[0019] (1)本发明的甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的雄蕊转变为心皮化结构，不育 彻底，不育性状稳定遗传，在湖北省武汉市、甘肃省和政县和青海省西宁市各地种植，其不 育性状表现稳定。
[0020] (2)本发明的甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的不育胞质由菘蓝和甘蓝型油菜 重组而来，不同于P〇l CMS和ogu CMS，是新型不育胞质，拓展了油菜不育胞质资源。
[0021] (3)本发明的甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系核基因组来自油菜双低品种华双 3号，农艺性状优良，杂交和开放授粉结实良好，有利于繁殖不育系种子和生产杂交种。
【附图说明】
[0022] 图1 :甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的选育。
[0023] 图2 :甘蓝型油菜和菘蓝体细胞杂种与甘蓝型油菜回交一代的花。
[0024] 图3 :甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的染色体数为2η = 38。
[0025] 图4 :甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系和保持系华双3号的花。附图标记说明： 图4中的a图是甘蓝型油菜华双3号的完整花；图4中的b图是甘蓝型油菜华双3号除去 花萼和花瓣的花；图4中的C图是本发明的甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的完整花； 图4中的D图是本发明的甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的除去花萼和花瓣的花。标尺： a_d，lcm〇
[0026] 图5 :甘蓝型油菜保持系华双3号和甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的花蕾横 切图。附图标记说明：图5中的a图是保持系华双3号花蕾横切图；图5中的b图是本发明 的甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的花蕾横切图。
[0027] 图6 :叶绿体基因引物TrnD-TrnT证实本发明的甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育 系的叶绿体来自华双3号。附图标记说明：泳道M-是DNA Marker DL2000，1-是甘蓝型油 菜华双3号，2-是菘蓝，3-是甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系。
[0028] 图7 :本发明的甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系在分子水平上与ogu CMS的鉴 定。附图标记说明：〇gu CMS不育基因 orfl38引物仅在ogu CMS扩增出一条特异带，而甘 蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系中无扩增产物。泳道:M是DNA Marker DL2000，1-是甘蓝 型油菜华双3号，2-是菘蓝，3-是甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系，4-是ogu CMS，5-是 pol CMS〇
[0029] 图8 :本发明的甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系在分子水平上与pol CMS的鉴 定。附图标记说明：Pol CMS不育基因 orf224引物仅在pol CMS扩增出一条特异带，而甘 蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系中无扩增产物。泳道：M-是DNA Marker DL2000，1-是甘 蓝型油菜华双3号，2-是菘蓝，3-是甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系，4-是ogu CMS，5是 pol CMS〇
【具体实施方式】
[0030] 实施例1利用原生质体融合获得甘蓝型油菜和菘蓝体细胞杂种
