与结球甘蓝耐抽薹基因相连锁的分子标记及其获得方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其设及一种与结球甘蓝度rassicaoleracea L.var.capitataL.)耐抽臺基因连锁的分子标记B0ISSROO207及其获得方法。
【背景技术】
[0002] 甘蓝为芸臺属"UΞ角"作物含CC二倍体基因组的基本种，包括结球甘蓝、花挪菜、 青花菜、抱子甘蓝、羽衣甘蓝、球茎甘蓝、皱叶甘蓝和芥蓝等8个栽培变种。各变种间天然 杂交率很高。甘蓝类蔬菜目前在世界各地广泛栽培，W结球甘蓝栽培面积最大，结球甘蓝、 花挪菜、青花菜和球茎甘蓝在中国普遍栽培，芥蓝主要在我国华南地区等地栽培。据报道， 2013年我国结球甘蓝年种植面积大约为90万hm2;青花菜种植面积约8万hm2;花挪菜种植 面积45万hm2。
[0003] 结球甘蓝是我国重要的蔬菜作物之一，在各地普遍栽培，现已实现周年生产与周 年供应。据统计，其栽培面积约占我国蔬菜播种面积的10%W上，在我国城乡蔬菜供应中具 有举足轻重的地位。在春甘蓝栽培中，往往因气候及栽培管理不当等原因造成春甘蓝发生 先期抽臺现象，从而严重影响结球甘蓝的品质和产量，给生产带来巨大损失。因此，为有效 减少运些损失，需要在理论上加强结球甘蓝耐抽臺性分子遗传机制的研究，同时，在生产上 培育具有耐抽臺性的甘蓝品种。
[0004] 为解决上述影响我国十字花科作物可持续发展的重大问题，挖掘新的耐抽臺种质 资源，W往育种家们大多借助形态学标记和生化标记来辅助育种，经筛选已获得一些优良 的耐抽臺自交系，但在耐抽臺性转育过程中应用传统的方法筛选耐抽臺植株时存在选育时 间较长、操作程序繁琐等缺点；另一方面耐抽臺性的表现易受环境条件的影响，难W适应育 种实践的需要。近年来，随着分子生物学的发展，利用分子标记辅助技术开展十字花科蔬菜 耐抽臺性育种显出巨大的潜力。一类基于DNA变异的分子标记技术已经被国内外许多学 者应用于十字花科蔬菜抗逆及抗病研究。应用分子标记技术，不但可W免除传统育种中繁 重的选择过程，W及跟踪、检测外源基因，还能把多个抗病及抗逆基因聚合到同一优良品种 中，使其获得持久、广泛的抗性。
[0005] 提高耐抽臺性是当前结球甘蓝乃至整个十字花科蔬菜重要的育种目标之一。同 时，通过杂交与回交技术，可W将结球甘蓝中的耐抽臺基因转移到同为甘蓝种的青花菜、花 挪菜、抱子甘蓝、球茎甘蓝和芥蓝等变种中，从而为耐抽臺的甘蓝类蔬菜新品种选育提供基 因资源。因此，获得与耐抽臺基因紧密连锁的分子标记不仅可应用到分子辅助育种中，提高 甘蓝种作物耐抽臺育种效率，在品种选育上有重要的应用价值，还可W为进一步图位克隆 耐抽臺基因并分析其生物学功能奠定研究基础。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于针对现有在育种实践中可用的耐抽臺分子标记不足，提供一种 与结球甘蓝耐抽臺基因连锁的分子标记BO1SSR00207及其获得方法。
[0007] 本发明的目的是通过W下技术方案实现的：一种与结球甘蓝耐抽臺基因相连锁的 分子标记，其上游引物为SEQIDNO. 1，下游引物为SEQIDNO. 2。
[0008] -种与结球甘蓝耐抽臺基因相连锁的分子标记的获得方法，包括W下步骤：
[0009] (1)利用经过多代自交选育出的耐抽臺材料叩9805'和易抽臺材料'Y5-3-14'，将 耐抽臺亲本和易抽臺亲本进行杂交得到Fi群体，F1自交后获得F2群体；
