种周期长等缺点。采用RAPD分子标记方法对易未熟抽薹和耐未熟抽薹的甘蓝亲本及其杂交后代“2002-45×2002-90”进行未熟抽薹基因标记的筛选。PCR反应采用的是上海生工生物工程有限公司合成的10bp寡核苷酸随机引物，筛选后得到与甘蓝未熟抽薹基因相连锁的分子标记S97₃₉₂和U16₄₄₆。这些标记可用于甘蓝未熟抽薹的早期鉴定和针对该特性的分子标记辅助育种，本发明对甘蓝育种实践及未熟抽薹理论研究都很有价值。
文档编号C12N15/29GK101191132SQ20061011851
公开日2008年6月4日 申请日期2006年11月20日 优先权日2006年11月20日
发明者任云英, 冲 刘, 薄天岳, 陈锦秀 申请人:上海市农业科学院