甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的选育方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于油菜分子育种技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不 育系的选育方法。本发明还涉及原生质体融合技术重组甘蓝型油菜-菘蓝的胞质和核基因 组，创建重组胞质的细胞质雄性不育系。本发明与油菜-菘蓝远缘杂交的分子育种技术相 关。
【背景技术】
[0002] 甘蓝型油菜是是一种重要的油料作物，表现明显的杂种优势。应用细胞质雄性不 育系（简称CMS)、保持系和恢复系三系配套生产杂交种是目前国内外油菜杂种优势利用的 主要途径。目前，国内外广泛应用于油菜杂交育种的是P〇l CMS和ogu CMS,其中ogu CMS 在国外应用较多，而pol CMS不育性不稳定，在低温或高温下容易出现微量花粉，从而降低 了杂交种纯度。另外，CMS胞质来源单一在作物生产中存在隐患，如美国T胞质玉米在1970 年爆发大面积小斑病。故新型CMS系统的创建及研究对于油菜育种有重要意义。
[0003] 甘蓝型油菜中已发现很多CMS系统，除了 pol和nap两个天然细胞质雄性不育 系，其它来自于种间或属间杂交。利用远缘杂交的手段导入野生种或近缘种雄性不育胞质 或远缘杂交后核质不协调导致雄性不育类型，容易获得不育彻底的雄性不育类型。许多近 缘种的不育胞质通过种间或属间杂交以及原生质体融合转移到芸薹属栽培作物中来，培育 出 了新的 CMS 系，主要包括 Arabidopsis thaliana、Brassica tournefortii、Diplotaxis berthautii、D. erucoidess、Eruca sativa、Moricandia arvensis、Raphanus sativus、 Sinapis arvensis等（Yamagishi和Bhat，2014)。但是这些CMS难以应用到油菜育种生产 中，主要是在油菜中没有异质CMS的恢复基因，而不能完成三系配套。
[0004] 十字花科務蓝族的務蓝（Isatis indigotica Fort.，2n = 14，II)为我国广泛栽 培的药用和染料植物，具有抗烟草花叶病毒和油菜菌核病等特性，为甘蓝型油菜遗传改良 的优异资源。本发明的前期研究中，杜雪竹在2008年利用菘蓝和甘蓝型油菜叶肉原生质体 进行体细胞融合，在菘蓝+甘蓝型油菜"中油821"、菘蓝+甘蓝型油菜"华双3号"及菘蓝+甘 蓝型油菜"〇ro"的3个杂交组合中，共获得愈伤数237个，2株对称融合杂种，13株非对称融 合杂种，并对杂种进行了形态、细胞学和分子生物学鉴定，申请人将该材料命名为菘蓝-甘 蓝型油菜叶肉原生质体细胞杂种（杜雪竹，2008,甘蓝型油菜与Lesquerella fendleri及 務蓝族间杂种的遗传研究，具体参见文献：http://www. cnki. net/KCMS/detail/detail. aspx ? dbcode = CDFD&dbname = cdfd0911&filename = 2008203617. nh&ur lid = &yx = &uid = ffEEvREcwSlJHSldTTGJhYlQlS2twUmkx0FhsbmlncTJZaGllandMVVVHblZ5Uy9jazRKUk V3Sff0rRfftzeXUzffFZDbz0 = $9A4hF_YAuvQ5obgVAqNKPCYcEjKensff4IQMovwHtwkF4VYPoHbKx Jw !! &v = MDA5MDBWMTI3RnJHNEhkZk5xSkViUElS0GVYMUxleFlTN0RoMVQzcVRyV00xRnJDVV JMK2ZZ T2RzRnkvbVc3L0E =)。本发明利用甘蓝型油菜（B. napus，2n = 38，AACC)和務蓝 的非对称融合杂种（2n = 52,AACCII)与甘蓝型油菜连续多代回交，获得因雄蕊心皮化而雄 性不育的材料。同时，我们在回交后代中通过形态观察、细胞学和分子生物学鉴定获得了全 套甘蓝型油菜-菘蓝单体附加系；7个附加系中仅有附加系Me雄蕊发育正常，推测菘蓝染 色体e携带不育胞质的恢复基因，可转移到甘蓝型油菜中培育恢复系（Kang等，2014)。目 前，已在附加系Me自交后代中选可育株进行小孢子培养获得育性恢复的双单倍体植株，进 一步鉴定优良恢复系来完成三系配套，应用到油菜育种中。