[0031] 本发明所用甘蓝型油菜华双3号和菘蓝种子由华中农业大学油菜研究室提供。 华双3号系华中农业大学选育的双低油菜品种（吴江生等，甘蓝型双低油菜品种华双3 号的选育和研究.华中农业大学学报，1999,18(1) :1-4.)。甘蓝型油菜和菘蓝体细胞杂 种及其杂种鉴定方法参考杜雪竹（杜雪竹.甘蓝型油菜与Lesquerella fendleri及務 蓝族间杂种的遗传研究.[博士学位论文].武汉：华中农业大学图书馆，2008,具体参见 文献：http: //www. cnki. πθ?/KCMSZdetail/detail, sspx ? dbcode - CDFD&dbn&nie - cdfd0911&filename = 2008203617. nh&ur lid = &yx = &uid = WEEvREcwSlJHSldTTGJ hYlQlS2twUmkx0FhsbmlncTJZaGllandMVVVHblZ5Uy9jazRKUk V3Sff0rRfftzeXUzffFZDbz0 = $9A4hF_YAuvQ5obgVAqNKPCYcEjKensff4IQMovwHtwkF4VYPoHbKxJw !! &v = MDA5MDBWMTI3 RnJHNEhkZk5xSkViUElS0GVYMUxleFlTN0RoMVQzcVRyV00xRnJDVVJMK2ZZ T2RzRnkvbVc3L0E =))报道的方法，本发明给出了其最优体系。
[0032] 原生质体的分离和纯化
[0033] 参考现有文献报道原生质体的融合方法（例如：杜雪竹.甘蓝型油菜与 Lesquerella fendleri及務蓝族间杂种的遗传研究.[博士学位论文].武汉：华中农业大 学图书馆，2008和中国知网）。
[0034] 以上述文献为基础，对其中的相关技术细节作下述补充：
[0035] (1)原生质体的制备
[0036] 取甘蓝型油菜（品种为华双3号）和菘蓝的种子先用70%酒精表面消毒1分钟，然 后用0. 1%取(：12溶液灭菌15分钟，最后用无菌水冲洗3次，接种到MS培养基（Murashige 和Skoog，1962)。经过约30天培养得到无菌的实生苗，取嫩叶用于原生质体的分离。
[0037] 用于原生质体分离和培养的相关溶液为：酶解液（0. 5%纤维素酶、0. 3%离析酶、 0. 2M甘露醇和80mM氯化钙，pH5. 6)和用于质壁分离的SCM溶液（0. 5M山梨醇、10mM氯化 钙和5mM MES，pH5. 8,），使用时以体积比3:7混匀。嫩叶在酶溶液中用消毒好的锋利刀片 划成网状，25°C下在摇床上摇16小时。充分酶解的组织在分离操作前用手轻轻摇动使原生 质体完全释放，经200目和400目不锈钢滤网滤去渣质，加 W5培养基（154mM NaCl、125mM CaCl2、5mM KCl、5mM葡萄糖，ρΗ5· 8)混勾，收集滤液至10ml离心管中，600r/min离心5分钟， 弃上清液，加入2ml W5培养基重新悬浮原生质体，用胶头滴管吸出，沿管壁轻轻地铺在5ml 含 0· 5M 鹿糖和 ImM 的 2-(N-吗啉乙横酸）【简称：MES，2-(N-morpholino) ethanesulphonic acid】的溶液液面上，600r/min离心10分钟，小心收集两液面间的原生质体至10ml离心管 中，再加入W5溶液离心（600r/min) 5分钟。
[0038] (2)原生质体融合
[0039] 融合前，甘蓝型油菜原生质体用3mM碘乙酸处理15分钟。菘蓝原生质体通过紫外 光照射20秒，紫外线来源为超净工作台SW-CT-1D的紫外灯，盛原生质体的培养皿与光源的 距离为l〇cm。将处理过的甘蓝型油菜和菘蓝原生质体分别调至2 X 106个/ml后，等体积混 匀。原生质体融合采用PEG-高Ca2+、高pH融合法（Hu等，2002)，将PEG融合液（15% PEG、 10%DMS0、60mM CaCl2、25mM甘露醇、25mM甘氨酸）以4X2滴成对滴入6cm培养皿中，然后 用胶头滴管将两亲本原生质体混合液滴2-3滴到成对的融合液中间，边缘再各加1滴融合 液，暗培养 10 分钟。用 W5+MES 溶液（154mM NaCl、125mM CaC12、5mM KCl、5mM 葡萄糖、50mM MES，pH5. 8)将上述培养皿中的原生质体融合液逐步稀释，用量分别为0. 125ml、0. 25ml、 0. 375ml、0. 5ml、1. 0ml，稀释间隔为1分钟，最后在超净工作台上暗培养1. 5小时。
[0040] (3)原生质体融合细胞的培养和植株再生
[0041] 向装有原生质体融合团的培养皿中滴加 W5+MES溶液收集原生质体，600r/min离 心5min，然后用PellB液体培养基（Pell B、Pell C和Pell E配方参考Pelletier等，1983 报道的培养基配方，适当调整了激素比例，见后）调整原生质体密度为5~10X104个/ml。 原生质体培养采用固、液双层培养：取1. 5ml细胞悬液到直径为4cm、铺满Pell B固体培 养基（Pell B 培养基附加 l.Omg/L 6-BA、1.0mg/L NAA 和 0.25mg/L 2,4-D)的培养皿中， 25°