[0010] 似针对F2群体，采用改良的BSA法分别构建耐抽臺基因池和易抽臺基因池；
[0011] (3)利用SSR分子标记技术，对易抽臺基因池和耐抽臺基因池进行与结球甘 蓝耐抽臺性分子标记的筛选；筛选出与目标性状（耐抽臺性）存在连锁关系分子标记 BO1SSR00207,经单株验证分析，该分子标记BO1SSR00207与结球甘蓝耐抽臺基因的遗传距 离为 10. 69cM。
[0012] 进一步地，所述步骤2具体为：
[0013](2. 1)通过冬性鉴定确定F2群体中每一个单株的耐抽臺性，W抽臺情况将F2代群 体单株分为1级~9级。其中，1级为：短缩茎伸长（< 1cm) ;9级为：花臺大于20cm;
[0014] (2. 2)取F2代群体中的1级单株15株，采用CTAB法提取基因组DM,混样后构建 F2代易抽臺基因池；取9级单株15株，采用CTAB法提取基因组DNA，混样后构建F2代耐抽 臺基因池。
[0015] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0016] 先期抽臺严重影响结球甘蓝乃至十字花科蔬菜的品质与产量，给生产带来巨大的 损失。本发明利用SSR分子标记方法，结合改良的BSA法得到一个与结球甘蓝耐抽臺基因 连锁的SSR分子标记，可直接用于甘蓝类蔬菜的耐抽臺性分子标记的辅助选择育种。利用 该分子标记，不仅克服了常规育种方法所需时间周期长等缺点，还可W有目的地聚合多个 抗性基因，培育出具有稳定的多抗性的甘蓝类蔬菜新品种。同时也可利用运个新的与耐抽 臺基因连锁的分子标记克隆结球甘蓝耐抽臺基因，并对其进行结构和功能分析，运对于进 一步了解结球甘蓝耐抽臺的分子遗传机理有积极意义。因此，本发明在甘蓝类蔬菜育种实 践及耐抽臺理论研究上均具有重要意义。
【附图说明】
[0017] 图1为双亲及Fi代田间植株。其中，A:母本，B:Fi代，C:父本。
[0018] 图2为BO1SSR00207引物对耐/易抽臺基因池的扩增结果。1~3:耐抽臺基因 池；4~6 :易抽臺基因池。Μ为lOObpDNAmarker。
[0019] 图3为B0ISSROO207引物对两个亲本的验证结果。Pi为父本，P2为母本，Μ为10化p DNAm曰rker〇
[0020] 图4为B0ISSROO207引物的F2代单株验证结果。Μ为lOObpDNAmarker。
【具体实施方式】
[0021] 本发明与结球甘蓝耐抽臺分子标记BO1SSR00207的获得方法主要包括W下步骤：
[0022] 1.利用经多代自交选育出的耐抽臺材料'Y9805'和易抽臺材料'Y5-3-14'，将所 述耐/易抽臺亲本杂交得到Fi群体，F1自交获得F2群体。
[0023] 2.应用SSR分子标记技术，运用改良BSA法进行与结球甘蓝耐抽臺性分子标记的 筛选。
[0024] (1)叶片总DM的提取：
[00巧]具体做法为：通过冬性鉴定确定每一个单株的耐抽臺性，W抽臺情况将F2代群体 单株分为1级~9级分别取样。其具体标准为：1级：短缩茎伸长（< 1cm) ;3级：短缩茎伸 长明显（1~2cm)，无花臺；5级：短缩茎伸长，有花臺（< 5cm) ;7级：节间伸长，花臺大于 5cm;9级：节间伸长，花臺高度大于20畑1。采用CTAB法提取基因组DNA。同时还提取了亲 本Pi和P2的基因组DM。
[0026] 似耐/易抽臺结球甘蓝基因池的构建
[0027] 具体做法为：本发明采用改良的BSA法分别构建耐抽臺基因池和易抽臺基因池。 从F2代群体中1级单株和9级单株各取15株基因组DNA分别进行混样，构建F2代易抽臺 基因池及F2代耐抽臺基因池。