[0005] 迄今为止尚未见到有关甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系CMS选育成功的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种甘蓝型油菜新型细胞质雄性不育系的选育方法，克服 甘蓝型油菜现有细胞质雄性不育系的温敏特性，育成不育彻底、稳定遗传的甘蓝型油菜菘 油细胞质雄性不育系，为油菜杂种优势利用提供新的不育胞质。
[0007] 本发明通过以下方案实现：
[0008] -种甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的选育方法，包括以甘蓝型油菜和菘蓝的 叶肉原生质体为材料，通过原生质体融合方法得到甘蓝型油菜-菘蓝的体细胞杂种；以所 得的甘蓝型油菜-菘蓝的体细胞杂种为母本，以甘蓝型油菜为父本进行连续五代回交和选 择，获得甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系（雄蕊心皮化导致的细胞质雄性不育）；选育方 法包括下列步骤：
[0009] (1)甘蓝型油菜-菘蓝的叶肉原生质体融合与体细胞杂种的获得：分离和提取甘 蓝型油菜-菘蓝的叶肉原生质体，用3mM的碘乙酸处理甘蓝型油菜原生质体15分钟，用紫 外光辐照菘蓝原生质体20秒，采用PEG-高Ca2+、高pH融合法进行原生质体融合；将融合后 的原生质体用固、液双层培养，待形成小愈伤组织后，转移到增殖培养基Pell C上进行光照 培养；培养7-10天后，挑选颜色鲜艳、大小合适的愈伤组织转入分化培养基Pell E中进行 分化培养，待小芽长出后，切下小芽转入附加〇. lmg/L萘乙酸的MS培养基上形成完整的再 生植株；进而得到甘蓝型油菜-菘蓝的原生质体融合的体细胞杂种；
[0010] ⑵细胞质雄性不育系的选育：以鉴定过的甘蓝型油菜-菘蓝的体细胞杂种的真 杂种与甘蓝型油菜华双3号进行杂交获得回交一代即BC1，观察所得的回交一代植株的雄 蕊和花粉特征，选择出4个长雄蕊两两融合为一个，2个短雄蕊上没有花药，有微粉，花粉可 染性差即〈10%的BC1再与甘蓝型油菜华双3号进行回交，从后代植株中选择雄蕊发育异 常、雄蕊转变为心皮结构的不育株为育种材料，将所得的不育株与甘蓝型油菜华双3号进 行回交，每代继续选择出不育株继续与甘蓝型油菜华双3号进行回交，经过5代连续回交获 得稳定的体细胞染色体数为2n = 38的不育系；
[0011] (3)细胞质雄性不育系重组胞质的鉴定：提取上步所得的不育系、甘蓝型油 菜-菘蓝的体细胞杂种和甘蓝型油菜华双3号的线粒体总DNA，以已测序的登录号为 GenBank:AP006444的甘蓝型油菜Westar线粒体基因组序列作参考，设计扩增线粒体基因 的引物，进行PCR扩增，PCR产物回收后连接到pMD18-T载体并转化大肠杆菌，挑选阳性克 隆测序，确认所得的不育系的线粒体基因大部分来自菘蓝，在cox2-2处与甘蓝型油菜华双 3号发生了重组，重组的胞质与核基因组不协调导致不育；叶绿体基因引物TrnD-TrnT证实 不育系中叶绿体来自甘蓝型油菜，申请人将该不育系命名为甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不 育系CMS，Brassica napus L. CMS，于2015年7月3日送交中国.武汉.武汉大学中国典 型培养物保藏中心（CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC N0:P201511。
[0012] 其中扩增线粒体基因的引物序列如下所示（对应序列表的序列编号是1-42)
[0015] 上述的甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的四强雄蕊转变为心皮化结构，其顶端 类似柱头、下部附着胚珠，两个短雄蕊仅有花丝，不形成花药，其不育系不育彻底，满足杂交 和自由授粉以及结实良好。
[0016] 申请人将上述不育系命名为甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系CMS，Brassica napus L. CMS，于2015年7月3日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)保藏，保藏号为 CCTCC N0:P201511。
[0017] 本发明的方法可以在培育甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系中应用。
[0018] 与现有技术相比本发明具有以下突出优点：