[0028] (3)与结球甘蓝耐抽臺基因连锁的SSR标记的筛选
[002引利用336对SSR引物（序列见表1)对2个基因池化代耐抽臺池和F 2代易抽臺 池）进行PCR扩增，每一PCR重复一次。PCR检测的反应体系（20μ? :75ng基因组DNA模 板，0. 5U Taq DNA聚合酶（FermentasTM)、0. 4μL (10μmol·L1)dNTPs、1μL (10μmol·L1) 上下游引物、2μΙ lOXPCR Buffer(200mmol.LiTris pH 8.0,200mmol.LiKCl， lOOmmol .L i(NH4)2S04和20mmol .L iM拆04)，加(1地20至20yL。PCR检测的扩增程序：94°C 预变性3min，进入35个循环（94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s)，最后再72°C延 伸7min。PCR反应过程在BIO-RAD S1000 ? Thermal切cler仪器上进行，样品在4°C条件 下保存。
[0030] 表1用于筛选SSR标记的引物序列
[0031]
[0032]
[0040]PCR产物用12%质量百分数的聚丙締酷胺凝胶电泳检测。PAGE电泳及染色所用试 剂和仪器如下：
[00川（3.1)0.3g/血的丙締酷胺混合液（100血）（即30%质量百分比的胶原液），配制方 法为：29g丙締酷胺（Ac巧lamide)，Ig N, Ν'-甲双丙締酷胺（Bisac巧lamide)，加d地20至 100mL，37°C揽拌溶解，4°C避光保存。
[004引 （3.。0.Ig/mL的过硫酸胺（10血），配制方法为：Ig过硫酸胺（Ammonium persulfate,AP巧溶于10血d地20中，4°C保存。
[0043] (3. 3)5ΧΤ邸缓冲液（pH8. 3,500血），配制方法为：27gTris碱，13. 75g棚酸， 1. 86g胞2邸ΤΑ· &0,加d地2〇定容到500血，4°C保存。
[0044] (3. 4)TEMED(N，，N，，N，，N，-四甲基乙二胺）。
[0045] (3. 5)上样缓冲液：其中含有0. 25%漠酪蓝（W/V)，40%薦糖水溶液（W/V)，4°C胆 存。
[004引（3. 6)封底胶：1 %琼脂糖溶液，用1XT邸配置。
[0047] (3. 7)染色液：无水乙醇50ml，硝酸银0. 5g，溶于dd&0并定容至500ml。胆存于 栋色瓶中，室溫保存。
[0048] (3. 8)显色液：氨氧化钢lOg，溶于dd&0并定容至500ml，室溫保存。实验室再加 入2ml质量百分数为37%的甲醒。
[0049](3. 9)仪器：DYY-6C型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂），DYCZ-30C型双夹板垂 直电泳槽（北京六一仪器厂），Tanon2500全自动数码凝胶图像分析系统等。
[0050]PAGE电泳的主要步骤：
[0051] 1)将准备灌胶的玻璃板，梳子，胶套，电泳槽等，用去污剂洗涂自来水冲洗，惊干， 酒精擦拭。
[0052] 2)将两块玻璃板插入橡胶套后，放入电泳槽中，使较低的玻璃板朝向负极（黑色 电极）。保持电泳槽水平，梓紧电泳槽上的螺杆使玻璃板和橡胶套稳固且密封。
[0053] 3)在微波炉中将封底胶煮沸，将玻璃板和橡胶套Ξ面的外侧接缝封好